專利名稱：準噶爾無葉豆EsDREB基因的用途的制作方法
準噶爾無葉豆EsDREB基因的用途技術領域
本發明屬于作物遺傳育種領域，具體涉及到準噶爾無葉豆中轉錄因子EsDREB基因的功能和在植物抗逆上的用途。具體的說涉及轉EsDREB基因的植物增強了對干旱脅迫， 高鹽脅迫，冷脅迫，熱脅迫的抗性。
背景技術：
干旱，鹽等非生物脅迫是限制植物生長發育和作物產量的主要因素，每年導致作物減產達50%以上。常規育種方法改良作物的抗逆性受到周期長、優異種質資源缺乏的限制。近年來的轉錄組學、蛋白組學和基因表達調控的研究初步揭示了植物干旱脅迫的作用分子機理。目前，利用分子手段分離脅迫相關基因用來提高植物的抗逆能力，已經成為植物抗逆分子生物學的研究熱點和植物抗逆基因工程重要的研究方向。
DREB 轉錄因子(Dehydration Responsive Element Binding protein),即干旱應答元件結合蛋白，屬于AP2/EREBP類基因家族，特異存在于植物中。DREB與抗逆基因啟動子區域中的DRE/CRT (dehydration-responsive element)順式作用兀件結合，其核心序 TACCGACAT，啟動下游一系列的有DRE順式作用元件的抗逆基因的表達，廣泛參與干旱、高鹽，熱等脅迫應答反應，從而能從整體上提高植物的綜合抗逆性。
自1994年Yamaguchi-Shinozaki從擬南芥中首次檢測到DRE作用的蛋白因子并命名為DREBl以來，DREB/CBF轉錄因子基因的克隆一直是植物分子生物學的熱點。目前已從擬南芥、水稻、玉米、小麥、黑麥、大豆、西紅菜，棉花，蘆薈等大量植物中分離并鑒定出調控干早、高鹽及低溫耐性的DREB基因，并利用這些基因得到了抗逆性增強的擬南芥、煙草、 油菜、西紅柿、小麥等轉基因植株。但目前關于DREB的研究主要集中于草本植物領域，對于木本植物研究較少。由于木本植物生命周期長，并且其抵御外界不良環境侵害的因素會多于草本植物，其分子機制應該也更為復雜。對木本植物DREB的研究主要以楊樹和桉樹為主。另外，有關DREB/CBF類抗逆境轉錄因子DREB的功能及轉錄調控的研究大部分來自模式植物擬南芥及經濟作物水稻，小麥等，而對自然界天然存在的抗逆能力極強的植物資源卻嘗試較少。實際上，植物中還存在大量的DREB基因及其家族尚待挖掘和研究。尤其從極端抗旱的超旱生木本資源植物中挖掘DREB基因并進行抗逆育種尚鮮見報道。而從本土抗逆植物資源中克隆抗逆相關基因并改良農作物不失為一種新的嘗試。因此，從本土超旱生荒漠植物中尋找新的DREB轉錄因子，在基因工程水平上培育抗干旱，耐低溫，耐高鹽等新的作物品種具有重要意義。
準噶爾無葉豆(Eremosparton songoricum(Litv. ) Vass.)系豆科無葉豆屬超旱生無葉灌木，僅片斷化分布于新疆古爾班通古特沙漠流動沙丘上，是典型的流沙先鋒植物。該種是我國的單屬種植物類群，西北荒漠植被中的標志性種，稀有種。由于長期生活在極端惡劣的流動沙丘環境中，沙漠干旱、少雨、大風、沙埋等環境塑造了準噶爾無葉豆抗旱的形態學及生理學特性，表現在該種為小半灌木，葉極端退化，以營養枝執行光合作用，故稱“無葉豆”;具有超強的根吸水能力以及細胞持水能力，并保持高效的光合能力。此外，長期的環境壓力使得該種具有抗旱，抗高溫，抗風蝕沙埋等抵抗多種非生物脅迫的能力，其體內必定蘊含著豐富的抗逆基因資源。準噶爾無葉豆作為天然抗逆性極強的典型荒漠沙生植物，開展該種的抗旱相關DREB轉錄因子基因的克隆，對于深入發利用抗逆基因資源，定向培育植物新品種均有重要價值。發明內容
本發明的目的是提供一種準噶爾無葉豆EsDREB基因的用途，該基因用于轉化植物，提高植物的多種非生物脅迫抗性，其中提高植物多種非生物脅迫抗性的方法是用準噶爾無葉豆EsDREB基因轉化目標植物，獲得轉基因植物。本發明用農桿菌介導的葉盤法將 EsDREB基因轉化到野生型煙草中，并研究其在煙草中的抗逆功能，為EsDREB基因在其它植物中的應用提供了很好的基礎。
本發明所述的一種準噶爾無葉豆EsDREB基因的用途，該基因用于轉化植物，提高植物的多種非生物脅迫抗性，其中提高植物多種非生物脅迫抗性的方法是用準噶爾無葉豆 EsDREB基因轉化目標植物，獲得轉基因植物，具體操作按下列步驟進行
a、用Kpn I和Pst I分別酶切pMD19-T-EsDREB質粒載體和植物真核表達空載體 PCAMBIA1301,回收，連接，轉化大腸桿菌細胞，經質粒PCR和雙酶切鑒定，將EsDREB基因構建到植物表達載體PCAMBIA1301中，得到重組質粒pCAMBIA1301_EsDREB ；
b、將步驟a中的重組質粒pCAMBIA1301_EsDREB導入農桿菌中，得到帶有重組質粒的農桿菌；
C、將步驟b帶有重組質粒的農桿菌用葉盤轉化法轉化目標植物；
d、目標植物轉基因陽性苗的鑒定；
e、利用轉基因目標植物的體系驗證EsDREB基因的抗逆功能。
所述基因為準噶爾無葉豆EsDREB基因的核苷酸序列
TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTA GGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATAAATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTT AGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCC GGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAA GGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGA GATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATG ATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACAAGTTTCCAATTTCTCTCAG CTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAAA CAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCATG AGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCAT
EsDREB基因的氨基酸序列
MSATCMHKLVKNHNKGDASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSR CNYRGVRQRTWGKWVAEIREPNRGNRLWLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASPA GSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGE⑶SGSGTSSSDPSLS。
所述多種非生物脅迫抗性為抗干旱脅迫，抗高鹽脅迫，抗冷脅迫，抗熱脅迫。
步驟d目標植物為煙草。
本發明所述的準噶爾無葉豆EsDREB基因的用途，該基因為準噶爾無葉豆EsDREB 基因，EsDREB基因其核苷酸序列
TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTA GGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATAAATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTT AGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCC GGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAA GGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGA GATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATG ATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACAAGTTTCCAATTTCTCTCAG CTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAAA CAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCATG AGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCAT
EsDREB基因氨基酸序列
MSATCMHKLVKNHNKGDASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSR CNYRGVRQRTffGKffVAEI REPNRGNRLWLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASP AGSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGE⑶SGSGTSSSDPSLS
本發明是在專利申請號201110377962. 5的基礎上進一步研究，以超旱生沙漠植物準噶爾無葉豆中的DREB轉錄因子基因EsDREB為研究對象，利用煙草體系對該基因功能進行了研究，證實了該轉錄因子基因具有抗干旱，抗高鹽，抗低溫和高溫脅迫的能力。特別珍貴的是，對于干旱和高鹽脅迫，轉基因煙草既提高了抗逆性，同時還保持了與沒有脅迫的煙草幾乎相等的生物量。這種不以抑制植物生長為基礎的提高植物多種抗逆性的基因在作物遺傳育種上有非常重要的應用價值。
本發明所述的準噶爾無葉豆EsDREB基因的用途，該基因適用于煙草、棉花、小麥或水稻等的抗干旱脅迫，抗高鹽脅迫，抗冷脅迫，抗熱脅迫。
