專利名稱：檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物miR-22及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和醫學領域，具體而言涉及一種卵巢癌腫瘤的生物標記物——血清micix)RNA-22 (miR-22)，及其篩選方法和在輔助個體卵巢腫瘤篩查與臨床診斷及病情發展中的應用。
背景技術：
卵巢癌(ovarian carcinoma)是女性生埴器官常見的腫瘤之一,大多數是由于卵巢上皮細胞和包涵囊腫組織上皮細胞在多種致癌因子作用下，發生了基因突變，致使細胞增生失控。卵巢癌是死亡率極高的婦科惡性腫瘤，其組織學形態多種多祥，是ー類高度異質性的腫瘤，具有發病率高、但病程進展緩慢、早期癥狀不易察覺；且侵襲轉移能力較強、自然生存期長等特點。在臨床檢查中，多采用CA-125水平檢測、超聲檢查、以及聯合CA-125動 態監測和盆腔超聲檢查及彩色多普勒血流顯像等檢測方法盡可能的提高卵巢檢出率。但目前80%的卵巣癌病人發現時已是中晩期(II -IV)，采取腫瘤細胞減滅術以及化療患者的5年存活率僅為20%左右，且治療比較復雜，預后效果比較差。雖然早期診斷及輔助化療和激素治療使得卵巣癌的死亡率有所降低，但在導致女性死亡的惡性腫瘤中卵巢癌仍居世界前列。MicroRNA(miRNA)是ー類生物體內自然形成的小分子非編碼RNA，在組織和時間上具有特異性，參與調節其特異靶基因的表達，從而控制蛋白的產生，具有調節發育時序，細胞増殖，分化，代謝，凋亡與應激以及參與脊椎動物心臟、肌肉以及神經系統的形成，同時調控腫瘤發生的功能。約50%的已知人類miRA基因定位于和腫瘤相關的染色體區域，而不斷累積的研究成果也已充分證實在腫瘤發生與發展過程中呈現出不同的表達水平，具有篩查和診斷卵巣腫瘤并對治療方案的選擇和預后分析具有潛在的指示作用。高通量測序是基于傳統的Sanger測序的基礎上發展而來的分子生物學的分析方法之ー是，雖然此技術建立時間不長，但其發展速度相當快。該技術能夠對數百萬個分子進行同時測序。這使得對ー個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能。高通量測序的具有傳統測序法達不到的優點，首先，它是利用芯片技術進行測序，可以在數百萬個點上同時閱讀測序，把利用平行處理的方略讀取結果，通量較高；其次，高通量測序具有精確地樣本定量功能，其原理為樣本的DNA或者RNA被測序的次數反應了在樣品中的豐度；同時高通量測序的成本相對較為低廉。對于miRNA序列較短、同源性高，利用芯片檢測非常困難。而利用高通量技術不僅能夠解決此問題，而且能夠發現新的miRNA。利用此技術對卵巢腫瘤患者血清與健康血清樣本分別進行測序，并對比其序列組成以及表達譜特征，對于發現生物標記物用于卵巢疾病的早期診斷有重要的意義。生物標記物是指能將機體的生理和病理狀態區分開來的生物分子。篩選到可用于腫瘤早期發現、早期診斷的生物標記物可大大提高腫瘤患者的臨床治療效果。最新數據顯示腫瘤組織普遍具有特征性的miRNA表達譜，即指腫瘤細胞某幾種miRNA的表達水平常與同一組織中的正常細胞存在顯著差異，而特征性的miRNA異常表達可望成為用于腫瘤的診斷、病理分級、臨床分期、療效與預后的生物標記物，顯示了良好的臨床應用前景。近年來研究人員發現在血漿和血清中也存在獨立于細胞之外并且即使在嚴酷環境下也能明顯保持穩定的miRNA分子，而作為生物檢測樣本，血清具有取材方便、無創傷性、并可連續的體外檢測的優點，使得基于miRNA定性和定量檢測技術尋找癌癥特異性的血清miRNA作為分子標記的方法比傳統的蛋白分子標記方法將更加有效，進而可以克服分子標記在抗體制備和定量分析上發展所遇到的瓶頸。因此，開發一種可輔助卵巢癌篩查和診斷的血清miRNA作為生物標記物，具有廣泛的科研價值和臨床應用前景。目前已有實驗證實，microRNA在血液中被有效地保護，使其免受在血液中大量存在的RNase的降解,表現出高度的穩定性。對于血液microRNA能否作為一種無創性檢測手段，目前的研究主要集中在癌癥的早期診斷方面。然而，目前還沒有將血清/血漿microRNA應用于卵巢疾病的輔助判斷、危險度評價等方面的報道，若能篩選與卵巢組織病理狀態有關的特異或異常表達的血清/血漿microRNA作為疾病檢測的生物標志物，并研制相應的檢測試劑盒，將會大大提升卵巢腫瘤疾病的檢測水平。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種具有較高靶向性、穩定性及高效率檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物及其用途。