專利名稱：一種快速準確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧的方法
技術領域：
本發明涉及一種用分子生物學的技術(SRAP)鑒定雜交魚種的方法，更具體的說，本發明涉及一種快速準確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( )]的方法。
背景技術：
烏體(Channaargus)和斑體(Channa maculate)同屬于S盧形目(Perciformes)體科(Channidae)鱧屬。通過斑鱧和烏鱧雜交所獲得的雜交鱧系的子一代，具有生長快、產量高、病害少、安全質量高等優勢，人工養殖過程可采用人工飼料喂養，大大改善原烏鱧養殖中因采用冰鮮投喂而造成飼料浪費及水源污染等問題，在珠江三角洲地區已成為鱧科魚類中最重要的養殖品種。其中，以斑鱧為母本和烏鱧為父本的雜交鱧，因為苗種 孵化率高、成活率高等優勢，在中國鱧科魚類養殖中所占的比重越來越大。相關序列擴增多態性(SRAP)是近年來發展起來的一種新型分子標記系統，它獨特的引物設計原則，上游引物可以特異性結合在基因的外顯子或啟動子區域，下游引物可特異地與基因的內含子配對，針對基因組的ORF進行擴增，由于個體的內含子、啟動子與間隔區長度不等而產生多態性擴增產物。SRAP技術具有簡便、高共顯性、重復性高、成本低等特點。此技術在植物方面已經大量應用于植物遺傳圖譜構建、作物遺傳多樣性分析、基因定位及比較基因組學等方面。在水產動物方面，SRAP在日本沼蝦、梭子蟹及草魚等方面有所報道。常規使用鑒定雜交魚類的方面，主要從形態學方面進行鑒定。然而，形態學鑒定有時并不一定準確，存在很強的主觀因素，并且形態學鑒定在苗種期不能鑒定烏鱧、斑鱧與雜交鱧[斑鱧(早)x烏鱧U)]。例如，烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)x烏鱧U)]在形態學上，烏鱧易區別于其它兩種魚，而斑鱧與雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U)]在形態學上很容易混淆，兩者的頭部花紋都呈現“一八八”。本發明在不處死魚種的基礎上，只需剪去少量鰭條或其它魚體組織部分，利用SRAP技術便很容易區別烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U)]的方法
發明內容
本發明的目的是提供一種快速準確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧(古)]的方法，以克服現有從形態學上鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( )]，存在主觀性強且不能有效地鑒定三種魚苗種的缺陷，本發明的鑒定方法更精確，快速。為實現本發明的目的，本發明的技術方案是一種快速準確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)Χ烏鱧U )]的方法，該方法包括步驟I)引物合成步驟根據2001年由美國加州大學蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一種基于PCR的新型分子標記技術-相關序列擴增多態性，合成引物；2)烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)Χ烏鱧U ) ]DNA的提取步驟剪取三種魚的胸鰭，用苯酚法提取組織的DNA，把DNA濃度稀釋到20ng/ μ 1，放入-20°C以下保存；3) SRAP-PCR反應步驟，其中SRAP-PCR反應采用復性變溫法；具體是指擴增程序94°C預變性3min ;94°C預變性45s，35°C退火45s，72。。延伸lmin，共5個循環；94°C預變性45s，50°C退火45s，72。。延伸lmin，共35個循環;72°C延伸IOmin ;4°C保存；4)電泳檢測步驟用I. 5%瓊脂糖檢測擴增產物，篩選能用于鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧(￠)]的引物組合，并在其它采樣的群體中驗證；5)用Gelpix)32軟件處理條帶，并根據擴增出的特異性條帶來鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧。能夠擴增出694，268兩條帶的樣本為烏鱧，只擴增出500 —條帶的樣本為斑鱧，而同時能夠擴增出以上三條帶的為雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U )]。在本發明的一優選實施例中，所述步驟I)中所用引物為5個Me與6個Em組合，共30對引物。
在本發明的一優選實施例中，所述步驟I)中引物的使用濃度為20μΜ。在本發明的一優選實施例中，所述步驟2)烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U )]中DNA的提取包括步驟I)取樣本的少量胸鰭，用眼科剪剪碎，放入I. 5ml離心管中；2)加入裂解液，裂解液包括 Tris-HCl 25 μ I, SDS 50 μ I, EDTA ΙΟΟμΙ，無菌水320 μ 1，蛋白酶K 6-10 μ I ;放入55°C水浴中裂解2-4小時，變澄清即可；3)加入與裂解液體積相等的飽和苯酹,搖勻lOmin, 12000rpm時，4°C離心20min ；4)提取上清液，向提取的上清液中補充無菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的飽和苯酹，搖勻lOmin, 12000rpm時，4°C離心20min ；5)提取上清液，向提取的上清液中補充無菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的苯酚、氯仿及異戊醇混合物，其中苯酚、氯仿及異戊醇的比例為25 24 :1，搖勻 lOmin, 12000rpm 時，4°C離心 20min ；6)提取上清液，向提取的上清液中補充無菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的氯仿與異戊醇的混合物，其中氯仿與異戊醇的比例2 4 :1，搖勻lOmin, 12000rpm 時，4°C離心 20min ；7)提取上清液，加入雙倍體積的冰凍無水酒精，有絮狀沉淀生成，如暫無絮狀沉淀時，置 _20°C 中存放 30min, 7000rpm 時,4°C離心 8min ；8)緩緩倒掉酒精，切勿倒出DNA，用70%冰凍酒精洗一次，7000rpm時，4°C離心8min ；9)緩緩倒掉70%冰凍酒精，自然干燥1-2小時后，用100 μ I無菌水溶解，_20°C備用。在本發明的一優選實施例中，所述步驟2)中，Tris-HCl水溶液的摩爾濃度為1M，pH值為8.0。在本發明的一優選實施例中，所述步驟2)中，SDS的濃度為10%。在本發明的一優選實施例中，所述步驟2)中，EDTA水溶液的摩爾濃度為O. 5M。本發明與傳統的形態學鑒定相比，提供一種快速準確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧(￠)]的方法，以克服現有從形態學上鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( )]，存在主觀性強且不能有效地鑒定三種魚苗種的缺陷，本發明的鑒定方法更精確，客觀。
