專利名稱：一種提高集胞藻pcc6803脂肪酸含量的方法
技術領域：
本發明涉及一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，屬于植物基因工程技術領域。
背景技術：
多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids,PUFAs)是指含有兩個以上雙鍵且碳原子數為16-22的直鏈脂肪酸。是構成高等動、植物細胞的重要成分之一，對人體具有重要的生理功能。在營養學和醫學領域有著重要作 用。目前市場上的多不飽和脂肪酸的主要來源是深海魚類，但從魚體內提取的PUFA具有較重的魚腥味，且魚油資源有限，價格昂貴，存在潛在的污染問題及因過度捕殺致使全球魚類數量下降，影響海洋生物的多樣化并造成沿岸生態系統的破壞，進而影響生態可持續發展。藍藻(cyanobacteria)是一類能進行光合作用的原核生物，藍藻細胞可以利用簡單的無機物合成有機物，所表達的外源基因產物不形成包含體，并且多數藍藻及其提取物對人畜無毒，是轉基因研究的良好受體。集胞藻PCC 6803 (Synechocystis sp. strainPCC6803)做為一種單細胞藍藻，具有生長速度快、培養條件簡單、不產生毒素、細胞結構簡單、遺傳背景清楚、方便分子操作等特點，適合于利用廣核生物反應器大規模生產，是很好的藍藻基因工程受體。野生型集胞藻PCC 6803中亞油酸(LA)占54. 5%，Y-亞麻酸(GLA)占27. 3%，這為通過轉化外源脂肪酸脫飽和酶基因進而增加集胞藻PCC 6803中多不飽和脂肪酸含量的研究提供了基礎。植物中脂酰-酰基載體蛋白硫脂酶(Acyl-Acyl Carrier Proteinthioesterases, FAT)是游離脂肪酸合成的關鍵酶,能催化Acyl-ACPs脫去ACP,產生游離脂肪酸。對于植物脂肪酸的鏈長和飽和性有重要作用。植物Fat按其序列高同源性和底物偏好主要分為FatA和FatBl兩個基因家族，不同FAT對底物的選擇不同，這種底物的特異性直接導致了植物油脂儲存在組成上和數量上的差異。其中FatA基因家族的酶主要對油酰-ACP( 18:1-ACP)有活性，決定著植物體內18:1輸出到質體外的水平。在大多數植物中，FatBl基因家族主要傾向于生成飽和的acyl-ACP脂酰碳鏈，如對棕桐酰-ACP (16:0-ACP)、硬脂酰-ACP (18:0-ACP)有活性，單非飽和的油酰-ACP (18:1-ACP)也有少量的活性。目前已從向日葵(Helianthusannuus)、油菜(Brassica napus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)> 蓖麻(Ricinus communis)> 山竹(Garcinia mangsotana)、小麥(Triticum aestivum)、葡萄(Vitis vinifera)等多種植物中獲得FatA基因片段。FatBl基因也已在在加利福尼亞月桂樹(Umbellularia californica)、萼苣花(Cupheahookeriana)、油菜(Brassica napus)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、山竹(Garciniamangostana)、玉米(Zea mays )、毛白楊(Populustomentosa)等植物種子中獲得，但國內外在目前的現有技術中對硫脂酶基因的研究很少，在花生中雖有硫脂酶基因的克隆，但是還沒有硫脂酶基因功能研究的報道。
發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法。本發明的技術方案如下一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步驟如下(I) PCR擴增集胞藻PCC 6803的psbA2啟動子基因片段、集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登錄號為⑶324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登錄號為⑶324447的花生硫脂酶基因AhFatBl ；
(2)將步驟(I)獲得的psbA2啟動子基因片段分別與步驟(I)制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB I進行融合PCR擴增，分別制得基因片段Promotor+AhFatA 和基因片段 Promotor+AhFatBl ；(3)將步驟(2)制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatBl經融合PCR擴增，制得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl ；(4)將步驟(I)獲得的psbA20RF基因片段經SacII和SacI雙酶切后與經相同酶切的pBluescriptIISK plus T1T2連接,得到質粒pBluescriptIISK plus TlT2-downstream ；分別對質粒pBluescriptII SK plus TlT2_downstream和質粒pUC4K進行BamHI單酶切，電泳后分別回收pBluescriptIISK plus TlT2_downstream載體片段和pUC4K中的npt片段，對載體片段去磷酸化后與npt片段連接，得到質粒pBluescript II SKplusTlT2-npt-downstream ；(5)將步驟(2)制得的基因片段 Promotor+AhFatA、基因片段 Promotor+AhFatBl或者步驟(3 )制得的基因片段Promotor+AhFatA+AhFatB I插入步驟(4 )制得的質粒pBluescriptll SK plus TlT2-npt_downstream 中，制得重組載體;(6)將步驟(5)制得的重組載體轉化至集胞藻PCC6803中，制得轉基因集胞藻；(7)將步驟(6)制得的轉基因集胞藻在20 30°C條件下通氣培養8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。