圖I為本發明pCAMBIA1301-EsDREB植物表達載體構建示意圖。
圖2為本發明pCAMBIA1301_EsDREB質粒PCR電泳圖，其中M為分子量Maker DL2000 ;泳道I是沒有模板的PCR陰性對照；泳道2是空載質粒pCAMBIA1301的PCR結果； 泳道3-8是隨機挑選的pCAMBIA1301-EsDREB陽性轉化子。
圖3為本發明pCAMBIA1301_EsDREB雙酶切電泳圖，其中M為分子量Maker DL2000 ;泳道1-4是隨機挑選的陽性轉化子的雙酶切結果；泳道5是空載質粒pCAMBIA1301 的雙酶切結果。
圖4為本發明轉基因煙草鑒定的PCR電泳圖，其中M為分子量MakerDL2000 ;泳道 I是沒有模板的PCR陰性對照；泳道2-17是隨機挑選的待檢測轉EsDREB基因的煙草植株的DNA為模板的PCR結果；泳道16是以陽性轉化質粒pCAMBIA1301-EsBREB為模板的PCR結果。
圖5為本發明轉基因煙草鑒定的RT-PCR電泳圖，M為分子量MakerDL2000 ;泳道 I是沒有模板的RT-PCR陰性對照；泳道2-10是隨機挑選的待檢測轉EsDREB基因的煙草植株的cDNA為模板的RT-PCR結果；泳道11是陽性轉化質粒pCAMBIA1301_EsDREB為模板的 PCR結果。
圖6為本發明調控下游基因表達圖，干旱脅迫條件下(左圖)和鹽脅迫下(右圖)， 各個檢測的下游基因在野生型煙草，轉基因煙草株系下的脅迫前(Oh)和脅迫后(3h)各個基因的表達量結果。
圖7為本發明兩周大苗脅迫表型圖，每組圖片從左到右依次為脅迫前，脅迫后， 恢復正常生長后；每組圖片從上到下依次為野生型煙草幼苗，轉EsDREB基因的煙草株系 I (D6)，轉基因株系2 (D4)，其中，A組圖片沒有脅迫情況下，野生型和轉基因煙草脅迫前， 脅迫后和恢復后的生長情況組圖片是干旱脅迫下，野生型和轉基因煙草脅迫前，脅迫后和恢復后的生長情況；C組圖片是鹽脅迫情況下，野生型和轉基因煙草脅迫前，脅迫后和恢復后的生長情況；D組圖片是冷脅迫情況下，野生型和轉基因煙草脅迫前，脅迫后和恢復后的生長情況；E組圖片是熱脅迫條件下，野生型和轉基因煙草脅迫前，脅迫后和恢復后的生長情況。
圖8為本發明兩周大苗脅迫后生物量圖，每組圖片的左圖是各種生長情況下，野生型和轉基因煙草的形態指標(根長，根數量，葉片數)統計結果，右圖是相對應的生物量 (鮮重)數據，其中，A組圖片是沒有脅迫情況下的各項形態指標和生物量統計結果；往下依次為B組的干旱脅迫，C組的鹽脅迫，D組的冷脅迫，E組的熱脅迫的各項形態指標和生物量統計結果，I為形態，2為鮮重。
圖9為本發明兩周大幼苗脅迫后生理指標圖，比較了野生型植株和兩個轉基因株系在各種脅迫處理后脯氨酸，丙二醛和葉綠素含量的變化(總左至右)，其中A組圖片是沒有脅迫情況下的以上三種生理指標的比較結果；往下依次為B組的干旱脅迫，C組的鹽脅迫，D組的冷脅迫，E組的熱脅迫的各項生理指標結果，I為脯氨酸含量，2為丙二醛含量，3 為葉綠素含量。
圖10為本發明兩月大苗脅迫表型圖，從左到右依次為脅迫前，脅迫后和恢復2周后的野生型和轉基因株系間的表型圖；從上至下依次為干旱脅迫，鹽脅迫，冷脅迫，熱脅迫情況下的野生型和轉基因株系在脅迫前，脅迫后和復水后的表型圖，I為野生型植株，2-4 為轉基因植株。
圖11為本發明兩月大苗脅迫后的存活率，其中A為干旱脅迫，B為鹽脅迫，C為冷脅迫，D為熱脅迫的存活率，□代表的是野生型植株的存活率，胃代表的是轉基因植株的存活率。
具體實施方式
在下列實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按常規實驗操作進行，如《精編分子生物學實驗指南》(F.M奧斯伯，R.E.金斯頓，J. G塞德曼主編，馬學軍，舒躍龍譯，北京科學出版社，2004)和植物基因工程(王關林，方宏筠主編，北京科學出版社，2009)中所述的方法進行；
實施例
所述基因為準噶爾無葉豆EsDREB基因核苷酸序列
TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTAGGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATAAATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTTAGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCCGGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAAGGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGAGATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATGATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACAAGTTTCCAATTTCTCTCAGCTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAAACAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCATGAGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCAT
