專利名稱：一株高產中性蛋白酶的米曲霉菌株及其液體發酵方法
技術領域：
本發明涉及一株高產中性蛋白酶的米曲霉突變株及其液體發酵技術,屬于生物工程技術領域。
背景技術：
中性蛋白酶作用條件溫和，是最早發現并廣泛應用于工業化生產的蛋白酶制劑，可廣泛應用于食品、飼料、制藥等行業，現在市場上多是由細菌發酵生產中性蛋白酶，還未發現有通過液體發酵米曲霉來生產中性蛋白酶的方法。米曲霉液體發酵具有酶系豐富、發酵容易控制、發酵后提取工藝簡單等優點，因此受到越來越多的關注，米曲霉液體發酵受其表型的影響，產孢子的菌株進行液體發酵時往往會出現菌絲結團、發酵料液粘稠等不利現象，進一步影響發酵活力。所以，選育高產中性蛋白酶的米曲霉菌株，表型適合液體發酵，可進行大規模生產中性蛋白酶是非常有意義的任務。
發明內容
本發明的目的是提供一株適于液體發酵高產中性蛋白酶的米曲霉菌株及其液體發酵生產方法。本發明提供一種米曲霉(Aspergillus oryzae)菌種,該菌株已經于2012年11月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址位于北京市朝陽區北辰西路I號院3號，(郵編100101)，保藏編號為CGMCC No6848。所述米曲霉突變菌株CGMCC6848采用米曲霉M321和米曲霉J5進行多輪原生質體電融合育種選育獲得。米曲霉M321在麩皮豆柏固體培養基中發酵酶活最高15000u/g，液體發酵中性蛋白酶最高450u/ml，米曲霉J5固體發酵產酶最高活力為8000u/g，液體發酵最高酶活為10000u/ml，突變株CGMCC6848液體發酵酶活達到20000u/ml，經發酵條件優化后，液體發酵平均產酶活力在25000u/ml。米曲霉M321是經紫外誘變篩選到的高產中性蛋白酶菌株，其液體發酵產中性蛋白酶酶活力極低，不到500u/ml，米曲霉J5生長表型為菌絲型不產孢子，液體培養其菌絲短細，發酵液混合均勻，物料、溶氧傳遞效果良好，為了得到一株適合液體發酵的高產中性蛋白酶菌株，對兩株菌先進行紫外滅活后再進行多輪電融合選育，直到選育出一株低產孢子、高產蛋白酶的菌株。所述米曲霉囷株所廣中性蛋白酶酶活力在20821u/mL以上。米曲霉突變菌株CGMCC6848液體發酵產中性蛋白酶的的方法，包括如下步驟種子培養菌株進行搖瓶培養，搖瓶培養基配方為淀粉3-10%，大豆蛋白2-5%，麩皮0. 2-0. 5 %，硝酸鈉0. 2-0. 5 %，磷酸二氫鉀0. 2-0. 5 %，玉米漿0. 5-2 %。培養溫度31-33°C，培養時間50-70小時。液體發酵在50L發酵罐進行液體發酵實驗，接種量10-15%，發酵過程補料控制pH在6. 0-6. 5，培養溫度30-32°C，罐壓0. 07MPa，風量0. 2-1. 5vvm，培養周期100-120小時。
中性蛋白酶的提取與精制發酵結束后，按發酵液體積加入40%的水和O. 3%氯化鈣，加入3%珍珠巖助濾劑，進行壓濾，濾液經超濾濃縮后可進行酒精溶析得到固體酶制齊U，也可將濃縮液加入穩定劑(金屬離子)得到液體酶制劑。發酵培養基配方為淀粉5-10%，大豆蛋白3-6%，麩皮1_3%，硝酸鈉O. 3-1%，磷酸二氫鉀O. 2-0.8%，玉米漿1_2%，補料配方為淀粉10-20%，豆餅粉4-8%，硫酸銨
0.2-0. 5%，玉米漿 O. 8-1. 5%。有益效果
本發明通過對原始菌株進行誘變提高酶活后，對兩株不同表型的米曲霉進行原生質體融合篩選，再經過培養基優化和發酵工藝條件優化，建立了液體發酵中性蛋白酶的方法，發酵活力在2. 5萬u/ml，生產的中性蛋白酶在40°C保溫Ih后剩余酶活為91%，具有良好的耐熱性，可廣泛應用于食品、飼料、紡織等行業。
圖1不同pH下的相對酶活圖2不同溫度下的相對酶活
具體實施例方式以下通過具體實施例對本發明做更詳細的說明，具體實施案例僅為舉例說明，不作為對本發明實施范圍的限定。菌株的選育I原生質體的制備取兩株出發菌株的新鮮斜面，用無菌水洗脫菌體，在有玻璃珠的試管振蕩使菌體分散，離心收集菌體，用O. 6M山梨醇滲透壓穩定劑(O.1M檸檬酸緩沖液+0. 6M山梨醇+0. OlM EDTA)懸浮，離心洗滌后收集用滲透壓穩定劑懸浮，置冰中備用。然后加入溶菌酶