根據本發明優選的，所述步驟(I)中，PCR擴增psbA2啟動子基因片段的引物為Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。 根據本發明優選的，所述步驟(I)中，PCR擴增集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位點，在其3’端引入SacI酶切位點，所用引物為psbA2-F:5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R:5， -AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3，；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。根據本發明優選的，所述步驟(I)中，PCR擴增花生硫脂酶基因AhFatA的引物為AhFatA-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’ ；AhFatA-R :5’ -GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’ ；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。根據本發明優選的，所述步驟(I)中，PCR擴增花生硫脂酶基因AhFatBl的引物為AhFatBl-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGGCAACTGCTGCTACTGCT-3’ ；AhFatBl-R :5’ -CTGGTCGACTTAGATGCTTTCGGCTG-3’ ；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。根據本發明優選的，所述步驟(I)中花生硫脂 酶基因AhFatA的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示，花生硫脂酶基因AhFatBl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，融合基因AhFatA+AhFatBl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。根據本發明優選的，所述步驟(4)中質粒pBluescript II SK plus T1T2采用如下方法制備擴增大腸桿菌T1T2終止子的質粒PKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位點，在其3’端引入BamHI酶切位點，所用引物為T1T2-F:5’ 一ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC—3，；T1T2-R:5，一TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT—3，；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存；獲得的片段經PstI和BamHI雙酶切后與經相同酶切的pBluescript II SK plus 連接,得到質粒 pBluescript II SK plus T1T2。根據登陸Genbank的兩類花生硫脂酶基因序列(AhFatA :⑶324446 ；AhFatBI ⑶324447)，通過RT-PCR方法，擴增兩類花生硫脂酶基因編碼區全長序列，其中AhFatA基因信使RNA序列為1119個堿基，編碼372個氨基酸(序列如SEQ ID NO. 3所示)，AhFatBl基因信使RNA序列為1242個堿基,編碼413氨基酸(序列如SEQ ID NO. 4, Arachis hypogaeaL.所示)。有益效果(I)本發明所述方法在集胞藻PCC6803中表達花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatBl及兩類基因的融合基因(AhFatA+AhFatBl)，通過轉基因方法增加脂酰-酰基載體蛋白硫脂酶基因的表達。(2)本發明所述方法獲得的轉基因集胞藻在30°C混養條件下轉AhFatA基因陽性集胞藻PCC6803的亞油酸含量增加了 24. 6%，α -亞麻酸含量增加了 18. 8% ;轉AhFatBl基因陽性集胞藻PCC6803的硬脂酸含量增加了 116. 8%，α -亞麻酸含量增加了 56. 2% ;轉AhFatA+AhFatBl基因陽性集胞藻PCC6803的硬脂酸含量增加了 211. 8%，α -亞麻酸含量增加了 19. 9%，十八碳四烯酸含量則增加了 11.6%。(3)本發明所述方法獲得的轉基因集胞藻在20°C混養條件下轉AhFatA基因陽性集胞藻PCC6803的α -亞麻酸和十八碳四烯酸含量分別增加了 49. 2%和34. 8% ;RAhFatBl基因陽性集胞藻PCC6803的棕櫚油酸和Y -亞麻酸酸含量分別增加了 53. 8%和57. 3% ;轉AhFatA+AhFatBl基因陽性集胞藻PCC6803的油酸和α -亞麻酸含量分別增加了 42. 5%和19. 0%。(4)本發明所述方法獲得的轉基因集胞藻具有較強的低溫耐受性。
