專利名稱：一株高效代謝木糖的重組酵母菌株及用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一株能夠發酵木糖產乙醇的重組酵母菌株。
背景技術：
利用木質纖維素生產燃料乙醇，不僅能夠降低燃料乙醇的生產成本，而且在改善環境及廢物處理等方面均有很重要的作用。我國作為一個農業大國，秸桿等農作物廢棄物資源相當豐富，這為發展燃料乙醇產業提供了得天獨厚的條件。一般用作工業生產乙醇的菌株為釀酒酵母，雖然天然的釀酒酵母能夠很好的利用木質纖維素水解物中的己糖產生乙醇，但是卻缺乏對含量豐富的戊糖，例如木糖的代謝能力。因此構建能夠高效利用木糖的工程菌株對降低燃料乙醇的生產成本具有關鍵意義。目前我國在利用代謝工程方法構建能夠利用木糖產生乙醇的釀酒酵母工程菌株方面已經取得了一定的進展，但是仍不能滿足生產的要求，主要表現在木糖利用緩慢、副產物木糖醇積累過多以及乙醇得率低等方面。
發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一株高效代謝木糖的重組酵母菌株。本發明的第二個目的是提供上述一株高效代謝木糖的重組酵母菌株的用途。本發明的技術方案概述如下
—株高效代謝木糖的重組酵母菌株，分類命名釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)命名為SyBE005,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6634，其具有高效代謝木糖產乙醇的能力。上述菌株代謝木糖產乙醇的用途。本發明的優點本發明的重組酵母菌株SyBE005能夠有效的利用木糖發酵產生乙醇。乙醇產率達到理論得率的64%，副產物木糖醇的產率在12%以下，能夠高效地轉化木糖為乙醇，是優良的利用纖維素水解液的菌株。本發明的高效代謝木糖的重組酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)命名為SyBE005,已于2012年9月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 6634。地址在北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所。
圖1為含有木糖還原酶基因編碼框、木糖醇脫氫酶基因編碼框及木酮糖激酶基因編碼框的質粒圖譜。圖2為含有木糖醇脫氫酶基因編碼框的質粒PRS305-XDH圖譜。
圖3是含有核糖磷酸異構酶基因編碼框、轉酮酶基因編碼框的質粒pRS-RKI1-TKLl 圖譜。圖4是含有戊糖磷酸差向異構酶基因編碼框、轉醛酶基因編碼框的質粒pAUR-RPEl-TALl 圖譜。圖5為菌株L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005在含有20g/L木糖的發酵培養基中發酵時木糖利用情況。圖6為菌株L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005在含有20g/L木糖的發酵培養基中發酵時乙醇產生情況。圖1為菌株L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005在含有20g/L木糖的發酵培養基中發酵時木糖醇產生情況。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明，本發明的實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發明，但不對本發明做任何限制。實施例1重組酵母菌株SyBE005的構建與篩選出發菌株出發菌株L2612,是美國威斯康星大學麥迪遜分校的Thomas Jeffries教授贈予，基因型是MAT alp ha, leu2, ura3, trpl。是亮氨酸、尿喃唳和色氨酸缺陷。培養基篩選培養基A :合成氮源YNB 6. 7g/L,混合氨基酸粉末2g/L (具體配方參考[美]D. C.安伯格等酵母遺傳學方法試驗指南),亮氨酸100mg/L,色氨酸100mg/L,葡萄糖20g/L。篩選培養基B :合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸100mg/L，葡萄糖20g/L0篩選培養基C :合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L。篩選培養基D :合成氮源YNB 6. 7g/L,混合氨基酸粉末2g/L,短梗霉素A 0. 5mg/L,葡萄糖20g/L。馴化培養基合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，木糖50g/L。固體培養基中，添加20g/L的瓊脂。出發重組菌株L2612PR-DPPP的構建以菌株L2612基因組為模板，克隆出啟動子TDHlp、TDH3p、PGKlp，木酮糖激酶基因XKSl (含自身終止子)，戊糖磷酸差向異構酶基因RPE1，核糖磷酸異構酶基因RKI1，轉酮酶基因TKLl，轉醛酶基因TALl，終止子序列PGKlt。通過融合PCR技術將合成的木糖還原酶基因XR、木糖醇脫氫酶基因XDH分別與啟動子PGK1、終止子PGKlt連接，將啟動子PGKl與木酮糖激酶基因XKSl連接，然后將三個基因表達框順次連接到載體Hplac211(購于ATCC)上，形成表達質粒YIplac211-XRXDHXK(圖1)。木糖還原酶基因XR序列用SEQ ID NO 1所示。木糖醇脫氫酶基因XDH序列用SEQ ID NO 2所示。將以上構建的木糖醇脫氫酶基因表達框從質粒YIplac211_XRXDHXK上酶切出來，重新克隆到載體PRS305 (購于ATCC)上，形成質粒pRS305_XDH(圖2)。利用融合PCR技術構建戊糖磷酸差向異構酶基因表達盒TDHlp-RPEl-PGKlt，轉醛酶基因表達盒PGKlp-TALl-PGKlt，核糖磷酸異構酶基因表達盒PGKlp-RKIl-PGKlt，轉酮酶基因表達盒 TDH3p-TKLl-PGKlt。