為了解決上述技術問題，本發明提供一種檢測卵巢腫瘤的血清學的生物標記物microRNA-22 (miR-22)，其 miRNA 序列為miR-22 aagcugccaguugaagaacugu ；本發明還同時提供了上述血清學生物標記物的用途制備用于篩查卵巢腫瘤或輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷的試劑盒。作為本發明的血清學生物標記物的用途的改進試劑盒包括反轉錄系統和引物系統/引物探針系統(即，引物系統、引物探針系統任選其一)；反轉錄系統包括反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑；引物系統由miR-22的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物以及miR_16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物組成；引物探針系統由miR-22的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物和探針以及miR-16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物和探針組成。作為本發明的血清學生物標記物的用途的進一步改進試劑盒還包括擴增系統；擴增系統包括含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液。備注說明該擴增系統僅在引物探針系統中被用到。作為本發明的血清學生物標記物的用途的進一步改進檢測該標志物(標記物)的技術為基于莖環的反轉錄-熒光定量PCR技術。作為本發明的血清學生物標記物的用途的進一步改進莖環是指反轉錄過程中使用的莖環結構反轉錄引物，其由以下核苷酸序列組成miR-22 GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT ；作為本發明的血清學生物標記物的用途的進一步改進熒光定量PCR技術為DNA染料法或TaqMan探針法。
作為本發明的血清學生物標記物的用途的進ー步改進基于DNA染料法的熒光定量PCR檢測方法，其中所使用的miR-22cDNA擴增引物為PCR正向引物miR-22 CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA ；PCR反向引物miR-22 :CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。作為本發明的血清學生物標記物的用途的進ー步改進:miR-22的探針由以下核苷酸序列組成(6-FAM)TTCAGTTGAGTCAACATC(MGB)。備注說明以上括號內的內容代表探針合成方式。作為本發明的血清學生物標記物的用途的進ー步改進在熒光定量PCR檢測方法中，使用保守性miRNA(miR-16)作為內參照基因，莖環結構反轉錄引物、擴增引物和探針為序列uauugcacuugucccggccugu ；莖環引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA； PCR 正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA ；PCR 反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG ；探針(6-FAM)TTCAGTTGAGCGCCAATA (MGB)。本發明的標志物可単獨用于卵巢腫瘤的篩查，也可輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷。本發明對卵巢癌血清及正常血清進行solexa/illumina高通量測序，根據其表達譜特征進行篩選和鑒定；從而獲得本發明所述的血清學生物標記物miR-22。本發明所述的miRNA能在血清中穩定存在，該miRNA在卵巢正常血清，卵巢良性病變患者血清和卵巣惡性腫瘤患者血清中表達具有差異性，因此，能用于卵巢腫瘤篩查及輔助卵巢腫瘤病理鑒定及臨床診斷。本發明主要是以miRNA為中心，基于實時熒光定量PCR技術檢測和分析血清miRNA的差異性表達，主要通過以下步驟實現(a)制備卵巢腫瘤血清樣本；(b)酸性酚/氯仿法抽提血清總RNA ；(c)反轉錄反應合成cDNA ；(d)實時熒光定量PCR檢測miRNA在不同樣本中的表達變化量。本發明是針對現有卵巣腫瘤標志物敏感性和特異性不能滿足臨床診斷的需要，在研究miRNA在卵巢腫瘤血清中的差異性表達及與臨床病理指數的相關性的基礎上所獲得的。本發明所述的腫瘤血清標志物為miR-22 ;其應用主要表現在目標miR-22在卵巣癌患者與正常人群血清中顯示出差異性表達,在良性腫瘤血清樣本和惡性腫瘤血清樣本中表達具有顯著性差異，可単獨用來對卵巢癌患者進行無創性篩查，用于輔助卵巢腫瘤病理鑒定及臨床診斷。