(5)本發明首次在集胞藻PCC6803中表達硫脂酶基因，為對于提高集胞藻PCC6803總脂肪酸含量、增強其生物量具有重要意義，這為集胞藻PCC6803中多不飽和脂肪酸的研究提供了理論支持。
圖1為花生硫脂酶基因轉集胞藻同源重組載體結構圖；其中A、表達載體pSDFatA, B、表達載體 pSDFatBl, C、表達載體 pSDFatA+FatBl ；圖2為30°C混養條件下外源硫脂酶基因在集胞藻PCC6803中的表達量柱狀圖；圖3為20°C混養條件下外源硫脂酶基因在集胞藻PCC6803中的表達量柱狀圖； 圖4為AhFatA基因在集胞藻PCC6803中表達的Western blot分析；其中1、野生型集胞藻PCC6803 ;2、含表達載體pSDFatA的轉基因集胞藻PCC6803 ;3、含表達載體pSDFatA+FatBl的轉基因集胞藻PCC6803。圖5為AhFatBl基因在集胞藻PCC6803中表達的Western blot分析；1:野生型集胞藻PCC6803 ；2 :含表達載體pSDFatBl的轉基因集胞藻PCC6803 ；3 含表達載體pSDFatA+FatBl的轉基因集胞藻PCC6803。圖6為30°C混養條件下轉硫脂酶基因對集胞藻生長的影響；圖7為20°C混養條件下轉硫脂酶基因對集胞藻生長的影響。
具體實施例方式下面結合說明書附圖及實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明所保護范圍不限于此。實驗材料來源大腸桿菌菌株(Escherichia coli) DH5 α及Τ3載體購自北京全式金生物技術有限公司；野生型集胞藻PCC6803購自中國科學院典型培養物保藏委員會淡水藻種庫；質粒ρΚΚ233-2 購自 Clontech 公司；質粒pBluescript II SK plus購自天津博美科生物技術有限公司；質粒PUC4k購自中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心；其它所使用的酶、試劑及試劑盒等均為市售產品。實施例1分離克隆用于構建轉集胞藻PCC6803表達載體的花生硫脂酶基因AhFatA、花生硫脂酶基因AhFatBl和融合基因AhFatA+AhFatBl的cDNA片段及同源重組片段psbA20RFcDNA片段。集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段克隆根據GenBank 登陸的集胞藻 PCC6803 (登錄號BA000022，AP012205，序列如 SEQID NO. 7, Synchocystis sp. PCC6803 所不)中 psbA20RF cDNA 序列設計引物psbA2-F 5，-CTTGCGGCCGCCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3，，psbA2-R 5，AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3，，擴增程序如下94°C預變性5min ;94°C變性30s，58°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后；72°C延伸10min，4°C保存。PCR反應結束后進行電泳切膠回收，連接到T3載體后轉化大腸桿菌DH5ci，篩選陽性克隆并測序。獲得集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段。集胞藻PCC 6803的psbA2啟動子基因片段克隆根據GenBank 登陸的集胞藻 PCC 6803 (登錄號BA000022，AP012205)中psbA20RF前端序列設計引物，將psbA20RF前500bp作為啟動子序列(序列如SEQ ID NO. 6，Synchocystis sp. PCC6803 所不)，設計 PCR 引物Promotor-F: 5，-GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3，，
Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTT ATGTAT-3’，擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C延伸10min，4°C保存。PCR反應結束后進行電泳切膠回收，連接到T3載體后轉化大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆并測序。獲得集胞藻PCC 6803的psbA2啟動子基因片段。