將基因表達盒 PGKlp-RKIl-PGKlt 和 TDH3p_TKLl_PGKlt連接到載體PRS304 (購于ATCC)上，形成載體pRS-RKIl-TKLl (圖3)。將基因表達盒TDHlp-RPEl-PGKlt和基因表達盒PGKlp-TALl-PGKlt依次連接到載體pAURlOl (大連寶生物公司購買)，構建載體pAUR-RPEl-TALl (圖4)。用限制性內切酶Apa I線性化YIplac211_XRXDHXK，通過醋酸鋰法轉化菌株L2612，在篩選培養基A上篩選獲得重組菌株L2612PR。并在此重組菌株的基礎上，用醋酸鋰法轉化質粒PRS305-XDH，在篩選培養基B上獲得重組菌株。用限制性內切酶EcoRI線性化質粒pRS-RKIl-TKLl，用醋酸鋰法轉化上一步得到的重組菌株，在篩選培養基C上表達獲得重組菌株。并在此菌株的基礎上，進一步轉化用StuI線性化的質粒pAUR-RPEl-TALl，在篩選培養基D上得到出發重組菌株L2612PR-DPPP。突變菌株SyBE005的構建和篩選將菌株L2612PR-DPPP以初始OD6tltl=O. 2接到含50mL馴化培養基的250mL中，30°C、200轉/分有氧培養3天。測量培養物的0D_，并以初始0D_=0. 2轉接到新鮮馴化培養基中，重復培養10次后菌液的0D_保持不變，繼續重復培養10次。取少量的菌液，稀釋后在馴化培養基的固體平板上涂布培養，獲得單菌落菌株。從其中選取菌落尺寸最大的20個菌落，分別接種到含有2mL液體篩選培養基C的15mL試管中，在30°C、200轉/分的條件下培養2天。取IOOii L菌液轉接到3mL新鮮發酵培養基A中，在30°C、200轉/分的條件下無氧培養。用帶有排氣針的橡膠塞密封試管口。無氧培養24小時后，測量菌液的OD6tltl、殘余木糖含量和代謝產物乙醇、甘油、木糖醇含量。從20株單菌落中獲得了一株殘余木糖最少的菌株SyBE005。分析方法
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以722型分光光度計在600nm處測定的菌體吸光值(0D_)表征菌體濃度。木糖、乙醇、木糖醇、甘油的濃度用高效液相色譜(Watersl515)測定。色譜柱為AminexHPX-87H，柱溫65°C ;檢測器=Waters示差檢測器2421，檢測器溫度是40°C。流動相為5mM硫酸溶液，流速0. 6mL/min,進樣量為10 u L。實施例2菌株L2612PR、L2612PR-DPPP與SyBE005的木糖發酵比較1.試驗材料菌株 L2612PR、L2612PR_DPPP、SyBE0032.試驗方法種子培養基1:合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L，亮氨酸100mg/L,色氨酸 100mg/L。種子培養基2 :合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L。發酵培養基酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖20g/L。從新鮮的斜面上接一環L2612PR菌落到50mL種子培養基I中。類似的，從新鮮的斜面上接菌落L2612PR-DPPP與SyBE005到50mL種子培養基2中。在30°C、200轉/分的條件下培養24小時。以初始菌體濃度0D_=1. 0接種到IOOmL發酵培養基中，在30°C、150轉/分條件下培養，發酵60小時。檢測菌體濃度、木糖濃度和產物乙醇、木糖醇、甘油的濃度。3.分析方法
同實施例1。4.試驗結果圖5所示，在48小時內菌株SyBE005已經完全利用了木糖，而菌株L2612PR、L2612PR-DPPP都只利用了約60%的木糖，SyBE005的最大木糖比消耗速率達到0. 301g/g干重/h ;發酵結束后，L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005的乙醇產量分別達到了 2. 02g/L、2. 97g/L、6. 85g/L。L2612PR、L2612PR_DPPP 對應的乙醇得率分別為 0. 15g/g 木糖、0. 20g/g木糖，SyBE005的發酵乙醇 得率達到0. 33g/g木糖，相對于L2612PR、L2612PR_DPPP分別提高了 120%和65%，如圖6所示；發酵結束后，L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005的木糖醇含量分別達到了 6. 24g/L、6. 29g/L、2. 43g/L。L2612PR、L2612PR_DPPP 的木糖醇得率達到 0. 48g/g木糖、0. 42g/g木糖，而SyBE005的木糖醇得率降低為0. 12g/g木糖，相對于L2612PR、L2612PR-DPPP降低了 3、2. 5倍，如圖7所示。
權利要求
1.一株高效代謝木糖的重組酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)命名為SyBE005，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 6634，其具有1 效代謝木糖廣乙醇的能力。
2.權利要求1所述菌株代謝木糖產乙醇的用途。
全文摘要
本發明公開了一株高效代謝木糖的重組酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)命名為SyBE005，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.6634，其具有高效代謝木糖產乙醇的能力。本發明的重組酵母菌株SyBE005能夠有效的利用木糖發酵產生乙醇。乙醇產率達到理論得率的64%，副產物木糖醇的產率在12%以下，能夠高效地轉化木糖為乙醇，是優良的利用纖維素水解液的菌株。
文檔編號C12N1/19GK103060217SQ20121050711
公開日2013年4月24日 申請日期2012年11月29日 優先權日2012年11月29日
發明者元英進, 査健, 申明華, 胡夢龍 申請人:天津大學