專利名稱：大胚齡神經干細胞的高-低密度貼壁細胞培養方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域的一種胚胎神經干細胞培養方法，特別涉及一種大胚齡神經干細胞的高-低密度貼壁細胞培養方法。
背景技術：
神經干細胞的發現是神經科學領域的重大突破，為神經發育和神經組織移植等研究領域開辟了廣闊前景。神經干細胞是一種具有自我更新及廣泛分化潛能的細胞，它處于分化的非終末狀態，可通過對稱或不對稱分裂出新的干細胞或分化潛能逐漸變小的子細胞，最終產生中樞神經系統的三種主要細胞，即神經元細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。一般認為神經干細胞主要存在于哺乳動物胎腦的紋狀體、小腦半球、腦室區等，成年哺乳動物腦的側腦室壁和海馬等區。有關哺乳動物胚胎階段和成年動物在特定腦區存在神經 干細胞已不斷得到證實，但大胚齡神經干細胞的分離和培養較為困難。傳統的高密度懸浮細胞培養法克隆球形成和生長緩慢，存在高密度的抑制作用；低密度難以培養成功則可能是與細胞的密度依賴性和神經干細胞的絕對數量過少有關；中等密度懸浮細胞培養2周后可見克隆球形成，但有其它細胞吸附現象。
發明內容
為了解決胚胎神經干細胞較難培養的問題，本發明采用無血清培養和單細胞克隆技術13周人胚大腦皮層中分離和培養出具有自我更新和多分化潛能的神經干細胞，采用先高密度而后密度逐漸遞減的高-低密度貼壁細胞培養法，在3周后可形成大量神經干細胞，該細胞具有連續克隆能力，可傳達培養，表達神經巢蛋白抗原；分化后的細胞表達神經元細胞、膠質細胞和少突膠質細胞的特異性抗原。具體的，本發明的大胚齡神經干細胞的高-低密度貼壁細胞培養方法包括以下步驟皮層神經干細胞的分離和培養，高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞，神經干細胞的傳代培養，神經干細胞的單細胞克隆，神經干細胞的分化培養以及免疫熒光法檢測。其中，所述皮層神經干細胞的分離和培養步驟包括取7周自然流產和13周水囊引產的人胚胎，無菌條件下分離出胚胎前腦和大腦皮層組織，制成單細胞懸液，加入無血清培養基中，臺盼藍染色計數活細胞，調整細胞濃度為1父107/!111，分別種植于多聚賴氨酸包被的培養瓶中，371、體積濃度為5% CO2條件下靜置進行貼壁細胞培養；所述高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞的步驟包括應用高密度貼壁細胞培養5天后后吸出部分細胞改為低密度培養，培養2周時經多次換液去除懸浮細胞繼續培養至4周時形成大量大小不等的克隆球；所述的神經干細胞的傳代培養步驟包括待原代細胞培養出現大量懸浮克隆球后進行傳代培養，在嚴格無菌條件下操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大于200 u m的大克隆球切成數塊，繼續培養，7 10天傳代I次，方法同上述的高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞的步驟；所述的神經干細胞的單細胞克隆步驟包括在貼壁細胞培養中，當細胞密度降至IX IO4AiI時，挑選散在出現、明顯增大、具有強折光性的細胞，在培養瓶底面用記號筆分別標記，動態定點觀察并照相記錄；當單個細胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時，用玻璃微管逐個吸出克隆球進行分化試驗；將原代細胞制成單細胞懸液，稀釋至40個/ml，于96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液，每孔100 yl，選取僅有I個細胞的培養孔作標記；所述神經干細胞的分化培養步驟包括將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的小培養皿中，用DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養基和經過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養；所述免疫熒光法檢測步驟包括將上述獲得的克隆球種入包被的小培養皿中，用無血清培養基貼壁培養12小時后行熒光檢測；經分化培養后的細胞分別于2、7、14和21天行熒光檢測。
優選的，所述皮層神經干細胞的分離和培養步驟中的血清培養基為含B27(l 50)和 EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的 DMEM/F12(1 I)無血清培養基。再優選的，所述的高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞的步驟中，所述高密度貼壁細胞培養的細胞密度為I X 107/ml，所述低密度貼壁細胞培養的細胞密度為lX106/ml。
通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中圖1所示為本發明的大胚齡神經干細胞的高-低密度貼壁細胞培養方法的步驟流程圖。
