專利名稱：一種提取銀耳多糖和銀耳蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種銀耳多糖和銀耳蛋白的提取方法，特別涉及采用雙水相萃取體系提取銀耳多糖和銀耳蛋白的方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
銀耳(Tremella fuciformis Berk)是一種食藥兩用菌,含有豐富的多糖和蛋白質等物質。銀耳多糖是銀耳的主要活性物質，包括酸性雜多糖、中性雜多糖、胞壁多糖、胞外多糖及酸性低聚糖五類。銀耳多糖具有提高人體免疫力、抗腫瘤、抗衰老、降血糖和降血脂等多種生理功能；銀耳蛋白質含有17種氨基酸，能提供人體所必需的氨基酸中的3/4。銀耳多糖以其豐富的原料來源、獨特的生物學功能和良好的食用安全性，近年來在天然功能性食 品添加劑、醫藥保健品、日用化妝品等領域越來越來受到重視，具有廣泛的開發應用前景。銀耳多糖可以從銀耳子實體中提取獲得，也可通過銀耳分生孢子發酵生產。銀耳子實體的生產存在著培養周期長、產量低、不易規模化生產等缺點，而銀耳孢子液體發酵法具有原料來源廣泛、產生的活性物質多、發酵周期短、生產成本低、易于實現工業化的特點，因而發酵法生產銀耳多糖正逐步取代銀耳子實體提取法。從銀耳子實體或孢子中提取銀耳多糖的方法主要有熱水浸取法、溶劑提取法、酶溶提取法等，這些方法是通過破壞銀耳細胞而使胞內多糖溶出，得到的粗多糖中含有大量的蛋白質，為提高多糖純度，還需要再采用sevag法(氯仿和正丁醇沉淀法)除去多糖中的蛋白質。以上的提取方法或者存在提取效率較低、有溶劑殘留，或者存在設備要求聞、能耗聞、成本高、多糖純度低、多糖易變性失活等問題。雙水相萃取技術是近年來發展起來的生物分離技術，是分離純化生物活性物質的有效方法。雙水相系統是指兩種不同種類的聚合物水溶液混合或者一種聚合物水溶液和一種鹽溶液混合后，當兩者濃度達到一定值時，混合液靜置后分層產生的兩液相系統。雙水相系統萃取的原理是基于生物物質在體系中的選擇性分配。雙水相萃取具有操作條件溫和、處理量大、分離步驟少、能耗低，無有機溶劑殘留，易于工業化操作等優點。目前在生化分離工程中常用的雙水相體系是聚合物/聚合物體系以及聚合物/無機鹽體系，最常用的體系為聚乙二醇(PEG) /葡聚糖(Dex)體系以及聚乙二醇(PEG) /無機鹽體系。如中國專利文獻CN101693735A (申請號200910309154. 8)，公開了一種雙水相萃取分離蛋白質和酶的方法，其特點在于將多元醇與無機鹽按比例直接加入到蛋白質或酶溶液中，攪拌均勻，室溫下靜置，形成兩相，蛋白質或酶主要分配到上相，且保留較高的活性，從而達到有效的分離提取目的。采用雙水相體系同步提取銀耳多糖和銀耳蛋白質的方法尚未見報道。
發明內容
針對目前銀耳多糖和銀耳蛋白提取方法的不足，本發明的目的在于提供一種工藝簡單、多糖收率高、成本低，便于規模化生產的提取銀耳多糖和銀耳蛋白的方法。
本發明的方法是利用雙水相體系提取銀耳多糖和銀耳蛋白，從而降低生產成本，達到較好的經濟效果。為實現上述目的，本發明采取的具體技術方案如下一種利用雙水相體系提取銀耳多糖和銀耳蛋白的方法，包括以下步驟(I)將銀耳菌接種到斜面培養基上，在24 26°C下活化培養6 8d，然后將銀耳孢子接入到液體種子培養基中，在15(T200r/min、24 26°C下培養3 5d，制得液體種子；將液體種子按5 10wt%的接種量接入液體發酵培養基中，在溫度24 26°C、150 200r/min條件下，培養4 6天，制得發酵液；(2)將步驟(I)制得的發酵液采用截留分子量為3000 6000Dal的超濾膜濃縮，截留液為含有銀耳孢子和胞外多糖的濃縮液，破碎銀耳孢子，得到銀耳孢子破碎液；(3)在2(T30°C下，配制無機鹽水溶液，向該無機鹽水溶液中添加聚乙二醇，在總體·系中無機鹽質量百分比濃度為10 30%，聚乙二醇在總體系中的質量百分比濃度為10% 