大腸桿菌T1T2終止子片段克隆根據GenBank登陸的大腸桿菌T1T2(U02439.1)片段序列(序列如SEQ ID NO :8，)設計引物T1T2-F:5’ -ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3，；T1T2-R:5， -TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3，；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸30s，35個循環后，72°C 10min，4°C保存；基因片段Promotor+AhFatA 克隆根據GenBank數據庫中公布的花生FatA序列(登錄號為⑶324446)設計擴增引物，所用引物為AhFatA-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’ ；AhFatA-R :5’ -GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’ ；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C延伸10min，4°C保存。PCR反應結束后進行電泳切膠回收，獲得花生硫脂酶基因AhFatA。分別取psbA2啟動子基因片段和花生硫脂酶基因AhFatA各2μ I為模板，進行融合 PCR 反應，程序為94 0C 5min, (94 °C lmin, 55 °C lmin, 72 °C 5min) 2cycles,加入引物 Promotor-F 和 AhFatA-R 各 O. 5 μ 1，進行如下程序(94 °C 30s, 55 °C 30s,72°C 3min)25cycles，72°C 10min，4°C保存。將擴增后的產物連接到T3載體后轉化大腸桿菌DH5 α，篩選陽性克隆并測序。獲得基因片段Promotor+AhFatA。基因片段Promotor+AhFatBl 克隆根據GenBank數據庫中公布的花生FatBl序列(登錄號為⑶324447，⑶324448，EF117308, EF117305, EF117306, EF117309, EF117307)設計擴增引物，所用引物為AhFatBl-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGGCAACTGCTGCTA CTGCT-3’ ；AhFatBl-R :5’ -CTGGTCGACTTAGATGCTTTCGGCTG-3’ ；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。PCR反應結束后進行電泳切膠回收，獲得花生硫脂酶基因AhFatBl。分別取psbA2啟動子基因片段和花生硫脂酶基因AhFatBl各2μ I為模板，進行融合 PCR 反應，所用程序為-MV 5min, (94°C lmin, 55°C lmin, 72°C 5min) 2cycles，加入引物 Promotor-F 和 AhFatBl-R 各 O. 5 μ 1，進行如下程序(94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 3min)25cycles,72°C 10min，4°C保存。將擴增后的產物連接到T3載體后轉化大腸桿菌DH5 a，篩選陽性克隆并測序。獲得基因片段Promotor+AhFatBl。基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl 克隆分別取上述獲得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatBl 各2μ I為模板，進行融合PCR反應，所用程序為94°C 5min, (94 °C lmin, 60 °C lmin,72 °C 5min) 2cycles,加入引物 Promotor-F 和 AhFatBl-R 各 O. 5 μ I,進行如下程序(94 0C 30s, 60 °C 30s, 72 °C 3min) 25cycles, 72 °C 10min，4 °C 保存。將擴增后的產物連接到T3載體后轉化大腸桿菌DH5ci，篩選陽性克隆并測序，獲得基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBlο實施例2轉集胞藻PCC6803表達載體的構建及轉化為更好地研究花生硫脂酶基因的功能，本發明人通過過表達技術使花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatBl在集胞藻PCC6803中表達，根據轉基因陽性集胞藻的表型和脂肪酸組成研究該花生硫脂酶基因的功能。質粒pBluscript SK plus T1T2 的制備擴增大腸桿菌T1T2終止子的質粒PKK233-2，在其5’端引入PstI酶切位點，在其3’端引入BamHI酶切位點，所用引物為T1T2-F:5’ -ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3，；T1T2-R:5’ -TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’ ；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。獲得的片段經PstI和BamHI雙酶切后與經相同酶切的pBluscript SK plus 連接,得到質粒 pBluscript SK plus T1T2。轉集胞藻PCC6803表達載體的構建方法如下將實施例1制得的psbA20RF陽性克隆(含psbA20RF cDNA片段)用SacII和SacI雙酶切，回收psbA20RF cDNA片段；用同樣的方法雙酶切質粒pBluescript II SKplus T1T2回收載體片段I。