具體實施例方式如圖1所示的本發明的大胚齡神經干細胞的高-低密度貼壁細胞培養方法的步驟流程圖，所述方法具體包括以下步驟S1、皮層神經干細胞的分離和培養取7周自然流產和13周水囊引產的人胚胎，無菌條件下分離出胚胎前腦和大腦皮層組織，制成單細胞懸液，加入含B27(l 50)和EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的DMEM/F12(l I)無血清培養基，臺盼藍染色計數活細胞，調整細胞濃度為I X 107/ml，分別種植于多聚賴氨酸包被的25cm2培養瓶(8ml細胞懸液/瓶)中，37°C、體積濃度為5% CO2條件下靜置培養。培養方法為貼壁細胞培養法。S2、高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞首先應用高密度貼壁細胞培養I XlOVml，原代細胞聚集成團塊狀，團塊中可形成少量克隆球，但克隆球生長緩慢。培養5d后后吸出部分細胞改為IX 106/ml培養，克隆球形成和生長明顯增快。首次換液發現，每高倍鏡視野(倒置顯微鏡X 100倍)下大約有200個細胞貼壁，其中處于有絲分裂期的極強折光性大細胞平均大約有5個，少數散在的貼壁細胞出現分化現象；2周時極強折光性大細胞數量增多，至每高倍視野下大約有20個，多數貼壁未分裂的原代細胞和分化細胞開始脫落死亡，此時經多次換液去除懸浮細胞，細胞密度由IXlOVml降至IXlOVml左右，無細胞聚集現象；3周時已經有極強折光性大細胞開始形成緊密小克隆球(大約5 20個細胞組成，直徑約40 60 ii m) ;4周時已有大量大小不等的克隆球形成，許多大克隆球(直徑大于200 ym)已脫壁懸浮生長。S3、神經干細胞的傳代培養待原代細胞培養出現大量懸浮克隆球后進行傳代培養。采用嚴格無菌操作，在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大克隆球(大于200i!m)切成數塊，小克隆球(小于100 u m)不作處理，繼續培養。根據克隆球生長情況，7 IOd傳代I次，方法同前。S4、神經干細胞的單細胞克隆在貼壁細胞培養法中，當細胞密度降至IXlOVml時，挑選散在出現、明顯增大、具有強折光性的細胞，在培養瓶底面用記號筆分別標記，動態定點觀察并照相記錄。能清楚地 觀察從單個細胞逐漸分裂增殖形成克隆球，無其它細胞吸附聚集現象，克隆球用微管吸出分離后活力仍很旺盛。當單個細胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時，用自制玻璃微管(內徑約250 500 ym)逐個吸出克隆球進行分化試驗。(2)有限稀釋法將原代細胞制成單細胞懸液，稀釋至40個/ml,于96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液,每孔IOOii I,選取僅有I個細胞的培養孔作標記，僅少數單個細胞逐漸分裂增殖形成克隆球。S5、神經干細胞的分化培養將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的、直徑3. 5cm的小培養皿中，用DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養基和經過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養。神經干細胞在DMEM/F12+50g/L Fcs有血清培養基中培養，12h后即可見部分細胞貼壁并有短小突起伸出，2d后可見大部分細胞貼壁生長，形態不規則，突起不斷增粗和伸長，I周后分化成形態不一的、分散成片的多突起星狀細胞和神經元樣細胞，突起互相交織成網狀。2周后部分分化細胞開始衰退。在DMEM/F12+5%Fcs+EGF+bFGF培養基中，一部分細胞出現貼壁分化現象，另一部分細胞則繼續分裂增殖，最后細胞可以很快貼滿整個皿底。新鮮成人腦脊液中亦出現很好的分化現象，經適時更換腦脊液，細胞可以長期存活。S6、免疫熒光法檢測將上述獲得的克隆球種入包被的小培養皿中，用無血清培養基貼壁培養12h后行熒光檢測。經分化培養后的細胞分別于2、7、14和21d行熒光檢測。每個培養皿用蠟筆畫五個圈，分別用抗NestinIgG、抗NSE IgG、抗GFAPIgG、抗CNP IgG和空白對照行免疫熒光染色，二抗為FITC熒光二抗。貼壁的克隆球呈巢蛋白(Nestin)抗原陽性，同時NSE、GFAP和CNP免疫熒光染色均呈陰性。在DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養基和新鮮成人腦脊液中分化的細胞，不同時間點均檢測到NSE、GFAP和CNP陽性細胞，2周后幾乎未找到Nestin陽性細胞。13周胚胎神經干細胞較難培養，可能是由于13周胎腦中神經干細胞的數量較小胚齡胎腦減少或者其生物學特性已有某些改變的緣故。高密度懸浮細胞培養法克隆球形成和生長緩慢，存在高密度的抑制作用；低密度難以培養成功則可能是與細胞的密度依賴性和神經干細胞的絕對數量過少有關；中等密度懸浮細胞培養2周后可見克隆球形成，但有其它細胞吸附現象。