一管式共用引物法檢測同一突變位點不同突變類型的制作方法
【專利摘要】本發明基于LAMP（環介導恒溫擴增檢測）技術的一管式檢測同一突變位點不同突變類型的方法或理論，該方法可以在同一個核酸檢測反應管中同時檢測同一個突變位點的不同突變堿基。LAMP設計需要4-6個引物，通過在環介導等溫擴增檢測試劑盒探針設計，對于同一突變點的不同突變類型，只改變覆蓋突變點處的引物，覆蓋其它位點的引物不變為共用引物（加入量也不變），這樣保證了，覆蓋突變點的引物與共用引物之間不發生交叉反應，只需要驗證覆蓋同一突變點不同突變類型處的引物之間是否發生交叉反應即可，那么覆蓋此處引物只有一到兩個堿基不同，也不會發生反應，這就是本檢測方式的理論基礎。此方法不僅可以降低成本、提高效率，更重要的是可以極大的提高對多突變類型同時存在的檢測靈敏度。
【專利說明】一管式共用引物法檢測同一突變位點不同突變類型
[0001]
【技術領域】
[0002]一管式共用引物法檢測同一突變位點不同突變類型，此發明可以應用于環介導等溫擴增檢測【技術領域】，結核桿菌、乙型肝炎病毒、HIV病毒、腫瘤耐藥等檢測。
【背景技術】
[0003]環介導等溫擴增法(loop-mediatedisothermal amplification , LAMP)是2000年開發的一種新穎的恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(63 °C左右)保溫30 - 60分鐘，即可完成核酸擴增反應。與常規PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環、電泳及紫外觀察等過程。LAMP是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能優于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現現場高通量快速檢測，檢測成本遠低于熒光定量PCR。
[0004]目前在行業應用最廣范的耐藥檢測是藥敏實驗和基因芯片技術，藥敏實驗耗時太長，基因芯片雖然能實現高通量檢測但是制備成本及檢測費用均較昂貴，靈敏度低，不宜大面積推廣。因此急需一種檢測成本低、靈敏度高切實可行的方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是:提供一種同時一管式檢測同一突變位點不同突變類型的環介導等溫擴增檢測方法。
[0006]本發明的技術方案是:該方法可以在同一個核酸檢測反應管中同時檢測同一個突變位點的不同突變堿基。LAMP設計需要4-6個引物，通過在環介導等溫擴增檢測試劑盒探針設計，對于同一突變點的不同突變類型，只改變覆蓋突變點處的引物，覆蓋其它位點的引物不變(加入數量也不變)，這樣保證了，突變點的引物與其它點位的引物之間不發生交叉反應，只需要驗證覆蓋同一突變點不同突變類型處的引物之間是否發生交叉反應即可，那么覆蓋此處這引物只有一到兩個堿基不同，也不會發生反應，這就是本檢測方式的理論基礎。
[0007]實施例1:
結核分支桿菌耐 利福平(RFP)藥物核苷酸526點突變有如下幾種情況:
【權利要求】
1.本發明基于LAMP(環介導恒溫擴增檢測)技術的一管式檢測同一突變位點不同突變類型的方法或理論，其特征在于:通過在環介導等溫擴增檢測試劑盒探針設計，對于同一突變點的不同突變類型，只改變覆蓋突變點處的引物，覆蓋其它位點的引物不變(加入數量也不變)，這樣保證了，突變點的引物與其它點位的引物之間不發生交叉反應，只需要驗證覆蓋同一突變點不同突變類型處的引物之間是否發生交叉反應即可，那么覆蓋此處這引物只有一到兩個堿基不同，也不會發生反應，這就是本檢測方式的理論基礎。
2.根據權利I要求我們保護的是LAMP技術一管式檢測同一突變位點不同突變類型，是我們首次提出基于LAMP技術對不同基因類型的檢測，只要是一管式檢測不同基因突變類型都在我們的保護范圍。
3.我們同時保護也是LAMP技術一管式檢測同一突變位點不同突變類型的理論和方法。
4.根據權利要求1所述本技術也可以向檢測不同突變位點延伸，本技術是同時檢測多個突變位點的基礎，多個位點引物設計除覆蓋突變位點的其它引物盡量設計共用引物，避免交叉反應。
5.此方法主要應用于各種突變耐藥基因(如肺結核、乙肝、艾滋病等)的檢測，同時也可用于同一位點是否存在不同有 效基因形式的檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103725769SQ201210390906
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2012年10月16日 優先權日:2012年10月16日
【發明者】王德國, 曲海濤, 張文超 申請人:哈爾濱德歌生物科技有限公司