圖I為用Gelpro32軟件處理條帶擴增出的特異性條帶圖。其中A為引物Me3_Em5的組合，B為引物Me4-Em5的組合；1_5雜交鱧，6-10斑鱧，11-15烏鱧，M-D2000。
具體實施例方式 下面結合具體實施例，進一步說明本發明。實施例I.引物合成根據2001年由美國加州大學蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一種基于PCR的新型分子標記技術-相關序列擴增多態性，合成引物序列編號為附表I ;
附表I
權利要求
1.一種快速準確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧的方法，其特征在于，包括步驟 O引物合成步驟根據2001年由美國加州大學蔬菜作物系Li和Quiros博士提出的一種基于PCR的新型分子標記技術-相關序列擴增多態性，合成引物； 2)烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( ) ]DNA的提取步驟剪取三種魚的胸鰭，用苯酚法提取組織的DNA，把DNA濃度稀釋到20ng/ μ 1，放入-20°C以下保存； 3 ) SRAP-PCR反應步驟，其中SRAP-PCR反應采用復性變溫法；具體是指擴增程序:94°C預變性3min ;94°C預變性45s，35°C退火45s，72°C延伸lmin，共5個循環；94°C預變性45s，50° C退火45s，72。。延伸lmin，共35個循環;72°C延伸IOmin ;4°C保存； 4)電泳檢測步驟用I.5%瓊脂糖檢測擴增產物，篩選能用于鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧( )]的引物組合，并在其它采樣的群體中驗證； 5)用Gelpro32軟件處理條帶，并根據擴增出的特異性條帶來鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧。能夠擴增出694，268兩條帶的樣本為烏鱧，只擴增出500 —條帶的樣本為斑鱧，而同時能夠擴增出以上三條帶的為雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U )]。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟I)中所用引物為5個Me與6個Em組合，共30對引物。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟I)中引物的使用濃度為20μΜ。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(早)X烏鱧U )]中DNA的提取包括步驟 1)取樣本的少量胸鰭，用眼科剪剪碎，放入I.5ml離心管中； 2)加入裂解液，裂解液包括Tris-HCl25 μ I, SDS 50 μ I, EDTA ΙΟΟμΙ，無菌水320 μ 1，蛋白酶K 6-10 μ I ;放入55°C水浴中裂解2-4小時，變澄清即可； 3)加入與裂解液體積相等的飽和苯酹,搖勻IOmin,12000rpm時，4°C離心20min ； 4)提取上清液，向提取的上清液中補充無菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的飽和苯酹，搖勻IOmin, 12000rpm時，4°C離心20min ； 5)提取上清液，向提取的上清液中補充無菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的苯酚、氯仿及異戊醇混合物，其中苯酚、氯仿及異戊醇的比例為25 24 I，搖勻 IOmin, 12000rpm 時，4°C離心 20min ； 6)提取上清液，向提取的上清液中補充無菌水至體積與裂解液體積相等，接著加入與裂解液體積相等的氯仿與異戊醇的混合物，其中氯仿與異戊醇的比例為24 :1，搖勻lOmin，12000rpm 時，4°C 離心 20min ； 7)提取上清液，加入雙倍體積的冰凍無水酒精，有絮狀沉淀生成，如暫無絮狀沉淀時，置 _20°C 中存放 30min, 7000rpm 時，4°C 離心 8min ； 8)緩緩倒掉酒精，切勿倒出DNA，用70%冰凍酒精洗一次，7000rpm時，4°C離心8min； 9)緩緩倒掉70%冰凍酒精，自然干燥1-2小時后，用100μ I無菌水溶解，-20°C備用。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，在本發明的一優選實施例中，所述步驟2)中，Tris-HCl水溶液的摩爾濃度為1M，pH值為8. O。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，SDS的濃度為10%。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中，EDTA水溶液的摩爾濃度為O.5M。
全文摘要
本發明涉及一種快速準確鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧的方法，該方法包括步驟1)引物合成；2)烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(♀)╳烏鱧(♂)]DNA的提取；3)SRAP-PCR反應采用復性變溫法；4)電泳檢測；5)對能用于鑒定烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(♀)╳烏鱧(♂)]的引物組合，用Gelpro32軟件處理條帶，標出條帶的大小，并在其它采樣的群體中驗證。本發明在不處死魚種的基礎上，只需剪去少量鰭條或其它魚體組織部分，利用SRAP技術便很容易區別烏鱧、斑鱧及雜交鱧[斑鱧(♀)╳烏鱧(♂)]的方法。
文檔編號C12Q1/68GK102912017SQ20121037990
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月29日 優先權日2012年9月29日
發明者朱樹人, 李家樂, 王群, 邢智珺, 謝楠, 王宇希, 潘彬斌 申請人:華東師范大學, 上海海洋大學, 杭州市農業科學研究院