30%，混合均勻，制得聚乙二醇/無機鹽雙水相體系；(4)向步驟(2)制得的銀耳孢子破碎液中按體積比I: (I 5)加入步驟(3)制得的聚乙二醇/無機鹽雙水相體系，攪拌10 30min混勻后,靜置5 15min分相,制得無機鹽下相和聚乙二醇上相；(5)將步驟(4)制得的無機鹽下相離心分離，取上清液，采用截留分子量為3000 6000Dal的超濾膜濃縮，截留液經冷凍干燥后，制得銀耳多糖；(6 )向步驟(4 )制得的聚乙二醇上相中加入水和無機鹽，使無機鹽在總體系中的質量濃度為10 30%，攪拌10 30min混勻后，靜置10 20min分相，制得無機鹽下相和聚乙二醇上相，將制得的無機鹽下相，采用截留分子量為6000 IOOOODal的超濾膜過濾，收集截留液，冷凍干燥制得銀耳蛋白。根據本發明優選的，所述步驟(I)中通過液體發酵產生銀耳多糖的銀耳(Tremellafuciformis)菌種編號為CICC50179、CICC50180,以上菌株均購自中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC);銀耳(Tremella fuciformis)菌種編號為 ACCC50546、ACCC51351,以上菌株均購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(ACCC);銀耳(Tremella fuciformis)菌種編號為CGMCC5. 466、CGMCC5. 526，以上菌株均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。根據本發明優選的，所述步驟(I)中的斜面培養基組分如下葡萄糖20g，蛋白胨10g, KH2P043g, MgSO4L 5g，維生素 B1O. 005g，瓊脂 20g，20% 馬鈴薯煮汁 IOOOmL, pH 自然。根據本發明優選的，所述步驟(I)中的液體種子培養基組分如下葡萄糖20g，蛋白胨 10g, KH2PO4L 5g，MgSO4O. 75g，20% 馬鈴薯煮汁 IOOOmL, pH 自然。上述20%馬鈴薯煮汁是將200g馬鈴薯切塊后放入IOOOmL水中煮沸30min后制得。根據本發明優選的，所述步驟(I)中的發酵培養基組分如下可溶性淀粉40g，葡萄糖 20g，蛋白胨 5g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 75g，瓊脂 5g，水 IOOOmL, pH 自然。根據本發明優選的，所述步驟(2)中的超濾濃縮液中孢子的質量百分比濃度為
7 10wt%。根據本發明優選的，所述步驟(2)中的孢子破碎采用珠磨機破碎，轉速為2400 5000r/min,時間I 5min，操作溫度5 40°C。
根據本發明優選的，所述步驟(2)、(5)、(6)中的超濾膜工作壓力為O. I O. 5MPa，溫度為25°C。根據本發明優選的，所述步驟(3)、(6)中的無機鹽選自硫酸銨、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鉀或氯化鈉之一；根據本發明優選的，所述步驟(3)、(6)中的雙水相體系中的聚乙二醇分子量為1000。有益效果I、本發明的提取方法與發酵方法相結合，相比于從銀耳子實體提取多糖的方法，可以實現銀耳孢子生產和多糖提取的連續化、規模化，便于銀耳多糖的工業化生產；