EsDREB基因氨基酸序列
MSATCMHKLVKNHNKGDASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSR CNYRGVRQRTWGKWVAEIREPNRGNRLWLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASPA GSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGEGDSGSGTSSSDPSLS ；
pCAMBIA1301-EsDREB重組質粒載體的構建
用Kpn I和Pst I兩個限制性內切酶分別酶切pMD19_EsDREB基因的質粒和空載體PCAMBIA1301，并回收，連接，篩選測序，構建出pCAMBIA1301-EsDREB載體(載體構建示意圖見圖1)，轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經藍白斑篩選，質粒PCR鑒定(圖2)及質粒雙酶切(圖3)確定陽性重組質粒pCAMBIA1301-EsDREB ；
農桿菌介導的葉盤法轉化煙草
農桿菌感受態細胞的制備
挑取LBA4404單菌落接種于5mL YEB液體培養基(含鏈霉素100mg/mL，利福平 100mg/mL)中，溫度28°C，250rpm培養過夜；吸取2mL培養物轉入50mLYEB液體培養基中， 繼續培養至0D600值為O. 5左右(約4小時)；
將菌液轉至無菌離心管中，冰浴30min，5000rpm離心5min ；
用I. 6mL 20mmol/L無菌CaCl2重懸菌體,加入400 μ L無菌甘油，混勻后，按每管 200 μ L分裝于無菌I. 5mL微量離心管中，液氮中速凍lmin，溫度_80°C保持備用；
凍融法將重組質粒pCAMBIA1301_EsDREB轉入農桿菌
在滅菌的1.5mL離心管中加入20(^1^新鮮制備的1^八4404感受態細胞及IOyL 鑒定正確的陽性質粒pCAMBIA1301-EsDREB混勻后冰浴30min ；
將離心管移入溫度42°C水浴鍋中，水浴60s (切忌振蕩)；
立即將離心管置于冰中，2-3min后再移入溫度37°C水浴鍋中水浴5min ；
向離心管中加入800 μ L YEB液體培養基，在溫度37°C恒溫振蕩器上以260r/min 培養lh，4000rpm離心5min，棄上清，取剩余菌體均勻涂布于YEB選擇培養基(含鏈霉素 100mg/mL,卡那霉素50mg/mL,利福平100mg/mL)表面,待菌體完全被吸收后,將平板倒置于溫度28°C培養箱中培養48h，待培養基上長出單菌落后，進行菌落PCR，篩選陽性重組子；
在YEB液體培養基中，溫度28°C培養48h，然后將菌液制備成甘油菌，溫度_20°C保存，用于后續實驗；
煙草遺傳轉化
葉盤制備及預處理
將煙草種子(品種為Petite Havana SRl)用濃度75%酒精浸泡30s，I % NaClO浸泡lOmin，無菌水沖洗5遍，接種于MS培養基上，16h光照，溫度28°C培養30d，即為煙草無菌苗，取無菌苗葉片剪出葉圓盤，預培養2-3d，材料切口處剛剛開始膨大時即可進行浸染；
農桿菌的活化和制備
取溫度_80°C冰箱內保存的農桿菌菌液100 μ L接種到3mL YEB液體培養基中，溫度28°C，180rpm過夜培養，取活化菌液200 μ L加滅菌的50%甘油200 μ L保存于離心管中， 放于溫度_20°C冰箱中備用，取活化菌液或上述備用菌液100 μ L加入IOmL的YEB液體培養基中，溫度28°C，180rpm振蕩培養至0D600值為O. 6-0. 8，將菌液分裝到50mL三角瓶中，用于侵染；
侵染和共培養
于超凈工作臺上，將菌液倒入無菌小培養皿中，將經過預培養處理的葉盤放入活化后的菌液中，浸泡10-15min，用滅菌的吸水紙將侵染過的葉盤表面菌液吸干后，將葉盤放于分化培養基上，溫度28 °C,暗培養48h ；
選擇分化培養和生根培養
暗培養結束后，將葉盤放于選擇分化培養基上培養(50mg/L潮霉素)，以后每 10-15d繼代一次，選擇培養2-3周后，葉盤周圍分化出抗性芽，待抗性芽長至2-3cm，切下插入到選擇生根培養基中，進行生根培養，2-3周長出不定根，得到轉EsDREB基因的煙草植株;
轉基因煙草的鑒定
轉基因煙草的潮霉素篩選
將收獲的TO代種子經消毒后(消毒方法同上)播種于含有50 μ g/ml的潮霉素的 MS培養基上，溫度28°C，16h光照培養14天左右，可見轉基因植株呈深綠色，子葉健康，而野生型植株發芽緩慢，萌發率極低( 4% )，植株小，呈黃綠色，有的植株子葉畸形，之后將潮霉素篩選后的陽性植株移入營養土中培養至收獲，用收獲的Tl代種子重復以上步驟，直至獲得T2代種子；
