專利名稱：高溫高效木糖發酵的耐熱工程酵母菌株及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及通過工程菌改造提高木糖發酵的領域。
背景技術：
溫室氣體排放的增加和全球的溫暖化、石油資源的枯竭和日益上漲的能源需求以及國家能源安全問題使得可再生能源的利用和開發是21世紀最重要的課題之一。其中從生物質生產燃料乙醇是其中重要的一個方向。木質纖維素類是地球上最豐富的可再生生物資源(每年約200X109噸的產量)，中國每年約產生10億噸農業和森林廢棄物(Reddy andYang, 2005 ；Yinbo et al.，2006)，但是其中只有3%在非食品領域比如造紙和紙漿得到使 用(Kamm and Kamm,2004)。天然的木質纖維素類主要是植物纖維原料，主要成分含有40-50%的纖維素、20-30%的半纖維素，另外還有木素等組分。其中半纖維素主要成分是木聚糖，木聚糖的水解主要產物是木糖。迄今為止發現很多種微生物能夠代謝木糖產乙醇，包括細菌(Clostridia，Bacillus spp.等)、真菌(Mucor spp. ,Rhizopus spp. ,Monilia spp. ,and Fusaria spp.Neurospora spp 等)和酵母菌(Candida spp, Pichia spp, Kluyveromyces spp.等)。木糖的代謝和發酵都要將醛糖轉化成酮糖再進入磷酸戊糖途徑(PPP)，按照轉化途徑的不同可分為酵母等真核生物中的木糖還原氧化途徑(即木糖還原酶(Xylose reductase (XR)、木糖醇脫氫酶(Xylitol dehydrogenase (XDH)及木酮糖激酶(Xylulokinase(XKS)的體系)和以細菌及一些低等真菌為主的木糖異構酶(Xylose isomerase (XI))的途徑(圖2)。酵母中通過XR、XDH、XKS體系的木糖代謝和發酵已有很多文獻報道。其代謝途徑比葡萄糖代謝途徑復雜得多，首先是在依賴NADPH的木糖還原酶(XR)的作用下還原木糖為木糖醇，隨后在依賴NAD+的木糖醇脫氫酶(XDH)作用下氧化形成木酮糖，再經木酮糖激酶(XK)磷酸化形成5-磷酸木酮糖，由此進入磷酸戊糖途徑(PPP)。PPP途徑的中間產物6-磷酸葡萄糖及3-磷酸甘油醛通過酵解途徑形成丙酮酸。丙酮酸或是經丙酮酸脫羧酶、乙醇脫氫酶產乙醇，或是在好氧條件下，最終通過三羧酸循環(TCA)及呼吸鏈徹底氧化成CO2 (ffalfridsson et al. , 1995)。目前已知至少22種酵母能轉化D-木糖成乙醇,但是只有幾種酵母菌(如Brettanomyces naardenensis,休合塔假絲酵母(Candida shehatae),Candida tenuis,嗜鞋管囊酵母(Pachysolen tannophilus),Pichia segobiensis,樹干畢赤酵母(Pichia stipitis))能產生較多的乙醇。其中研究較為深入的只有三種酵母，即休合塔假絲酵母、嗜鞣管囊酵母、樹干畢赤酵母。但這些酵母的乙醇耐受性比較低，或者乙醇發酵能力還不夠高，使它們的應用受到限制。與之相對應，細菌和一些真菌通過木糖異構酶(XI)體系進行木糖代謝和發酵。與木糖的還原氧化體系不同，木糖異構酶體系通過異構酶將木糖直接變成木酮糖。在這個過程中無需輔酶來氧化還原，在厭氧條件下利用木糖不會產生還原力的不平衡(Hahn-Hagerdal et al.，2007)。這個體系主要存在細菌中，在少數低等真菌中也存在(Kuyper et al. , 2003) 能夠發酵木糖產乙醇的細菌有 Bacillus macerans, Bacillussubtil is, Clostridium thermoaceticum等菌株。但這些細菌由于乙醇產率、乙醇耐受性、副產物及抗污染能力的問題，而在應用上受到限制。由上所述，無論是酵母菌、細菌還是真菌，其野生型利用并發酵木糖生產乙醇能力均有限。工程酵母中多采用氧化還原體系。其中以釀酒酵母為多(Jeppsson et al. , 2003 ；Jin and Jeffries,2003 ；Liu et al. ,2005 ；Matsushika et al. ,2008 ；Tantirungkij etal.，1993 ;Wang et al.，2004)。由于木糖還原酶的輔酶為偏好NADPH，而木糖醇脫氫酶的輔酶為偏好NAD+，這就導致采用這個體系在厭氧條件下酵母細胞內的還原力不平衡，使大量的木糖醇不能被氧化而累積，影響木糖的發酵(Jeffries, 2006),導致木糖轉化成乙醇的效率降低，而且會有大量副產物木糖醇的積累。而木糖異構酶體系理論上可以解決此問題。但是實際上，仍然會有木糖醇甚至甘油、乙酸等副產物的積累。