本發明的用于篩查卵巢腫瘤患者和鑒定卵巢腫瘤病理特征的試劑盒，其由反轉錄系統，擴增系統和引物探針系統(或引物系統)組成，其中，反轉錄系統由反轉錄酶，反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑組成；擴增系統由含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液組成；引物探針系統由miR-16，miR-22的莖環結構反轉錄引物和PCR擴增引物及探針組成(引物系統由miR-16，miR-22的莖環結構反轉錄引物和PCR擴增引物組成)。本發明通過實驗得出以下結論，確定了 miR-22目標miRNA可單獨作為卵巢腫瘤篩查的血清學生物標記物，其組合可輔助卵巢腫瘤臨床病理鑒定及診斷。I. miRNA-22在血清中的特異性表達目標miRNA-22通過illumina/Solexa測序篩查，在測序報告中表達差異進行分析，采用Log2-ratio (normal/patient)方法獲得fold-change值即差異倍數值，其中fold-change < -I或fold-change > I表不表達具有顯著差異；miRNA_22的fold-change=-1. 94342充分說明了目標miRNA在卵巢癌患者血清中呈現特異性表達。2. miRNA-22在良性腫瘤患者血清和正常血清中表達的差異性分析
本發明運用SPSS 17. O軟件中單樣本T檢驗和獨立樣本T檢驗，分析了目標miRNA在收集到的23例卵巢良性腫瘤患者的血清和8例正常血清樣本等中表達的差異性，結果表明目標miRNA在卵巢腫瘤血清和正常血清中的表達水平具有顯著的差異性(RQ=L 63，P=O. 047)。結果表明miRNA在血清中的表達水平可反映卵巢的病理特點，進而確定了 miRNA在血清學水平上可作為卵巢腫瘤的生物標記物來指示腫瘤的臨床病理情況。3. miRNA-22在卵巢惡性腫瘤血清與正常血清中表達的差異性分析目標miRNA在31例卵巢惡性腫瘤患者血清樣本及其8例正常血清樣本等對照中表達的差異性分析，表明miR-22 (RQ=2. 00，P=0. 001)，在卵巢癌血清中顯著表達，且已達到了極顯著水平。因此根據miRNA在卵巢血清中的表達情況可明顯區分癌血清和正常血清，也具有較好的參考價值。結果表明，miR-22在血清水平上來區分卵巢良、惡性病變腫瘤，進而無創傷性地篩查良性腫瘤患者以得到積極的早期診斷，進而積極采取適合的診療措施。因此在血清中檢測這些miRNA的表達變化量對卵巢腫瘤快速篩查，臨床診斷和治療具有重要作用，有望作為卵巢診斷和治療的生物標記物。4.在不同病理指標下，miRNA-22在卵巢腫瘤患者的血清和卵巢正常血清中表達的相關性分析。在不同年齡組、病理分期以及CA-125水平上對miR-22的表達相關性的分析(如圖2、圖3)可用于早期卵巢腫瘤的診斷。對低年齡組的24例樣本和高年齡組的29例樣本進行統計學分析，發現miR-22在低年齡組的相對表達量(RQ=2)中要比高年齡組的相對表達量(RQ=L 67)要高，但未達到顯著水平(P=0. 46)。對卵巢癌血清病理分期I和II (7例)，
III和IV (24例)樣本進行miR-22表達量的分析，miR-22在卵巢癌晚期(II^PIV)中表達比癌癥早中期(I和II )表達要高；在0么-125-/+水平上，miR-22在CA-125+( > 35 U/ml)的相對表達量(RQ=2. 85)要比CA-125-( ( 35U/ml)中的相對表達量(RQ=L 92)要高。這對于癌癥病人分期診斷有重要的指導意義。5.用Log2 scale法反映卵巢腫瘤血清中miRNA的變化Log2 scale是目標miRNA相對于內參基因而言產生的變化以對數反映出來的一種分析方法，用于揭示目標miRNA是否可作為區分患者和正常人血清的生物標記物。Log2scale法即Log2 (CtmiRNA/Ctmean (miR-16)},用于反映miRNA在卵巢腫瘤血清相對于正常血清中產生的差異變化。其中C miRNA代表熒光定量檢測到的目標miRNA在卵巢血清樣本中的Ct值，而Ctmean(miR-16)代表內參基因miR-16在卵巢血清樣本中的平均Ct值。用Log2 scale法分析可得miR-22在惡性(Ρ=(λ 001)和良性(Ρ=(λ 047)腫瘤血清相對于正常血清的表達均有顯著性差異，且在惡性腫瘤與正常血清中達到了極顯著水平。本發明人經過廣泛而深入的研究，首次鑒別和分離了與卵巢腫瘤相關的血清miRNA，在此基礎上完成了本發明；首次通過miRNA實時定量PCR技術在卵巢癌血清中對miR-22的表達水平進行檢測,進一步驗證這些血清miRNA與卵巢腫瘤各臨床病理指標的關聯性，所提供的試劑盒專門針對于血清miRNA的檢測優化，結果準確可靠。