用回收的psbA20RF cDNA片段和載體片段I做連接反應，轉化大腸桿菌DH5a。通過篩選陽性克隆，獲得前期載體，命名為pBluescript II SK plusTlT2_downstream0將質粒用BamHI單酶切，回收卡那霉素抗性npt片段,質粒pBluescript IISKplus TlT2-downstream用BamHI單酶切，回收載體片段2。用回收的npt片段和載體片段2做連接反應，轉化大腸桿菌DH5 α，通過酶切篩選陽性克隆，獲得卡那霉素抗性載體，命名為 pBluescript II SK plus TlT2-npt-downstream。將實施例1 中得到的陽性克隆 Promotor+AhFatA、Promotor+AhFatBl、Promotor+AhFatA+AhFatBl 質粒 DNA 分別用 Sail 酶切，回收基因片段 Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatBl和基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl。同樣，對含有T1T2終止子且具有卡那霉素抗性的質粒pBluescript II SK plus TlT2npt_downstream進行Sail單酶切，回收載體片段3。分別將基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatBl和基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl和載體片段3做連接反應，轉化大腸桿菌DH5a。通過酶切篩選陽性克隆，獲得集胞藻PCC6803原核表達載體，分別命名為表達載體pSDFatA (見圖1A)、表達載體pSDFatBl (見圖1B)、表達載體pSDFatA+FatBl (見圖1C)。通過自然轉化方法(Williams,J. G. K. (1988)Construction of specificmutations inphotosystem 11 photosynthetic reaction center by geneticengineering methods in Synechocystis 6803. Methods Enzymol. 167:766-778.)將構建好的載體導入集胞藻PCC6803中，經抗生素篩選，鑒定得到轉基因陽性集胞藻。具體步驟取對數培養期(0D730 = 0.6)的集胞藻PCC680330ml于室溫，4500g離心8min，棄上清；加新鮮BG-1l洗滌一次后，加新鮮BG-1l至終 濃度0D730 = 4. 8，并立刻用來轉化；將收集的藻液分裝到到1. 5ml EP管中(每管400 μ I),每管加5_10 μ g質粒，弱光條件下光照溫育6小時，期間搖晃一次。將混合物涂到含有卡那抗生素(12yg/ml)的BG-1l平板上。約10天可見轉化子。制得含表達載體pSDFatA的轉基因集胞藻PCC6803、含表達載體pSDFatBl的轉基因集胞藻PCC6803、含表達載體pSDFatA+FatBl的轉基因集胞藻PCC6803。實施例3轉基因集胞藻陽性植株中花生硫脂酶基因AhFatA、花生硫脂酶基因AhFatBl和AhFatA+AhFatBl基因表達量水平檢測以含表達載體pSDFatA、pSDFatBl、pSDFatA+FatBl的轉基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803為材料,提取總RNA進行Real time quantitative PCR分析。具體操作步驟如下取50ml OD =1. 8的藍藻,4°C, 5000rpm離心IOmin收集藻細胞，液氮中研磨至細粉面狀后加入1. 5ml離心管中，迅速加入Iml TRIZ0L(Invitrogen),顛倒混勻，室溫靜置5min,4°C, 11900rpm離心IOmin,取上清液至新的1. 5ml離心管中，加入200 μ I三氯甲烷，用手劇烈震蕩15s，靜置3-5min，4°C，11900rpm離心10_15min。取上清到新的1. 5ml離心管中，加入500ml異丙醇,顛倒混勻后室溫靜置lOmin。4°C, 11900rpm離心IOmin0去上清,加入Iml 75%乙醇,顛倒振蕩幾次,4°C, 7500rpm離心lOmin。棄上清,室溫下敞口晾干至沉淀透明。加入適量DEPC-H2O溶解沉淀。以上述制得的含表達載體pSDFatA的轉基因集胞藻PCC6803、含表達載體pSDFatBl的轉基因集胞藻PCC6803、含表達載體pSDFatA+FatBl的轉基因集胞藻PCC6803和野生型集胞藻PCC6803總RNA為模板，用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT-PCR Kit反轉錄成cDNA。具體操作步驟如下依次加入I μ I Oligo dT Primers (2. 5 μ Μ) > I μ I dNTPMixture (IOmM)、2 μ g 總 RNA 和 DEPC-H20 至 10 μ I。于 PCR 儀上 65 °C，5min 進行變性退火反應。離心數秒鐘使模板RNA/引物等的混合液聚集于離心管底部。依次加入4μ1