轉基因煙草的DNA檢測
潮霉素篩選的同時，用分子手段對轉基因煙草做進一步的鑒定，用CTAB法提取轉基因煙草葉片總DNA，以野生型煙草總DNA為陰性對照，以陽性重組質粒 DH5 a -pCAMBIA1301-EsDREB 為陽性對照，用 EsDREB 基因全長引物(DL-f :5’ TTC TTCCTC AAATGCCTTCTGG3’ 和 DL_r :5’ ATGCAAAACTTACATCAAGACAATG 3’ )進行 PCR 擴增反應，擴增體系及反應體系如下
權利要求
1.一種準噶爾無葉豆EsDREB基因的用途，其特征在于該基因用于轉化植物，提高植物的多種非生物脅迫抗性，其中提高植物多種非生物脅迫抗性的方法是用準噶爾無葉豆EsDREB基因轉化目標植物，獲得轉基因植物，具體操作按下列步驟進行 a、用KpnI和PstI分別酶切pMD19-T-EsDREB質粒載體和植物真核表達空載體PCAMBIA1301,回收，連接，轉化大腸桿菌細胞，經質粒PCR和雙酶切鑒定，將EsDREB基因構建到植物表達載體PCAMBIA1301中，得到重組質粒pCAMBIA1301-EsDREB ； b、將步驟a中的重組質粒pCAMBIA1301-EsDREB導入農桿菌中，得到帶有重組質粒的農桿菌； C、將步驟b帶有重組質粒的農桿菌用葉盤轉化法轉化目標植物； d、目標植物轉基因陽性苗的鑒定； e、利用轉基因目標植物的體系驗證EsDREB基因的抗逆功能。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于所述基因為準噶爾無葉豆EsDREB基因的核苷酸序列TTCTTCCTCAAATGCCTTCTGGGTCGTTCTTCTTTCGATCCAGCTTGGGATTATTTTGCCAGCAAATTAGGTATTTGTTTCAACTATTTTATTGATTGACATTTTCCCTGTATATAATAAATGAGTGCAACTTGCATGCACAAGTTAGTGAAAAATCACAACAAAGGGGATGCATCTAAGTCCCTGGCCGATACATTGGCAAGATGGAAAGAGTATAATGCCCGGCTTGAATTGAGTAATGAAGCCGAGAAGCCTGTTAGGAAAGTTCCTGCCAAGGGATCAAAAAAGGGGTGTATGAAAGGTAAAGGAGGACCCGAGAATTCGCGCTGTAACTACAGAGGTGTTAGGCAAAGGACTTGGGGCAAGTGGGTTGCTGAGATTCGAGAGCCAAACAGAGGGAATAGGCTCTGGTTGGGGACGTTTTCGAATGCAGTTGGCGCTGCTCTTGCTTATGATGAAGCTGCAAGGGCAATGTATGGTTCTTGTGCGCGCCTCAACTTTCCCAATGTACAAGTTTCCAATTTCTCTCAGCTGGAAGCTTCAAAAGCTTCTCCAGCCGGCTCTGCGATGGTAATATCAGAGAATACCGAGTCCATGATATTGCCAAACAACTCGGGGGTAGATGCAACTGAAGATGTTGACATGGAACGTCTTTCATTATCGCTAAGCGTGGCTGTGAATCATGAGGAAGGGGAGGGTGACTCAGGGTCAGGGACCAGTTCCTCCGATCCTTCATTGTCTTGATGTAAGTTTTGCAT EsDREB基因的氨基酸序列MSATCMHKLVKNHNK⑶ASKSLADTLARWKEYNARLELSNEAEKPVRKVPAKGSKKGCMKGKGGPENSRCNYRGVRQRTffGKffVAEIREPNRGNRLffLGTFSNAVGAALAYDEAARAMYGSCARLNFPNVQVSNFSQLEASKASPAGSAMVISENTESMILPNNSGVDATEDVDMERLSLSLSVAVNHEEGE⑶SGSGTSSSDPSLS。
3.根據權利要求I所述的用途，其特征在于多種非生物脅迫抗性為抗干旱脅迫，抗高鹽脅迫，抗冷脅迫，抗熱脅迫。
4.根據權利要求I所述的用途，其特征在于步驟c目標植物為煙草。
全文摘要
本發明涉及一種準噶爾無葉豆EsDREB基因的用途，該基因用于轉化植物對干旱脅迫，高鹽脅迫，冷脅迫，熱脅迫多種非生物脅迫的抗性，其中提高植物多種非生物脅迫抗性的方法是用準噶爾無葉豆EsDREB基因轉化目標植物，獲得轉基因植物。本發明用農桿菌介導的葉盤法將EsDREB基因轉化到野生型煙草中，并研究其在煙草中的抗逆功能，為EsDREB基因在其它植物中的應用提供了很好的基礎。
文檔編號C12N15/84GK102978238SQ20121046253
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月16日 優先權日2012年11月16日
發明者李小雙, 張道遠, 楊紅蘭, 張元明 申請人:中國科學院新疆生態與地理研究所