專利名稱：γ-氨基丁酸的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種Y-氨基丁酸的生產方法，屬于醫藥化工技術領域。
背景技術：
Y -氨基丁酸，又名氨酪酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)。其分子式為H2N (CH2)3COOH,相對分子量為103. 2。Y-氨基丁酸(GABA)是一種非蛋白質氨基酸，主要用于醫藥中間體、營養藥等方面。GABA具有安定、抗驚厥、降血壓、增進腦活力、營養神經細胞、促進生長激素分泌以及保肝利腎的作用。近年來，國內外市場對Y-氨基丁酸的需求逐年強勁增長。近年來，隨著Y -氨基丁酸在醫藥工業上用途的不斷擴大，Y -氨基丁酸成為一種國際市場上發展前景良好、中國市場需求較大的產品。作為一種具有多種生理功能的生物活性因子，GABA在美國、日本等國家已廣泛用于營養補充劑和功能食品中，而我國在這方面的研究尚處于起步階段，亟待發展和提高。Y-氨基丁酸的生產方法有主要有化學合成法、固態發酵法和生物酶轉化法。化學合成法主要采用吡咯烷酮、氫氧化鈉和水按一定比例混合后，在高溫下進行反應，然后通過樹脂分離純化，濃縮結晶而成。吡咯烷酮與氫氧化鈉都為腐蝕性物質，影響人體健康。特別是吡咯烷酮在高溫下，有引起燃燒的危險，且可分解釋放有毒的氧化氮煙氣，操作過程存在危險性，不利于工業化大規模生產。固態發酵法效率低下，產量僅為O. 35mg/g，最終純度只有45%。生物酶轉化法以基因工程菌代謝中產生的酶，對底物進行生物轉化，直接產出Y-氨基丁酸。生產過程污染小，無危險性，成本低廉，成為目前Y-氨基丁酸主要的生產方式。隨著基因工程技術的發展、工業微生物生物化學信息的增多、特別是工業生物載體系統的成功構建，現在研究者開始用基因工程技術構建產Y-氨基丁酸的菌種，為優良的Y-氨基丁酸生產菌株的篩選提供了可靠的技術保障，采用酶法生產Y-氨基丁酸成為一種廉價的工業化生產方法。
發明內容
根據現有技術的不足，本發明要解決的技術問題是提供一種Y-氨基丁酸的生產方法，大大提高了單位發酵液Y-氨基丁酸(GABA)的產量，降低了生產成本，使GABA實現大規模生產制備。本發明解決其技術問題所采用的技術方案是提供一種Y-氨基丁酸(GABA)的生產方法，其特征在于由以甘油、玉米漿、酵母粉、無機鹽為原料，加入誘導劑，經大腸桿菌發酵進行酶表達，在發酵過程中補料，然后加入底物進行轉化；轉化結束后經過陶瓷膜和有機膜進行微濾和超濾，超濾液經過濃縮結晶，過濾，將晶體烘干得到成品。所述的誘導劑為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷，加入量為O. 005-0. 01g/L。所述的轉化過程中加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，濃度為磷酸二氫鉀濃度5 10g/L，磷酸氫二鉀濃度3 8g/L，將轉化罐升溫至30 45°C，攪拌下酶促轉化反應，15-20小時。所述的轉化前將菌體分離，按質量體積比1:5 10的比例加入配置好的磷酸二氫鉀濃度/磷酸氫二鉀緩沖溶液，導入轉化罐中，補加谷氨酸及甘油進行轉化。所述的底物為谷氨酸，濃度為20 50g/L。所述的補料過程中加入乳糖，乳糖的濃度維持在l_2g/L。本發明中的大腸桿菌是通過離心機進行收集的，收率達到95%以上。其中發酵液中生物量80g/L，酶促反應轉化率達98%以上，每升轉化液中GABA濃度達到 180g/L。
本發明的有益效果是首先利用發酵技術高效表達谷氨酸脫羧酶，通過離心技術出去發酵液中的雜質，然后利用菌體進行轉化。大大提高了單位發酵液GABA的產量，工藝簡單，降低了生產成本，使GABA實現大規模生產制備，使GABA能得到普遍實際應用。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步描述實驗材料和方法I、工程菌大腸桿菌基因重組工程菌，該菌種由我公司通過基因重組工程技術構建選育，由我公司生物研究所保藏，保藏日期為2011年6月15日，本基因重組大腸桿菌攜帶谷氨酸脫羧酶基因。2、發酵培養基種子培養基99% 甘油 20g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，磷酸二氫鉀3g，磷酸氫二鉀5g，發酵培養基甘油60g，酵母浸粉12g，玉米漿20g，磷酸二氫鉀20g，七水硫酸鎂6g，氯化鈣I. 2g，硫酸亞鐵I. 4g，氯化鈉2g，異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG O. Ig,補料培養基補料I :25% 28%氨水，發酵罐自動控制其補加速度，使pH值控制在一定數值。