最近，木糖異構酶體系也取得了一些突破。研究人員通過轉入來源于厭氧真菌Piromyces sp. E2的木糖異構酶得到了一株TMB202的釀酒酵母，有較好的乙醇得率(O. 42g/g D-木糖)，但是有木糖醇(2. 8mM)副產品；最近，日本的一個研究組將來自瘤胃真菌Orpinomyces的木糖異構酶在釀酒酵母中表達成功,取得了類似的結果(O. 48g/g D-木糖)(Madhavan et al. , 2009 ；Madhavan et al. , 2009),但是木糖醇積累達 2. 83g/L,甘油積累最高達2. 05g/L。Kondo研究組把木糖異構酶體系導入釀酒酵母中，乙醇得率為理論值的61.9%，如同時敲除了宿主自身的一個編碼非特異性醛糖還原酶基因(GRE3基因)，木糖消耗量和乙醇產量比敲除前提高了一倍以上(Tanino et al.，2010)，不過仍然有O. 51g/L木糖醇和2. 20g/L甘油產生。并且，目前這些通過異構酶路徑的酵母都不具有在較高溫度(>42°C)下進行發酵的能力，而且仍然都有較多的副產物例如木糖醇、甘油等產生。這都是需要解決的問題。在高溫下發酵將帶來以下優勢1.降低發酵中的冷卻費用；2.提高以淀粉、纖維素等生物質為原料的同步糖化發酵(SSF)溫度，促進糖化，減少在酶上的費用；3.降低污染。發酵的溫度的提高可以抑制許多雜菌的污染。據Akada統計，采用淀粉為材料的3萬噸規模的乙醇企業，如果發酵溫度上升5°C，可以節約3萬美元/年的降溫費用。同步糖化過程中，如果在40°C糖化可以比在32°C糖化節省50%在酶上的花費(25萬美元/年)(Abdel-Banat et al.，2010)，另外由于污染帶來的乙醇發酵得率急劇下降的損失不好估算，但是在260噸的發酵罐中因污染被迫重新發酵的代價是5萬美元。除此之外，高溫發酵可以促進發酵后的處理如提高蒸餾效率，降低蒸餾費用。Dmytruk等曾經嘗試在能夠耐熱的多形漢遜酵母(Hansenula poIymorpha)中通過表達木糖異構酶構建能夠在高溫下發酵木糖的工程菌株，但是效果很差，消耗80g/I木糖培養基中的40g/l木糖，僅僅能夠得到1.03g/l(37°C )和O. 60g/l (48°C )的產量(Dmytruk et al 2008)。這說明，構建能夠在較高溫度下發酵的木糖發酵的酵母,不是僅僅通過在耐熱酵母中表達木糖還原酶等酶的基因就可以成功的。本發明米用K. marxianus 也是一種 GRAS (general regarding as safe)酵母，廣泛地在乳制品、葡萄酒發酵制造中存在，對環境、動物及人類是安全的微生物。K. marxianus有很高的代謝多樣性，能利用多種工業上的底物糖類生長發酵(Nonklang et al.，2008)。K. marxianus能夠利用木糖在較高的溫度下生長(Banat and Marchant, 1995);具有能利用多種廉價底物、耐熱、高生長率等特點。在木質纖維素的同步糖化和發酵過程(SSF)中，大多數發酵是采用釀酒酵母在中溫進行(25-37°C )，而商業化纖維素酶半纖維素酶的最適溫度多為48-50°C左右，采用耐熱酵母在較高溫度(42-50°C )下發酵更有利于纖維素酶半纖維素酶發揮水解能力，促進對木質纖維素的利用，提高糖化與發酵同步反應的效率(Fonseca et al. ,2008)。耐熱酵母K. marxianus，利用葡萄糖在30°C可以達到與釀酒酵母同等的發酵能力，在高溫條件下(45 °C ), K. marxianus在發酵乙醇上有絕對的優勢(Banat andMarchant, 1995 ；Nonklang et al. , 2008) 雖然有一些 K. marxianus 菌株能直接發酵木糖產乙醇(Banat and Marchant, 1995 ；Banat et al. , 1996 ；Margaritis and Bajpai, 1982 ；Wilkins et al. , 2008),但是其乙醇的產率較低。Margaritis等報道K. marxianus在35°C，從 20g/l 木糖發酵產 5. 6g/l 乙醇(Margaritis and Bajpai, 1982);而 Banat 等采用K. marxianus 在 45°C從 10g/l 木糖發酵產 O. 8-1. 2g/l 乙醇(Banat and Marchant, 1995 ；Banat et al. , 1996),在4CTC產 2. 08g/l 乙醇(Wilkins et al. , 2008)。這說明 K. marxianus中天然存在著釀酒酵母不具有的利用木糖并發酵的代謝路徑，但利用木糖發酵的能力還不·夠高，尤其是在較高溫度下效率很低。
發明內容
本發明通過敲除K. marxianus的木糖氧化還原體系，引入木糖異構酶體系,成功構建了在高溫下利用和發酵木糖的工程菌K. marxianus YRL005。該工程菌解決了之前耐熱酵母在高溫下木糖發酵能力低的問題，乙醇產量大幅度提高，而且與之前的釀酒酵母體系相比沒有木糖醇、甘油的產物積累。本發明通過在耐熱酵母中高效表達的木糖異構酶，構建通過木糖異構酶代謝路徑在較高溫度(> 42°C )下能夠利用和發酵木糖的耐熱酵母菌株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus);本發明對馬克斯克魯維酵母中木糖代謝的還原氧化路徑中導致還原力不平衡的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因(Xyll和Xyl2)進行敲除，再將密碼子優化后的木糖異構酶基因的密碼子進行優化、后在上述雙基因敲除的耐熱酵母中表達，構建了對木糖的利用和發酵大幅度改良，能夠在較高溫下利用木糖發酵的耐熱工程酵母。