本發明的優點為⑴本發明確定的miRNA與卵巢腫瘤臨床病例指標的密切相關性，能夠作為生物標記物對卵巢腫瘤病人進行篩查和診斷，為臨床個體化干預治療提供有效依據。(2)由于血清具有取材方便，無創傷性，并可連續體外檢測的優點，因此從血清中尋找生物標記物可以將卵巢腫瘤的篩查和診斷提高至一個新的水平，進而提高治愈率和降低死亡率。(3)通過實時熒光定量PCR技術對卵巢腫瘤病人的血清水平miRNA的檢測，定量準確。相對于芯片技術或者分子雜交，該方法簡便快速且經濟實用。(4)可與其他分子指標相 結合，為卵巢腫瘤篩查，診斷，治療與預后提供新的綜合性試劑盒，方便臨床應用。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。圖I :miR-22在卵巢良性腫瘤、惡性腫瘤血清樣本中與正常血清相比表達差異倍數。左側代表惡性腫瘤血清與正常血清相比的平均差異倍數，右側代表良性腫瘤血清與正常血清相比的平均差異倍數。圖2 miR-22在卵巢良性腫瘤、惡性腫瘤以及正常對照的血清樣本中差異性表達的相關性。(相關性分析在p=0. 01水平上，SPSS17. O軟件，以及origin7. 5軟件)。左側代表惡性腫瘤血清樣本與正常對照血清樣本的表達差異相關性以及顯著性差異水平(P值)，右代表良性腫瘤血清樣本與正常對照血清樣本的表達差異相關性以及顯著性差異水平(P值)。圖3 :各病理指標上，miR-22在卵巢腫瘤患者的血清中的表達與病理指標的的相關性及差異性水平。其中年齡彡51/ < 51 :miRNA在卵巢腫瘤血清中的差異性表達與患病年齡的相關性分析；即miR-22在年齡小于51和年齡大于或等于51的卵巢腫瘤患者血清中的表達差異性分析。左代表miR-22在年齡組> 51卵巢腫瘤患者血清中的表達差異倍數，右代表年齡< 51卵巢腫瘤患者血清中的表達差異倍數。其中病理分期(Grade) I - II / III - IV :miRNA在卵巢腫瘤血清中的差異性表達與卵巢腫瘤病理分級的相關性分析，即miR-22在卵巢腫瘤血清在I和II與III和IV之間的表達差異相關性。左代表在卵巢腫瘤血清在I和II表達差異相關性，右代表在卵巢腫瘤血清在III和IV之間表達差異相關性。其中CA-125-/+ :miR_22在卵巢腫瘤血清中的差異性表達與CA-125水平的相關性分析，即miR-22在卵巢腫瘤血清CA-125-(彡35U/ml)和CA_125+( > 35U/ml)上表達差異相關性。左代表miR-22在卵巢腫瘤血清CA-125-( ( 35U/ml)，右代表miR-22在卵巢腫瘤血清 CA-125+( > 35U/ml)。
具體實施例方式本發明所提供的血清miRNA標記物在制備檢測卵巢腫瘤的臨床診斷試劑盒中應用的具體方法如下一、實驗樣本本發明所使用的腫瘤血清樣本來自2007年11月 2008年12月間在浙江省腫瘤醫院接受治療的卵巢腫瘤患者的全血。入住患者要求有明確的細胞學診斷，手術前未經任何放療、化療及內分泌治療，手術后有完整的臨床及病理資料。本發明所采用的正常血清對照樣本來自健康志愿者。入組志愿者均經問卷調查和嚴格體檢無卵巢腫瘤及其相關婦科腫瘤家族病理史且無卵巢腫瘤患病風險。 根據國際婦產科聯盟(FIGO)臨床分期、分化程度、CA-125水平對卵巢惡性腫瘤與良性腫瘤患者的樣本信息分類匯總如表I所示。腫瘤患者年齡21-76歲，中位年齡為51歲，小于51歲的患者24例，大于和等于51歲的患者29例，年齡不清的I例。在31例惡性腫瘤病例中卵巢漿液性腺癌為17例，卵巢漿液性乳頭狀腺癌為8例，卵巢黏液性腺癌為4例，卵巢子宮內膜樣腺癌為2例；病理分級I級者3例，病理分級II級者4例，III級者20例，病理IV級患者4例；低分化為9例，中低分化為10例，中分化I例，高分化為I例，分化程度不明者為10例；在CA-125水平上，低于35U/ml為2例，高于35U/ml為29例。在23例良性腫瘤患者中，漿液性腫瘤為5例，黏液性為4例，子宮內膜樣腫瘤為10例，卵巢冠囊腫為2例，卵巢卵泡細胞瘤為I例，卵巢乳頭性腫瘤為I例。在CA-125水平上，低于35U/ml為11例，高于35U/ml為12例。表I卵巢腫瘤病人的臨床病理信息
權利要求
1.一種檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物miR-22，其特征是miRNA序列為 miR-22 :aagcugccaguugaagaacugu。
2.如權利要求I所述的檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物miR-22的用途，其特征是制備用于篩查卵巢腫瘤或輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷的試劑盒。
