專利名稱：高產木質纖維素降解酶的鏈霉菌人工鋅指蛋白突變菌株及其獲得方法
技術領域：
本發明涉及一種高產木質纖維素降解酶的鏈霉菌人工鋅指蛋白突變菌株及其獲得方法，屬于微生物生物技術領域。
背景技術：
基因表達調控的多種生物過程，如發育、分化和疾病等都受細胞內轉錄因子的調節完成。為實現細胞代謝的定向調控，可使用人工設計的轉錄因子，定向調控細胞內相關革巴基因的表達。結合在特定基因啟動子區域的人造轉錄因子(Artificial TranscriptionFactor, ATF)可以實現生物體內靶基因的表達調節，并且可根據需要實現不同強度的人為調節。人工轉錄因子的結構包括一個DNA結合域，一個轉錄調控域或效應區。其中DNA結合 域負責結合特定的目標基因的啟動子，而效應域可以實現上調或下調不同靶基因的表達。因此，可以設計人工的DNA結合域和效應區，創建所需要的人工轉錄因子。鋅指蛋白(Zinc finger protein, ZFP)是一類重要的轉錄因子,是指具有鋅指結構的轉錄調控因子，在真核生物的胚胎發育、細胞分化、增強抗逆性、基因的表達調控等方面有重要作用。鋅指結構是指在調節蛋白上的一個或多個依賴鋅離子的DNA結合域，這個區域是由含有幾個Cys殘基的一小段氨基酸序列構成，其利用與鋅離子結合進行自我折疊從而形成穩定的短的手指狀結構。在鋅指結構中，組氨酸和(或)半胱氨酸通過與鋅的不同排列組合和疏水作用來組成并維持穩定的四面體結構。鋅指結構既能與RNA和DNA結合，又能與DNA-RNA雙鏈分子以及同類蛋白結合，在轉錄和翻譯水平上調節和控制基因表達，因此在人工轉錄因子的構建中，鋅指蛋白被認為是最有前途的DNA結合域。不同的蛋白結構對應不同的功能，根據鋅指蛋白保守結構域的差異，可以將其分為C2H2 (Cys2His2)型、C4(Cys4)型和C6 (Cys6)型3個類群。C2H2型鋅指是經典型鋅指，是目前研究的最多、分布最廣泛的鋅指。酵母基因組中發現有55個鋅指蛋白，其中31個屬于C2H2型鋅指。這些蛋白調節著胞內的眾多代謝途徑，包括糖的代謝、氨基酸代謝、呼吸作用、氮源利用以及對外界壓力響應等。目前，人工鋅指蛋白文庫技術已經成功應用于多個領域，篩選到多種優良表型，例如，細胞分化，逆境抗性，表面抗原及新型藥物篩選。該技術與傳統的過表達和敲除方法相t匕，細胞的致死率小，重復性好，適用范圍從真核細胞到原核細胞。韓國漢城大學學者(參考文獻見Park KS, et al. , NatureBiotechnology, 2003，21:1208-1214)構建了人工鋅指蛋白文庫，轉入酵母菌株中，獲得了抗熱激性和抗滲透性的突變菌株；轉入大腸桿菌菌株內，獲得了抗熱激性，耐冷性和抗滲透性的表型，此外還獲得了丁醇耐受性菌株，但目前還未有報道人工鋅指蛋白文庫技術在生物酶生產菌中的應用。在能源匱乏的當今社會，纖維素乙醇作為第二代生物燃料受到了廣泛的重視，而纖維素乙醇生產的瓶頸正是如何高效的降解資源豐富的纖維素為可發酵糖。纖維素酶的生產成本目前仍然較高，限制了纖維素乙醇的大規模工業化生產，因此需要開發提高生產菌纖維素酶活的方法。
發明內容
為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種高產木質纖維素降解酶的鏈霉菌人工鋅指蛋白突變菌株及其獲得方法，從海洋放線菌這一獨特的菌種出發，篩選到有羧甲基纖維素酶(CMCase)和木聚糖酶酶活的菌株，利用人工鋅指蛋白文庫這一新穎的全局細胞轉錄因子，來調控鏈霉菌纖維素酶的表達，最終篩選到纖維素降解酶酶活提高的突變菌株。本發明采用的技術方案是一株高產木質纖維素降解酶的鏈霉菌人工鋅指蛋白突變菌株Streptomyces sp,所述菌株的登記入冊編號為CGMCC No. 6428,保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2012年08月13日。