構建的酵母能夠在高溫下利用木糖生長和發酵；本發明耐熱工程菌株還可以利用玉米芯水解液中的木糖進行發酵(圖I)。本發明通過敲除馬克斯克魯維酵母木糖代謝路徑中將木糖轉化為木酮糖的木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因，并將在釀酒酵母中表達的木糖異構酶基因的密碼子進行優化后在上述雙基因敲除的耐熱酵母中表達，通過馴化，獲得一株對木糖的利用和發酵有大幅度改良，并能夠在較高溫下發酵的耐熱工程酵母。具體地，本發明包括以下內容I. 一種木糖發酵的耐熱工程酵母菌株，其以敲除了木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因的耐熱酵母馬克斯克魯維酵母菌株作為宿主，并將含有密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體轉化到所述宿主中。2.第I項的耐熱工程酵母菌株，其中所述密碼子優化后的木糖異構酶基因的序列如 SEQ ID NO :1 所示。3.第I項的耐熱工程酵母菌株，其中通過對在野生型馬克斯克魯維酵母菌株NBRC1777的基礎上敲除了磷酸核糖基鄰氨酸苯甲酸異構酶基因(TRP1基因)、5’-乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因(URA3基因)、3_異丙基蘋果酸脫氫酶基因(LEU2基因)的菌株YHJ010進行木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因的敲除并進一步敲除其中轉入的選擇標記基因5’ -乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因從而獲得所述宿主。4.第I項的耐熱工程酵母菌株，其中所述宿主為YRL002。5. 一種木糖發酵的耐熱工程酵母菌株的馴化菌株，其使用第1-4項中任一項的耐熱工程酵母菌株經過馴化步驟而獲得，其保藏號為=CGMCC 6389。6. 一種制備第1-4項中任一項的耐熱工程酵母菌株的方法，其包括以下步驟通過按照馬克斯克魯維酵母中密碼子進行優化獲得密碼子優化后的木糖異構酶 基因;構建含有所述密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體；對在野生型馬克斯克魯維酵母菌株NBRC1777的基礎上敲除了磷酸核糖基鄰氨酸苯甲酸異構酶基因(TRP1基因)、5’_乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因(URA3基因)、3_異丙基蘋果酸脫氫酶基因(LEU2基因)的菌株YHJ010進行木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因的敲除，并進一步敲除其中轉入的選擇標記基因5’-乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因從而獲得宿主；和將所述含有密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體轉化到所述宿主中，從而獲得耐熱工程酵母菌株。7. 一種制備第5項的馴化菌株的方法，其包括以下步驟通過按照馬克斯克魯維酵母中密碼子進行優化獲得密碼子優化后的木糖異構酶基因;構建含有所述密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體；對在野生型馬克斯克魯維酵母菌株NBRC1777的基礎上敲除了磷酸核糖基鄰氨酸苯甲酸異構酶基因(TRP1基因)、5’_乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因(URA3基因)、3_異丙基蘋果酸脫氫酶基因(LEU2基因)的菌株YHJ010進行木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因的敲除，并進一步敲除其中轉入的選擇標記基因5’ -乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因從而獲得宿主；將所述含有密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體轉化到所述宿主中，從而獲得耐熱工程酵母菌株；和對所獲得的耐熱工程酵母菌株進行馴化。8.第5項的馴化菌株用于通過木糖發酵產生乙醇的應用。9.第5項的馴化菌株用于利用玉米芯水解物發酵產生乙醇的應用。