我們在實驗中發現神經干細胞具有一定的貼壁能力，在形成克隆球并長大至200 ii m前，能夠保持貼壁狀態，有利于在不改變細胞培養環境狀態下，定點動態觀察從單個干細胞分裂增殖形成克隆球的全過程。我們采用開始高密度而后密度逐漸遞減的貼壁細胞培養法，在3周后可形成大量克隆球，認為在原代首次培養時使用高密度，神經干細胞和其它細胞一樣有較多數量貼壁，由于前體細胞和各種終末神經細胞在無血清培養基中生長不良，活力下降，出現脫壁懸浮和逐漸死亡。每次換液去除懸浮細胞，細胞密度逐漸下降，大約3周時，剩余的貼壁細胞大部分是活力較強的神經干細胞，密度為I X IOVml左右，該密度可以很好地避免發生細胞聚集現象，且神經干細胞仍能較好地分裂增殖，并大量形成克隆球。我們從人胚中分離出來自單細胞的克隆球經分裂增殖多次傳代后仍然保持較強的活力，并呈巢蛋白的陽性表達，分化后細胞行免疫熒光檢測顯示均有NSE、GFAP和CNP陽性細胞，具有自我更新及多分化潛能，證明是神經干細胞。本發明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為 準。
權利要求
1.一種大胚齡神經干細胞的高-低密度貼壁細胞培養方法，其特征在于，所述培養方法包括以下步驟皮層神經干細胞的分離和培養，高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞，神經干細胞的傳代培養，神經干細胞的單細胞克隆，神經干細胞的分化培養以及免疫熒光法檢測；其中， 所述皮層神經干細胞的分離和培養步驟包括取13周自然流產和13周水囊引產的人胚胎，無菌條件下分離出胚胎前腦和大腦皮層組織，制成單細胞懸液，加入無血清培養基中，臺盼藍染色計數活細胞，調整細胞濃度為lX107/ml，分別種植于多聚賴氨酸包被的培養瓶中，37°C、體積濃度為5% CO2條件下靜置進行貼壁細胞培養； 所述高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞的步驟包括應用高密度貼壁細胞培養5天后后吸出部分細胞改為低密度培養，培養2周時經多次換液去除懸浮細胞繼續培養至4周時形成大量大小不等的克隆球； 所述的神經干細胞的傳代培養步驟包括待原代細胞培養出現大量懸浮克隆球后進行傳代培養，無菌條件下在倒置顯微鏡下用自制玻璃微針將其中的大于200 μ m的大克隆球切成數塊，繼續培養，7 10天傳代I次，方法同上述的高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞的步驟； 所述的神經干細胞的單細胞克隆步驟包括在貼壁細胞培養中，當細胞密度降至IXlOVml時，挑選散在出現、明顯增大、具有強折光性的細胞，在培養瓶底面用記號筆分別標記，動態定點觀察并照相記錄；當單個細胞形成克隆球并逐漸增大即將懸浮脫離時，用玻璃微管逐個吸出克隆球進行分化試驗；將原代細胞制成單細胞懸液，稀釋至40個/ml，于96孔培養板中滴加稀釋的細胞懸液，每孔ΙΟΟμ 1，選取僅有I個細胞的培養孔作標記； 所述神經干細胞的分化培養步驟包括將以上獲得的、來自單細胞的克隆球經胰酶消化后，種植于預先用多聚賴氨酸包被的小培養皿中，用DMEM/F12+5% Fcs+EGF+bFGF培養基和經過濾滅菌后的新鮮成人腦脊液中進行分化培養； 所述免疫熒光法檢測步驟包括將上述獲得的克隆球種入包被的小培養皿中，用無血清培養基貼壁培養12小時后行熒光檢測；經分化培養后的細胞分別于2、7、14和21天行熒光檢測。
2.如權利要求1所述的大胚齡神經干細胞的高-低密度貼壁細胞培養方法，其特征在于，所述皮層神經干細胞的分離和培養步驟中的血清培養基為含B27 (I 50)和EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)的 DMEM/F12(1 I)無血清培養基。
3.如權利要求1所述的大胚齡神經干細胞的高-低密度貼壁細胞培養方法，其特征在于，所述的高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞的步驟中，所述高密度貼壁細胞培養的細胞密度為I X 107/ml，所述低密度貼壁細胞培養的細胞密度為I X 106/ml。
全文摘要
本發明提供一種大胚齡神經干細胞的高-低密度貼壁細胞培養方法，所述培養方法包括以下步驟皮層神經干細胞的分離和培養，高-低密度貼壁細胞培養法培養神經干細胞，神經干細胞的傳代培養，神經干細胞的單細胞克隆，神經干細胞的分化培養以及免疫熒光法檢測。本發明采用無血清培養和單細胞克隆技術從13周人胚大腦皮層中分離和培養出具有自我更新和多分化潛能的神經干細胞，采用先高密度而后密度逐漸遞減的高-低密度貼壁細胞培養法，形成大量神經干細胞，該細胞具有連續克隆能力，可傳達培養，表達神經巢蛋白抗原；分化后的細胞表達神經元細胞、膠質細胞和少突膠質細胞的特異性抗原，解決了胚胎神經干細胞較難培養的問題。
文檔編號C12N5/0797GK103013920SQ20121050711
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月30日 優先權日2012年11月30日
發明者陸華 申請人:陸華