1.2%、蝸牛酶O. 8%、纖維素酶O. 8%，在32°C進行酶解6小時，制得原生質體備用，其中原生質體制備率和再生率的計算方法如下在普通培養基培養并計菌落數為A ;將原生質體懸浮液稀釋一定倍數，在普通培養基培養并計菌落數為B ;在高滲再生培養基培養并計菌落數為C。原生質體制備率=(A-B) /A*100 %原生質體再生率=(C-B)/(A-B)*100%普通培養基配方(g/1)=KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g，(NH4)2SO4O. 6g，可溶性淀粉 20g，瓊脂粉 20g，豆汁 IOOOml0豆汁再生培養基(g/1)KH2P04lg,MgS040 . 8g，(NH4)2SO4O. 6g，NaC135. lg，可溶性淀粉12g，瓊脂粉20g，豆汁1000ml。2原生質體電融合將制得的兩株菌的原生質體稀釋到濃度為IO6個/ml，各取5ml分別置于2個平板上，在超凈工作臺中，于18W紫外燈15cm處照射15min，將紫外滅活的兩親本菌株的原生質體懸液用O. 6mol/l的山梨醇溶液洗滌2次后分別懸于電擊液中，然后將兩親本菌株的原生質體混合均勻，進行電融合操作，選用方波脈沖，條件為低壓120v ;脈沖寬度100ms ;脈沖個數:10 ;脈沖間隔時間8s ;高壓3000v ;脈沖寬度0. 5ms :脈沖個數3 ;脈沖間隔時間6s，電融合結束后，將融合液經稀釋后接種在再生培養基上，30°C培養5天，長出單菌落后再將單菌落依次挑取接種在酪蛋白平板上，30°C培養4天，計算HC值，從中選出5株產孢子少且HC (HC =水解圈直徑/菌落直徑)值高的新菌株，分別是F-13、F-21、F-40、F-53、F-69。3搖瓶發酵篩選將選出的5株菌進行搖瓶發酵，淀粉5 %，大豆蛋白4%，麩皮O. 5 %，硝酸鈉0.3%,磷酸二氫鉀O. 4%，玉米漿1.2%。培養溫度31 °C培養時間65小時，培養結束后用福林酚法測發酵液中中性蛋白酶活力，5株菌搖瓶實驗中性蛋白酶活力如下
權利要求
1.一株高產中性蛋白酶的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae),菌株保藏號為CGMCC6848。
2.根據權利要求1所述的高產中性蛋白酶的米曲霉菌株，所述米曲霉菌株具有低產孢子、高產中性蛋白酶的特性，發酵活力在2. 5萬u/ml。
3.根據權利要求1所述的高產中性蛋白酶的米曲霉菌株，所述米曲霉菌株所產中性蛋白酶酶活力在20821u/mL以上。
4.一種利用米曲霉菌株CGMCC6848生產中性蛋白酶的方法，包括如下步驟。
種子培養菌株進行搖瓶培養，搖瓶培養基配方為淀粉3-10%，大豆蛋白2-5%，麩皮O.2-0. 5%，硝酸鈉O. 2-0. 5%，磷酸二氫鉀O. 2-0. 5%，玉米漿O. 5-2% 培養溫度31-33 °C，培養時間50-70小時； 液體發酵在50L發酵罐進行液體發酵實驗，接種量10-15%，發酵過程補料控制pH在6.0-6. 5，培養溫度30-32。。，罐壓O. 07MPa,風量O. 2-1. 5vvm,培養周期100-120小時；發酵后進行中性蛋白酶的提取與精制。
5.根據權利要求4所述一種利用米曲霉菌株CGMCC6848生產中性蛋白酶的方法，其特征在于所述中性蛋白酶的提取與精制方法如下發酵結束后，按發酵液體積加入40%的水和O. 3%氯化鈣，加入3%珍珠巖助濾劑，進行壓濾，濾液經超濾濃縮后可進行酒精溶析得到固體酶制劑。
6.根據權利要求4所述一種利用米曲霉菌株CGMCC6848生產中性蛋白酶的方法，其特征在于所述發酵培養基配方為淀粉5-10%，大豆蛋白3-6%，麩皮1-3%，硝酸鈉O. 3-1%，磷酸二氫鉀O. 2-0. 8%,玉米漿1_2%，補料配方為淀粉10-20%，豆餅粉4_8%，硫酸銨O. 2-0. 5%，玉米漿O. 8-1. 5%ο
7.根據權利要求1所述的高產中性蛋白酶的米曲霉菌株在生產中性蛋白酶中的應用。
全文摘要
本發明涉及一株高產中性蛋白酶的米曲霉突變株及其液體發酵方法，所述米曲霉菌株所產中性蛋白酶酶活力在20821u/mL以上。米曲霉突變菌株CGMCC 6848液體發酵產中性蛋白酶的方法，包括如下步驟1.種子培養；2.液體發酵；3.中性蛋白酶的提取與精制。本發明建立的液體發酵中性蛋白酶的方法，發酵活力在2.5萬u/ml，生產的中性蛋白酶在40℃保溫1h后剩余酶活為91％，具有良好的耐熱性，可廣泛應用于食品、飼料、紡織等行業。
文檔編號C12N1/15GK103013844SQ201210559100
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月20日 優先權日2012年12月20日
發明者劉順啟, 王興吉, 李方方, 劉文龍 申請人:山東隆科特酶制劑有限公司