優點和積極效果本發明中所得到的菌株YRL005有著與和野生型菌株NBRC1777(購自日本技術評價研究所生物資源中心(NITE Biological Resource Center, National Institute ofTechnology and Evaluation(NITE), JAPAN))及 NBRC1777 衍生的色氨酸、亮氨酸和尿U密啶的營養缺陷型菌株YHJ010 (即在K. marxianus野生型菌株NBRC1777的基礎上敲除了磷酸核糖基鄰氨酸苯甲酸異構酶基因(TRPl)，5’ -乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因(URA3)，3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因(LEU2)，Hong et al，2007)相當的利用木糖生長的能力，在37°C合成培養基中，它的0D600可達I. 3 ;而在相對較高的溫度42°C下及YPX培養基下，YRL005的0D600可達15。而很多釀酒酵母及細菌在這個溫度，已經不能正常生長。并且本發明的YRL005不僅能利用木糖生長，還能在厭氧發酵的條件下利用木糖生產乙醇。在50g/l的YPX培養基下，消耗30. 49g/l的木糖并產生了 11. 67g/l的乙醇，該乙醇產量在已知的耐熱酵母中處于領先地位。本發明還在對農業廢棄物中的木糖利用進行了測試。在利用玉米芯水解物發酵的應用中，同樣能產生乙醇(消耗了 19. 05g/l的木糖生成7. 93g/l乙醇)。本發明中的YRL005菌株在42°C以上發酵，沒有木糖醇、甘油等副產物，僅有非常少量副產物醋酸(O. 066g/l)的生成。所以本發明的YRL005菌株不僅在較高溫度(> 42°C )條件下有比其他酵母強的利用木糖發酵能力，而且具有比其他酵母更優秀的特點-副產物極少。
圖I.本發明的研究過程； 圖2.木糖的兩種代謝路徑；圖3.馴化菌株在木糖合成培養基下的生長情況(37°C，250rpm)；圖4.馴化菌株在高溫營養培養基下的生長情況(42°C，250rpm)；圖5.Α.42 發酵時木糖的消耗及乙醇的產生，B.45°C發酵時木糖的消耗及乙醇的產生；和圖6. 42°C發酵玉米芯水解物時木糖的消耗及乙醇的產生。保藏說明本發明的菌株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus) YRL005已經于2012年8月10日保存在中國微生物菌種保藏管理委員會的普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 6389。
具體實施例方式試劑和菌株本發明中的所有試劑均是市場購買的試劑級以上試劑，其中YNB (酵母氮源基礎)、木糖、葡萄糖、酵母基本氮源、酪氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、膠回收試劑盒以及所有的限制性內切酶均來源于上海生工生物工程公司。PrimeSTAR HS DNA聚合酶，SolutionI連接酶以及PMD18-T載體購自于大連寶生物公司。PfuDNA聚合酶試劑盒由上海申能博彩提供。大腸桿菌Escherichia coli XLlO gold菌株作為DNA操作時使用的宿主菌，包含100 μ g/ml氨節青霉素的Luria-Bertani (LB)培養基用作培養E. coli。木糖合成培養基(YNB,木糖20g/l,酵母基本氮源6. 7g/l,亮氨酸30mg/ml,尿卩密唳20mg/ml,酪氨酸20mg/ml)主要用于馴化。質粒YEGAP，YEUGAP，pKMURA3由本實驗室保存(Hong et al.，2007)。Yro培養基(酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，葡萄糖20g/l)用于酵母的前培養。YPX (酵母提取物10g/l，蛋白胨20g/l，木糖20g/l (或50g/l))用于發酵培養基。實施例I菌株的制備I.優化 密碼子真菌Orpinomyces. sp (瘤胃真菌)來源的XI密碼子在酵母中不一定是最優密碼子，如果直接采用XI原始基因可能會導致表達量低甚至難以表達。在不改變氨基酸序列前提下，采用K. marxianus酵母中密碼子進行優化，并在兩端加上克隆用引物。獲得的密碼子優化后的木糖異構酶基因序列長度1334bp，如SEQ ID NO 1所示。2.合成XI某閔將XI基因分為4個片段Fl，F2，F3，F4，其長度分別為Fl (356bp)，F2 (354bp)，F3(354bp)，F4(354bp)。序列記錄為 SEQ ID NOs :2_5。每個片段通過Tmprime工具(http://prime, ibn. a~star. edu. sr/)切割成11根寡聚核苷酸(其中正鏈(A鏈)6根,互補鏈(C鏈)5根)，共得至IJ 44根寡聚核苷酸序列(序列分別記錄為，Fl SEQ ID NOs :6_16，F2 =SEQID NOs : 17-27，F3 SEQ ID NOs :28-38, F4 SEQ ID NOs :39-49)并委托上海生工生物工程公司合成。將每根片段所合成的11根寡聚核苷酸稀釋，并分別取出lpmol，使用PfuDNA聚合酶試劑盒進行PCR assembling(基于聚合酶鏈式反應的片段拼裝)，得到的產物作為模板， 使用片段引物(4個片段的引物分別為SEQ ID NOs :50-57)進行擴增，此時即得到片段，其 過程以Fl為例顯示如下(片段F2、F3和F4使用與Fl相同的酶體系和反應程序，區別僅在于它們使用不同的引物，分別為SEQ ID NOs 52-53 ;54-55 ;和56-57)。PCR assembling 體系