3.根據權利要求2所述的檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物的用途，其特征是所述試劑盒包括反轉錄系統和引物系統/引物探針系統； 所述反轉錄系統包括反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑； 所述引物系統由miR-22的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物以及miR-16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物組成； 所述引物探針系統由miR-22的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物和探針以及miR-16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物和探針組成。
4.根據權利要求3所述的檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物的用途，其特征是所述試劑盒還包括擴增系統；所述擴增系統包括含Taq酶的miRNA表達定量檢測混合液。
5.根據權利要求3或4所述的檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物的用途，其特征是檢測該標志物的技術為基于莖環的反轉錄-熒光定量PCR技術。
6.根據權利要求5所述的檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物的用途，其特征是miR-22的莖環結構反轉錄引物由以下核苷酸序列組成GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGTT。
7.根據權利要求6所述的檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物的用途，其特征是所述熒光定量PCR為DNA染料法或TaqMan探針法。
8.根據權利要求7所述的檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物的用途，其特征是miR-22的cDNA擴增引物為 miR-22 PCR 正向引物CGGAAGCTGCCAGTTGAAGA ； miR-22 PCR 反向引物CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT。
9.根據權利要求8所述的檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物的用途，其特征是miR-22的探針由以下核苷酸序列組成(6-FAM)TTCAGTTGAGTCAACATC(MGB)。
10.根據權利要求9所述的血清學生物標記物的用途，其特征在于在熒光定量PCR檢測方法中，使用保守性miRNA的miR-16作為內參照基因，其莖環結構反轉錄引物、擴增引物和探針為序列uauugcacuugucccggccugu ； 莖環引物CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCGCCAATA ； PCR 正向引物ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATA ； PCR 反向引物TGGTGTCGTGGAGTCG ；探針(6-FAM) TTCAGTTGAGCGCCAATA (MGB)。
全文摘要
本發明公開了一種檢測卵巢腫瘤的血清學生物標記物miR-22，該miRNA序列為miR-22aagcugccaguugaagaacugu。本發明還同時公開了miR-22的用途制備用于篩查卵巢腫瘤或輔助卵巢腫瘤病理鑒定和臨床診斷的試劑盒。試劑盒包括反轉錄系統和引物系統/引物探針系統；反轉錄系統包括反轉錄酶、反轉錄體系緩沖液和RNA酶抑制劑；引物系統由miR-22的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物以及miR-16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物組成；引物探針系統由miR-22的莖環結構反轉錄引物、cDNA擴增引物和探針以及miR-16的莖環結構反轉錄引物、擴增引物和探針組成。
文檔編號C12Q1/68GK102864237SQ20121037989
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月9日 優先權日2012年10月9日
發明者丁先鋒, 紀婷, 唐文杲, 蔣理想, 李彩霞 申請人:浙江理工大學