2、本發明的提取方法得到的產物中既有銀耳孢子的胞內多糖，又有銀耳孢子液體發酵產生的胞外多糖，極大提高了銀耳多糖的產率；3、本發明的提取方法使銀耳多糖和蛋白質得到同時分離，避免了現有sevag法去除蛋白質的復雜操作和機溶劑污染的弊端，提高了多糖的純度，制得了具有生理活性作用的銀耳多糖；4、本發明的提取方法工藝簡單，易于工程放大，具有生產成本低的優勢。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明的技術方案進行具體描述或作進一步說明，目的在于更好地理解本發明的方法，但本發明的保護范圍不限于以下的實施例。本發明中銀耳多糖含量的測定采用苯酚-硫酸法，步驟如下a、標準曲線的制作準確稱取標準葡萄糖(購自天津市凱通化學試劑有限公司)20mg于500mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，分別吸取O. 4、O. 6、O. 8、I. O、I. 2、I. 4、I. 6及I. 8mL,各以蒸懼水補至2. OmL,然后加入6wt%苯酹I. OmL及濃硫酸(濃度98wt%)5. OmL,搖勻冷卻，室溫放置20min，于490nm波長下測定吸光度值，以2. OmL蒸餾水按同樣顯色操作為空白對照，以葡萄糖濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標，制作標準曲線。標準曲線方程為A=16. 356C-0. 0164，R2=O. 9982，其中A為吸光度值，C為葡萄糖濃度(mg/mL)，R2為相關系數；b、多糖含量測定用蒸餾水將制得的銀耳多糖配成濃度為I. Omg/mL的溶液，取O. 2mL按步驟a的方法測定490nm的吸光度值，根據標準曲線計算多糖的質量；C、銀耳多糖含量(％)=(多糖的質量/銀耳多糖的質量)X 100%。本發明中銀耳蛋白含量的測定采用凱氏定氮法檢測。實施例中所述20%馬鈴薯煮汁是將200g馬鈴薯切塊后放入IOOOmL水中煮沸30min后制得。實施例I本實施例所用菌種為銀耳菌(Tremella fuciformis)CICC50180，購自中國工業微
生物菌種保藏管理中心。一種利用雙水相體系提取銀耳多糖和銀耳蛋白的方法，包括以下步驟(I)將銀耳菌接種到斜面培養基上，在25°C下活化培養7天，然后用lwt%生理鹽水洗下斜面培養基上的孢子及菌絲體，并接入到IOmL液體種子培養基中，在150r/min、25°C下培養4d，制得液體種子；將液體種子按10wt%的接種量接入液體發酵培養基中，在溫度250C、180r/min下，培養5天，制得發酵液；(2)將步驟(I)制得的發酵液在O. 2MPa條件下，通過截留分子量為4000Dal的超濾膜濃縮，收集截留液，截留液為含有銀耳孢子質量濃度9wt%和胞外多糖的濃縮液，采用德國公司生產的LM-20型珠磨機,在4200r/min條件下珠磨3min破碎孢子,得含有銀耳胞內、胞外多糖和銀耳蛋白質的銀耳孢子破碎液；(3)在25°C下，配制硫酸銨水溶液IOOmL,向該溶液中添加聚乙二醇，使硫酸銨在總體系中的質量百分比濃度為19%，聚乙二醇在總體系中的質量百分比濃度為21%，混合均勻，制得聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系；(4)向步驟(2)制得的銀耳孢子破碎液中按體積比1:1加入步驟(3)制得的聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系，攪拌20min混勻后，靜置IOmin分相，制得硫酸銨下相和聚乙二醇上相；聚乙二醇上相含有銀耳蛋白質，硫酸銨下相含有銀耳多糖；
(5)將步驟(4)制得的硫酸銨下相,在4000r/min的條件下離心分離IOmin,取上清液，在O. 2MPa壓力下，通過截留分子量為4000Dal的超濾膜濃縮，截留液經冷凍干燥后，制得銀耳多糖3. 42g，經測定多糖含量為70. 31wt% ；(6)向步驟(4)制得的聚乙二醇上相溶液中加入等體積的水，再加入硫酸銨，使硫酸銨在總體系中的質量濃度為19%，攪拌20min混勻后，靜置15min分相，制得硫酸銨下相和聚乙二醇上相。將制得的硫酸銨下相溶液，在O. 2MPa壓力下，通過截留分子量為SOOODal的超濾膜濃縮，截留液經冷凍干燥后，制得銀耳蛋白O. 32g。所述步驟(I)中的斜面培養基組分如下葡萄糖20g,蛋白胨10g, KH2P043g,MgSO4L 5g，維生素 B1O. 005g，瓊脂 20g，20% 馬鈴薯汁 IOOOmL, pH 自然。