所述鏈霉菌人工鋅指蛋白突變菌株，其基因組中含有能夠提高纖維素降解酶活性 的人工鋅指蛋白基因，與不含有人工鋅指蛋白基因的對照菌株相比，該菌株的木聚糖酶活性提聞11%，而且達到最聞酶活的時間提如兩天，最聞酶活約為42. 8U/mL。所述的高產木質纖維素降解酶的鏈霉菌人工鋅指蛋白突變菌株的獲得方法為設計人工鋅指蛋白表達載體，并通過遺傳轉化或者結合轉移手段導入到受體細胞中，篩選酶活性提高的微生物突變體。具體步驟如下(I)用表達載體，如鏈霉菌表達載體PIB139連接插入片段約為800bp的鋅指蛋白基因，構建人工鋅指蛋白表達載體文庫，人工鋅指蛋白基因可為文獻報道的人工合成基因(Nature Biotechnology, 2003 (21) : 1208-1214)，也可為細胞內源的鋅指蛋白基因通過隨機突變得到的基因；(2)將所獲得的文庫結合轉移或轉化至微生物酶生產菌種，如海洋鏈霉菌中，平板涂布，經鑒定文庫合格后挑取平板上的單克隆于選擇培養基，如木糖平板中培養；(3)選擇酶活提高的突變體，如透明圈更大的突變體進行再次的酶活驗證，獲得酶活提高的突變體。本發明的有益效果是本發明中的技術方法可以應用于工業酶生產菌株的基因工程改造，提高菌株產酶性能；本發明中的突變菌株木聚糖酶生產能力較強，是一株有望應用于工業生產的木聚糖酶生產菌株。
圖1是鋅指蛋白文庫DNA片段PCR產物瓊脂糖電泳檢測結果，箭頭指示人工鋅指蛋白基因片段。圖2是鋅指蛋白文庫質粒圖譜。圖3是鋅指蛋白文庫突變菌株羧甲基纖維素酶降解能力比較結果。圖4是鋅指蛋白文庫個別突變菌株液體發酵生產木聚糖酶結果。
具體實施例方式實驗材料和試劑
1.菌株出發菌株鏈霉菌M8由本發明人從大連小平島海泥樣品中分離獲得。2.生化試劑木聚糖山毛櫸木聚糖、樺木木聚糖、燕麥木聚糖(美國SIGMA公司)；竣甲基纖維素納(CMC-Na, Solarbio公司)Remazol Brilliant Blue (RBB,美國 SIGMA 公司)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(
測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；TaKaRa rTaq (大連寶生物工程有限公司)；IOxPCR Buffer (大連寶生物工程有限公司)；dNTP Mixture (大連寶生物工程有限公司)；E. Z. N. A. TM瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA, USA)Xba1、EcoRI限制性連接酶，DNA連接酶(大連寶生物工程有限公司)。提取菌株基因組DNA試劑洗滌液50mmol/LTris, 25mmol/L EDTA, 0. 1%PVP, pH=8. 0。裂解液50mmol/LTris, 25mmol/L EDTA,1. 2%PVP, 3%SDS。抽取液10mmol/LTris, lmmol/L EDTA, 0. 3mmol/L NaAC, pH=8. O0提取液苯酚氯仿異戊醇=25:24:1。TE 緩沖液50mmol/L Tris, pH=8. O。DNS試劑配方甲液溶解6. 9g結晶酚于15. 2mL 10%的NaOH中，用蒸餾水稀釋至69mL，再加入
6.9g NaHSO3 ；乙液稱取255g酒石酸鉀鈉，加入至300mL 10%Na0H中，再向其中加入880mLl%3, 5- 二硝基水楊酸溶液；將甲乙兩液相混即得到黃色DNS試劑，貯存于棕色試劑瓶中。在常溫下，放置7-10天后使用，半年內有效。3.培養基(每IL體積計算)Bennett固體培養基葡萄糖IOg,蛋白胨2g,酵母粉lg，牛肉膏Ig,瓊脂20g,pH7. O。ISP4 固體培養基可溶性淀粉 10g, K2HPO4 3H20 lg, MgSO4 7H20 lg, NaCl lg,(NH4) 2S04 2g, CaCO3 2g, FeSO4 7H20 lmg, MnCl2 lmg, ZnSO4 7H20 lmg, pH 7. ORBB-木聚糖