補料2 :甘油1000g，乳糖80g，純化水定容到2L，115°C滅菌30min。補料3 :谷氨酸1500g。3、發酵工藝3. I發酵第一階段一種子罐培養階段5L罐中加入種子培養基后，加水至 2L，種子罐中121°C滅菌30min。溫度降至37°C接種，通氣比為I: I，此階段DO和pH持續下降，發酵罐自動補加氨水控制PH5. O 6. O ;通過提高轉速提高溶氧，使其不低于30%。此階段維持16 20h，時間長短根據接種量不同而有所區別，此階段生物量達30g/L左右。3. 2發酵第二階段一發酵罐培養階段IOL罐中加入發酵培養基后，加水至4L，發酵罐中121°〇滅菌301^11。溫度降至371后將培養好的種子移種至發酵罐中，通氣比為I: I，5h開始補加補料2，通過提高轉速提高溶氧，使其不低于30%，發酵液中甘油含量維持在5 10g/L。發酵罐中菌體生長迅速，此階段時長24h左右，生物量可達80 100g/L。3. 3發酵第三階段一轉化罐轉化階段用純水將離心出來的菌體溶解，依次加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，使其濃度為磷酸二氫鉀濃度5 10g/L，磷酸氫二鉀濃度3 8g/L。少量多次加入谷氨酸，使谷氨酸濃度維持在20 50g/L，pH4 6，將轉化罐升溫至30 45°C，通氣比為1: 1，200rpm攪拌下酶促轉化反應，15小時左右。隨時檢測谷氨酸含量，轉化液中GABA含量達到180g/L轉化液時，即可終止轉化反應。4、純化4. I膜過濾將轉化液加熱至70°C維持5min，然后進行陶瓷膜微濾，將破碎的菌體及部分大分子蛋白質除掉。濾液用截留分子量1000的中空纖維超濾膜，超濾去除陶瓷膜濾液中殘留的蛋白質及其他大分子物質。將超濾液進一步進行納濾脫鹽處理，通過納濾可將轉化液中絕大部分的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀除掉。4. 2濃縮結晶GABA易溶于水，在水中溶解度極高，將納濾液濃縮至GABA含量為60%后，保持攪拌，室溫放置。放置12h后，晶體大量析出，此時進行抽濾，并用90%的乙醇對晶體進行洗滌。將處理好的晶體真空干燥，即得白色針狀GABA成品，產品純度可達99. 5%以上。實施例一I、發酵工藝利用5L發酵罐作為種子罐，進行種子培養種子罐培養基99% 甘油 20g，酵母浸粉5g，蛋白胨10g，磷酸二氫鉀3g，
磷酸氫二鉀5g，5L罐中加入種子培養基后，加水至2L，種子罐中121°C滅菌30min。溫度降至37°C接種，通氣比為I: I，此階段DO和pH持續下降，發酵罐自動補加氨水控制pH5. O 6. O ;通過提高轉速提高溶氧，使其不低于30%。此階段維持18h，生物量達30g/L左右。利用IOL發酵罐作為發酵罐，進行菌體培養發酵罐培養基甘油60g，酵母浸粉12g，玉米漿20g，磷酸二氫鉀20g，七水硫酸鎂6g，氯化鈣I. 2g，硫酸亞鐵L 4g，氯化鈉2g，異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG O. Ig,
IOL罐中加入發酵培養基后，加水至4L，發酵罐中121°〇滅菌301^11。溫度降至371后將培養好的種子移種至發酵罐中，此時發酵液共6L，轉速為200rpm，通氣比全程保持為1: 1，5h開始補加補料2，初始補料速度為55ml/L，通過提高轉速提高溶氧，使其不低于30%，發酵液中甘油含量維持在5 10g/L。發酵罐中菌體生長迅速，此階段時長24h左右，生物量達80_90g/L。用純水將離心出來的菌體溶解，依次加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，使其濃度為磷酸二氫鉀濃度5 10g/L，磷酸氫二鉀濃度3 8g/L。少量多次加入谷氨酸，使谷氨酸濃度維持在50g/L左右，pH4 6，將轉化罐升溫至30 45 °C，通氣比為I: I，200rpm攪拌下酶促轉化反應，15小時左右。