所述步驟(I)中的液體種子培養基組分如下葡萄糖20g,蛋白胨10g,KH2PO4L 5g,MgSO4O. 75g, 20% 馬鈴薯汁 IOOOmL, pH 自然。所述步驟(I)中的發酵培養基組分如下可溶性淀粉40g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2PO4Ig, MgSO4O. 75g，瓊脂 5g，水 IOOOmL, pH 自然。實施例2如實施例I所述的利用雙水相體系提取銀耳多糖和蛋白質的方法，不同之處在于步驟(3)中，配制磷酸氫二鈉水溶液IOOmL,向該溶液中添加聚乙二醇，使磷酸氫二鈉在總體系中的質量百分比濃度為13%，聚乙二醇在總體系中的質量百分比濃度為27%，混合均勻，制得聚乙二醇/磷酸氫二鈉雙水相體系。得到銀耳多糖產品3. 25g，經測定多糖含量為69. 24% ;得到銀耳蛋白O. 37g。實施例3如實施例I所述的利用雙水相體系提取銀耳多糖和蛋白質的方法，不同之處在于步驟(3)中，分別于IOOmL水中加入氯化鈉和聚乙二醇，建立聚乙二醇/氯化鈉雙水相體系，使聚乙二醇在總體系中的質量濃度為13%，氯化鈉在總體系中的質量濃度為27% ；步驟(4)中，向制得的銀耳孢子破碎液中按體積比1:1. 5加入制得的聚乙二醇/氯化鈉雙水相體系中，攪拌萃取。得到銀耳多糖產品3. 68g，經測定多糖含量為74. 67%;得到銀耳蛋白質產品O. 29g0實施例4本實施例所用菌種為銀耳菌ACCC50546，購自中國農業微生物菌種保藏管理中心。如實施例I所述的利用雙水相體系提取銀耳多糖和蛋白質的方法，不同之處在于步驟(3)中，分別于IOOmL水中加入磷酸鉀和聚乙二醇，建立聚乙二醇/磷酸鉀 雙水相體系，使聚乙二醇在總體系中的質量濃度為16%，磷酸鉀在總體系中的質量濃度為23% ；步驟(4)中，向制得的銀耳孢子破碎液中按體積比1:2加入制得的聚乙二醇/磷酸鉀雙水相體系中，攪拌萃取。得到銀耳多糖產品3. 58g，經測定多糖含量為77.86%;得到銀耳蛋白質產品O. 31g0實施例5本實施例所用菌種為銀耳菌CGMCC5. 526，購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。如實施例I所述的利用雙水相體系提取銀耳多糖和蛋白質的方法，不同之處在于步驟(3)中，分別于IOOmL水中加入硫酸鈉和聚乙二醇，建立聚乙二醇/硫酸鈉雙水相體系，使聚乙二醇在總體系中的質量濃度為23%，硫酸鈉在總體系中的質量濃度為16%，混合均勻，制得聚乙二醇/硫酸鈉雙水相體系。得到銀耳多糖產品3. 46g，經測定多糖含量為70. 72% ;得到銀耳蛋白質產品O. 34g0
權利要求
1.一種利用雙水相體系提取銀耳多糖和銀耳蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)將銀耳菌接種到斜面培養基上，在24 26°C下活化培養6 8d，然后將銀耳孢子接入到液體種子培養基中，在15(T200r/min、24 26°C下培養3飛d，制得液體種子；將液體種子按5 10wt%的接種量接入液體發酵培養基中，在溫度24 26°C、150 200r/min條件下，培養4 6天，制得發酵液； (2)將步驟(I)制得的發酵液采用截留分子量為3000 6000Dal的超濾膜濃縮，截留液為含有銀耳孢子和胞外多糖的濃縮液，破碎銀耳孢子，得到銀耳孢子破碎液； (3)在2(T30°C下，配制無機鹽水溶液，向該無機鹽水溶液中添加聚乙二醇，在總體系中無機鹽質量百分比濃度為10 30%，聚乙二醇在總體系中的質量百分比濃度為10% 30%，混合均勻，制得聚乙二醇/無機鹽雙水相體系； (4)向步驟(2)制得的銀耳孢子破碎液中按體積比I:(I 5)加入步驟(3)制得的聚乙二醇/無機鹽雙水相體系，攪拌10 30min混勻后,靜置5 15min分相,制得無機鹽下相和聚乙二醇上相； (5)將步驟(4)制得的無機鹽下相離心分離，取上清液，采用截留分子量為3000 6000Dal的超濾膜濃縮，截留液經冷凍干燥后，制得銀耳多糖； (6)向步驟(4)制得的聚乙二醇上相中加入水和無機鹽，使無機鹽在總體系中的質量濃度為10 30%,攪拌10 30min混勻后，靜置10 20min分相，制得無機鹽下相和聚乙二醇上相，將制得的無機鹽下相，采用截留分子量為6000 IOOOODal的超濾膜過濾，收集截留液，冷凍干燥制得銀耳蛋白。