固體培養基含有0. 2%RBB-木聚糖的ISP4固體培養基。剛果紅固體培養基=(NH4)2SO4 2g ；MgS04 0. 5g ;K2HPO4 Ig ；NaCl 0. 5g ；CMC-Na20g ;瓊脂20g。將培養過的平板置于lg/L的剛果紅溶液中I小時，再用lmol/L的NaCl溶液沖洗至流出液為無色。TSB液體培養基胰蛋白胨17g，大豆蛋白胨3. 0g，葡萄糖2. 5g, K2HPO4 *3H202. 5g，NaCl 5g, pH 7. 0。MS固體培養基甘露醇20g，豆粉20g，瓊脂20g。木聚糖酶產酶培養基=K2HPO4 3H201. llg, KH2PO4 3. 65g，(NH4)2NO3 3g，MgSO4 7H202. 2g，CaCl2 0. 3g，葡萄糖1. 5g，蛋白胨2. 5g，牛肉膏3g，山毛櫸木聚糖IOg, pH6.50說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。實施例1 海洋鏈霉菌鋅指蛋白文庫構建本發明涉及的人工鋅指為Cys2His2型鋅指，構建方法參考NatureBiotechnology, 2003, 21:1208-1214，包含三個鋅指結構域，由韓國ToolGen公司提供；表達載體骨架為PIB139，構建方法參考 J MolMicrobiol Biotechnol4 (4) : 417-426，由 pSET152 中插入 ermE強啟動子構成。鋅指蛋白文庫中，人工鋅指部分包含鋅指結構域與GAL4轉錄因子激活域，其示意圖如圖2。通過改變人工鋅指的序列，可以獲得多種含有人工鋅指的DNA片段，這些片段可以人工合成，也可以通過突變方法獲得。本發明中的鋅指蛋白DNA片段通過聚合酶鏈式反應(PCR)從酵母鋅指蛋白文庫的pRS316-CYC-lib-Gal4載體上獲得，并通過EcoRI和XbaI的位點連接入pIB139表達載體。該載體的表達啟動子為ermE，抗生素選擇標記為安普霉素(Apramycin)01.鋅指蛋白與轉錄激活域DNA片段的獲得鋅指蛋白與轉錄激活域DNA的PCR弓丨物序列Pl :5’ -ACGGTCTAGAGTGTGCTGCAATTCT-3’P2 :5， -ACTTGAATTCTGCGGCCCACTAGAT-3，PCR反應條件如表I所示表I PCR反應條件
權利要求
1.一株高產木質纖維素降解酶的鏈霉菌人工鋅指蛋白突變菌株(Streptomyces sp),其特征在于所述菌株的登記入冊編號為CGMCC No. 6428，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期為2012年08月13日。
2.根據權利要求1所述的高產木質纖維素降解酶的鏈霉菌人工鋅指蛋白突變菌株的獲得方法，其特征在于所述獲得方法步驟為 (1)用表達載體，構建人工鋅指蛋白表達載體文庫； (2)將所獲得的文庫結合轉移或轉化至微生物酶生產菌種，經鑒定文庫合格后挑取單克隆于選擇培養基； (3)選擇酶活提高的突變體。
全文摘要
一種高產木質纖維素降解酶的鏈霉菌人工鋅指蛋白突變菌株及其獲得方法，屬于微生物生物技術領域。該菌株于2012年8月13日保藏于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC No.6428。與不含有鋅指蛋白的野生型出發菌株相比，該菌株的木聚糖酶活性提高11%，而且達到最高酶活的時間提前兩天，最高酶活約為42.8U/mL。本發明還涉及獲得該菌株的方法，利用該方法可提高多種生物酶的生產，即利用含有人工鋅指蛋白基因的文庫，通過遺傳轉化或結合轉移等方法將該文庫導入到各種生物酶生產菌株，并篩選酶活提高的突變體。
文檔編號C12N1/21GK102994437SQ201210436360
公開日2013年3月27日 申請日期2012年11月6日 優先權日2012年11月6日
發明者趙心清, 俊金秀, 白鳳武 申請人:大連理工大學