5X PrimeScript Buffer>0. 5 μ IRNase Inhibitor(40U/μ I)、0·5 μ I PrimeScriptRNase (for 2step)和 5 μ I RNase Free ddH20。42°C，30min 后 95°C 5min。即已獲得第一鏈cDNA。以獲得的第一鏈cDNA為模板，以集胞藻PCC6803rnpB基因為內參基因，以TaKaTa公司 PrimeScript RT reagent Kit (Perfect RealTime)進行 Real-time quantitativePCR檢測。其中集胞藻PCC6803rnpB內參基引物序列為上游引物P1: 5 ’ -GTGAGGACAGTGCCACAGAA-3，；下游引物P2 :5，-TGCACCCTTACCCTTTTCAG-3 ’ ；AhFatA 基因的 Real-time quantitative PCR 引物序列為上游引物P3 :5 ’ -AGGCCTCATATGGGTCACTG-3，；下游引物P4 :5 ’ -TGACTTGATCGGTCGCATAG-3，； AhFatBl 基因的 Real-time quantitative PCR 引物序列為上游引物P5 :5 ’ -GCAGCCAATCTTGGAGAGTC-3，；下游引物P6 :5 ’ -TCAGCACCATCTTCAAGTCG-3 ’。Real-time quantitative PCR 具體操作步驟如下依次加入 12. 5 μ I 2X SYBRpremix Ex Taq (TM)、上下游引物各1. O μ l、cDNA 模板 2· O μ I 和 8· 5 μ I ddH20。95°C預變性lmin。95°C 10s, 60°C 30s, 72°C 30s，42 個循環。95°C 10s, 58°C 30s, 72°C 5min。55°C Is,81個循環，每隔0.5s檢測一次。實施例4轉基因集胞藻陽性植株中AhFatA、AhFatBl和AhFatA+AhFatBl蛋白水平檢測以轉化AhFatA、AhFatBl和AhFatA+AhFatBl基因的集胞藻和野生型集胞藻PCC6803為材料,提取藻總蛋白，利用Western blot方法檢測轉基因陽性集胞藻種AhFatA、AhFatBl和AhFatA+AhFatBl蛋白質水平。具體方法如下取自養生長的藻細胞離心收集后用5mL40mM的Tris-Cl (pH8. O)懸浮，然后加入適量的直徑為O. 17mm左右的玻璃珠(購自Sigma公司)至玻璃珠界面上方有O. 5mL的懸浮液。通過渦旋振蕩器以最大速率震蕩lmin，然后置于冰上lmin，如此重復5次。在4000rpm低速離心IOmin收集上清，再將所收集的上清用較高轉速6000rpm進行離心lOmin，收集上清。即得到藻細胞總蛋白。取適量樣品，加等體積的2XBSA，沸水中煮10分鐘。離心后放-201存放。取少量樣品，稀釋一定倍數(5\、10\、20\)，以401111 Tris-Cl (pH8. O)為參照空白，測蛋白質濃度。利用10%SDS-PAGE進行蛋白質電泳，每個上樣孔50yg蛋白。電泳結束后，通過印記法轉移到PVDF膜。然后按照何慶芳等人的方法進行免疫化學分析，檢測AhFatA、AhFatBl 和 AhFatA+AhFatBl 蛋白質水平(Qingfang He 等，Eur. J. Bilchem. , 1999,263，561-570)。結果表明，轉基因集胞藻中，均檢測出AhFatA、AhFatBI和AhFatA+AhFatBl蛋白質水平，而野生型中則沒有信號，見圖4，圖5。實施例5轉基因集胞藻陽性植株中脂肪酸成分分析在30°C，30 μ E. m_2. s—1持續光照下，取轉基因集胞藻和野生型集胞藻，離心后收集菌體，40°C干燥，經甲酯化后進行氣象色譜分析；具體步驟如下(I)稱取適量樣品于厭氧培養管中。(2)加入氯乙酰甲醇4mL。氯乙酰甲醇=1:10 (體積比)。(3)精確加入ImL含有C19:0內標的正己烷溶液。內標濃度為lmg/mL。(4)蓋緊管蓋，80°C水浴兩小時。取出冷卻至室溫。(5)加入7%的碳酸鉀溶液5mL,振蕩均勻,靜置lOmin, I, OOOrpm離心5min分層。
(6)吸取上層液相，由中國農大農業部飼料研究中心進行氣相色譜分析。與對照野生型集胞藻PCC6803相比，在30°C混養條件下轉基因集胞藻
PCC6803pSDFatA、pSDFatBl、pSDFatA+FatBl脂肪酸含量變化如表I所示，20°C混養條件下
轉基因集胞藻PCC6803pSDFatA、pSDFatBl、pSDFatA+FatBI脂肪酸含量變化如表2所示。表I
權利要求
1.一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步驟如下 (1)PCR擴增集胞藻PCC6803的psbA2啟動子基因片段、集胞藻PCC 6803的psbA20RF基因片段、Genbank登錄號為⑶324446的花生硫脂酶基因AhFatA和Genbank登錄號為⑶324447的花生硫脂酶基因AhFatBl ； (2)將步驟(I)獲得的psbA2啟動子基因片段分別與步驟(I)制得的花生硫脂酶基因AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatB I進行融合PCR擴增，分別制得基因片段Promotor+AhFatA 和基因片段 Promotor+AhFatBl ； (3)將步驟(2)制得的基因片段Promotor+AhFatA和花生硫脂酶基因AhFatBl經融合PCR 擴增，制得基因片段 Promotor+AhFatA+AhFatBl ； (4)將步驟(I)獲得的psbA20RF基因片段經SacII和SacI雙酶切后與經相同酶切的 pBluescript II SK plus T1T2 連接，得到質粒 pBluescript II SK plusTlT2-downstream ； 分別對質粒 pBluescript II SK plus TlT2_downstream 和質粒 pUC4K 進行 BamHI單酶切，電泳后分別回收pBluescript II SK plus TlT2_downstream載體片段和pUC4K中的npt片段，對載體片段去磷酸化后與npt片段連接，得到質粒pBluescript II SKplusTlT2-npt-downstream。