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中通過液體發酵產生銀耳多糖的銀耳菌菌種編號為 CICC50179、CICC50180、ACCC50546、ACCC51351、CGMCC5. 466 或CGMCC5. 526。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的斜面培養基組分如下葡萄糖20g,蛋白胨10g, KH2P043g, MgSO4L 5g，維生素B1O. 005g,瓊脂20g, 20%馬鈴薯煮汁IOOOmL, pH 自然。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的液體種子培養基組分如下葡萄糖 20g，蛋白胨 IOg, ΚΗ2Ρ041· 5g，MgSO4O. 75g，20% 馬鈴薯煮汁 IOOOmL, pH 自然。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中的發酵培養基組分如下可溶性淀粉40g，葡萄糖20g，蛋白胨5g，KH2P04lg, MgSO4O. 75g，瓊脂5g，水IOOOmL, pH自然。
6.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的超濾濃縮液中孢子的質量百分比濃度為7 10wt%。
7.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的孢子破碎采用珠磨機破碎，轉速為2400 5000r/min，時間I 5min，操作溫度5 40°C。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)、(5)、(6)中的超濾膜工作壓力為0. I 0. 5MPa，溫度為25°C。
9.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)、(6)中的無機鹽選自硫酸銨、硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鉀或氯化鈉之一。
10.如權利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)、(6)中的雙水相體系中的聚乙二醇分子 量為1000。
全文摘要
本發明涉及一種銀耳多糖和銀耳蛋白的提取方法，包括(1)銀耳菌的活化培養和發酵培養；(2)超濾膜濃縮和破碎銀耳孢子；(3)聚乙二醇/無機鹽雙水相體系的配制；(4)聚乙二醇/無機鹽雙水相體系提取；(5)冷凍干燥制備銀耳多糖；(6)聚乙二醇/無機鹽雙水相體系二次提取，超濾膜過濾，冷凍干燥制備銀耳蛋白。本發明可以實現銀耳孢子生產和多糖提取的連續化、規模化，便于銀耳多糖的工業化生產；得到的產物中既有銀耳孢子的胞內多糖，又有銀耳孢子液體發酵產生的胞外多糖，極大提高了銀耳多糖的產率；并且使銀耳多糖和蛋白質得到同時分離，避免了現有sevag法去除蛋白質的復雜操作和機溶劑污染的弊端，提高了多糖的純度。
文檔編號C12R1/645GK102876750SQ20121038282
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者董永勝 申請人:山東輕工業學院