權利要求
1.一種木糖發酵的耐熱工程酵母菌株，其以敲除了木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因的耐熱酵母馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)菌株作為宿主,并將含有密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體轉化到所述宿主中。
2.權利要求I的耐熱工程酵母菌株，其中所述密碼子優化后的木糖異構酶基因的序列如 SEQ ID NO 1 所示。
3.權利要求I的耐熱工程酵母菌株，其中通過對在野生型馬克斯克魯維酵母菌株NBRC1777的基礎上敲除了磷酸核糖基鄰氨酸苯甲酸異構酶基因、5’ -乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因、3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因的菌株進行木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因的敲除，并進一步敲除其中轉入的選擇標記基因5’ -乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因而獲得所述宿主。
4.權利要求I的耐熱工程酵母菌株，其中所述宿主為YRL002。
5.一種木糖發酵的耐熱工程酵母菌株的馴化菌株，其使用權利要求1-4中任一項的耐熱工程酵母菌株經過馴化步驟而獲得，其保藏號為=CGMCC 6389。
6.一種制備權利要求1-4中任一項的耐熱工程酵母菌株的方法，其包括以下步驟 通過按照馬克斯克魯維酵母中密碼子進行優化獲得密碼子優化后的木糖異構酶基因； 構建含有所述密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體； 對在野生型馬克斯克魯維酵母菌株NBRC1777的基礎上敲除了磷酸核糖基鄰氨酸苯甲酸異構酶基因、5’ -乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因、3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因的菌株進行木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因的敲除，并進一步敲除其中轉入的選擇標記基因5’ -乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因從而獲得宿主；和 將所述含有密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體轉化到所述宿主中，從而獲得耐熱工程酵母菌株。
7.一種制備權利要求5的馴化菌株的方法，其包括以下步驟 通過按照馬克斯克魯維酵母中密碼子進行優化獲得密碼子優化后的木糖異構酶基因； 構建含有所述密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體； 對在野生型馬克斯克魯維酵母菌株NBRC1777的基礎上敲除了磷酸核糖基鄰氨酸苯甲酸異構酶基因、5’ -乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因、3-異丙基蘋果酸脫氫酶基因的菌株進行木糖還原酶基因和木糖醇脫氫酶基因的敲除，并進一步敲除其中轉入的選擇標記基因5’ -乳清核苷酸磷酸脫羧酶基因從而獲得宿主； 將所述含有密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體轉化到所述宿主中，從而獲得耐熱工程酵母菌株；和 對所獲得的耐熱工程酵母菌株進行馴化。
8.權利要求5的馴化菌株用于通過木糖發酵產生乙醇的應用。
9.權利要求5的馴化菌株用于利用玉米芯水解物發酵產生乙醇的應用。
全文摘要
本發明涉及一種木糖發酵的耐熱工程酵母菌株，其以敲除了木糖還原酶和木糖醇脫氫酶基因的耐熱酵母菌株馬克斯克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)作為宿主，并將含有密碼子優化后的木糖異構酶基因的耐熱酵母表達載體轉化到所述宿主中。本發明還涉及所述木糖發酵的耐熱工程酵母菌株的馴化菌株；以及它們的制備方法和應用。
文檔編號C12N1/19GK102876595SQ20121039090
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月16日 優先權日2012年10月16日
發明者洪泂, 汪榮亮, 高曉連 申請人:中國科學技術大學