定時檢測谷氨酸含量，轉化液中GABA含量達到180g/L轉化液，終止轉化反應。2、純化將轉化液加熱至70°C維持5min，然后進行陶瓷膜微濾，將破碎的菌體及部分大分子蛋白質除掉。濾液用截留分子量1000的中空纖維超濾膜，超濾去除陶瓷膜濾液中殘留的蛋白質及其他大分子物質。將超濾液進一步進行納濾脫鹽處理，通過納濾將轉化液中絕大部分的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀除掉。GABA易溶于水，在水中溶解度極高，將納濾液濃縮至GABA含量為50%后，保持攪拌，室溫放置。放置12h后，晶體大量析出，此時進行抽濾，并用95%的乙醇對晶體進行洗滌。將處理好的晶體真空干燥，即得白色針狀GABA成品，產品純度達到99. 5%。實施例二酶促反應及純化精制通過發酵培養菌體，生物量達到80_90g/L，通過離心將發酵液中的菌體分離出來，用純水將離心出來的菌體溶解，依次加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，使其濃度為磷酸二氫鉀濃度5 10g/L，磷酸氫二鉀濃度3 8g/L。少量多次加入谷氨酸，使谷氨酸濃度維持在20 50g/L，pH4 6，將轉化罐升溫至30 45°C，通氣比為1: 1，200rpm攪拌下酶促轉化反應，15小時左右。定時檢測谷氨酸含量，轉化液中GABA含量達到180g/L轉化液，終止轉化反應。3、純化將轉化液加熱至70°C維持5min，然后進行陶瓷膜微濾，將破碎的菌體及部分大分子蛋白質除掉。濾液用截留分子量1000的中空纖維超濾膜，超濾去除陶瓷膜濾液中殘留的蛋白質及其他大分子物質。將超濾液進一步進行納濾脫鹽處理，通過納濾將轉化液中絕大部分的磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀除掉。GABA易溶于水，在水中溶解度極高，將納濾液濃縮至GABA含量為60%后，加入5倍體積95%乙醇，保持攪拌，室溫放置。放置24h后，晶體大量析出，此時進行抽濾，并用95%的乙醇對晶體進行洗滌。 將處理好的晶體真空干燥，即得白色針狀GABA成品，產品純度達99. 7%。
權利要求
1.一種Y-氨基丁酸的生產方法，其特征在于由以甘油、玉米漿、酵母粉、無機鹽為原料，加入誘導劑，經大腸桿菌發酵進行酶表達，在發酵過程中補料，然后加入底物進行轉化；轉化結束后經過陶瓷膜和有機膜進行微濾和超濾，超濾液經過濃縮結晶，過濾，將晶體烘干得到成品。
2.根據權利要求I所述的Y-氨基丁酸的生產方法，其特征在于所述的誘導劑為異丙基-β -D-硫代半乳糖苷，加入量為O. 005-0. 01g/L。
3.根據權利要求I所述的Y-氨基丁酸的生產方法，其特征在于所述的轉化過程中加入磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀，濃度為磷酸二氫鉀濃度5 10g/L，磷酸氫二鉀濃度3 Sg/L，將轉化罐升溫至30 45°C，攪拌下酶促轉化反應，15-20小時。
4.根據權利要求I所述的Y-氨基丁酸的生產方法，其特征在于所述的轉化前將菌體分離，按質量體積比1:5 10的比例加入配置好的磷酸二氫鉀濃度/磷酸氫二鉀緩沖溶液，導入轉化罐中，補加谷氨酸及甘油進行轉化。
5.根據權利要求I所述的Y-氨基丁酸的生產方法，其特征在于所述的底物為谷氨酸，濃度為20 50g/L。
6.根據權利要求I所述的Y-氨基丁酸的生產方法，其特征在于所述的發酵過程中補料中加入乳糖，使乳糖在發酵液中的濃度維持在l_2g/L。
全文摘要
本發明涉及一種γ-氨基丁酸的生產方法，屬于醫藥化工技術領域，其特征在于由以甘油、玉米漿、酵母粉、無機鹽為原料，加入誘導劑，經大腸桿菌發酵進行酶表達，在發酵過程中補料，然后加入底物進行轉化；轉化結束后經過陶瓷膜和有機膜進行微濾和超濾，超濾液經過濃縮結晶，過濾，將晶體烘干得到成品。首先利用發酵技術高效表達谷氨酸脫羧酶，通過離心技術出去發酵液中的雜質，然后利用菌體進行轉化。大大提高了單位發酵液GABA的產量，工藝簡單，降低了生產成本，使GABA實現大規模生產制備，使GABA能得到普遍實際應用。
文檔編號C12R1/19GK102864190SQ20121038282
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者榮金雷, 李江濤, 楊修亮 申請人:山東金城鐘化生物藥業有限公司