(5)將步驟(2)制得的基因片段Promotor+AhFatA、基因片段Promotor+AhFatBl或者步驟(3)制得的基因片段Promotor+AhFatA+AhFatBl插入步驟(4)制得的質粒pBluescriptIISK plus TlT2-npt_downstream 中，制得重組載體； (6)將步驟(5)制得的重組載體轉化至集胞藻PCC6803中，制得轉基因集胞藻； (7)將步驟(6)制得的轉基因集胞藻在20 30°C條件下通氣培養8 12天，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴增psbA2啟動子基因片段的引物為Promotor-F:5’ -GATGTCGACGCTTTAGCGTTCCAGTG-3’ ；Promotor-R :5’ -CATTTGGTTATAATTCCTTATGTAT-3’ ； 擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴增集胞藻PCC6803psbA20RF基因片段，在其5’端引入SacII酶切位點，在其3’端引入SacI酶切位點，所用引物為psbA2-F :5’ -CTTCATATGCCGCGGATGACAACGACTCTCCAAC-3’ ；psbA2-R :5’ AGTGAGCTCTTAACCGTTGACAGCAGG-3’ ； 擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴增花生硫脂酶基因AhFatA的引物為AhFatA-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGTTGAAGGTTTCATGCAACG-3’ ；AhFatA-R :5’ -GCGGTCGACTCATAATCTTGAAGCTT-3’ ；擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中，PCR擴增花生硫脂酶基因AhFatBl的引物為AhFatBl-F :5’ -GGAATTATAACCAAATGGCAACTGCTGCTACTGCT-3’ ；AhFatBl-R :5’ -CTGGTCGACTTAGATGCTTTCGGCTG-3’ ； 擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(I)中花生硫脂酶基因AhFatA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，花生硫脂酶基因AhFatBl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，融合基因AhFatA+AhFatBl的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)中質粒pBluescriptIISKplus T1T2采用如下方法制備 擴增大腸桿菌T1T2終止子的質粒ρΚΚ233-2，在其5’端引入PstI酶切位點，在其3’端弓丨入BamHI酶切位點，所用引物為T1T2-F:5’ -ATACTGCAGCCAAGCTTGGCTGTTTTGGC-3’ ；T1T2-R:5’ -TTAGGATCCCCCATTATTGAAGCATTTAT-3’ ； 擴增程序如下94°C預變性5min，94°C變性30s，60°C復性30s，72°C延伸lmin，35個循環后，72°C 10min，4°C保存；獲得的片段經PstI和BamHI雙酶切后與經相同酶切的pBluescript II SK plus 連接,得到質粒 pBluescript II SK plus T1T2。
全文摘要
本發明涉及一種提高集胞藻PCC6803脂肪酸含量的方法，步驟如下(1)PCR擴增psbA2啟動子、花生硫脂酶基因AhFatA和AhFatB1；(2)經融合PCR，Promotor+AhFatA和Promotor+AhFatB1；(3)經融合PCR擴增，制得Promotor+AhFatA+AhFatB1；(4)插入質粒中，制得重組載體；(5)經轉化制得轉基因集胞藻；(6)在30℃條件下培養，制得高脂肪酸含量的集胞藻PCC6803。本發明所述方法獲得的轉基因集胞藻在30℃混養條件下轉AhFatA基因陽性集胞藻PCC6803的亞油酸含量明顯增加，具有廣闊應用前景。
文檔編號C12N15/63GK103014037SQ201210529390
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月10日 優先權日2012年12月10日
發明者畢玉平, 陳高, 何慶芳, 張燕, 李偉智, 邊斐, 范仲學, 單雷, 彭振英, 馬德源 申請人:山東省農業科學院高新技術研究中心