專利名稱：一種柑橘果酒釀造酵母菌的篩選及柑橘果酒生產方法
技術領域：
本發明涉及一種高品質柑橘果酒釀造酵母菌的篩選及柑橘果酒生產方法，屬于生物工程領域。
背景技術：
我國是世界上最大的水果生產國，而水果深加工業卻一直很薄弱。果酒是以水果為原料經過發酵而成的低度飲料酒，富含糖、有機酸、酯類及多種維生素，含有豐富的具有增強免疫功能的S0D。果汁中的主要成分是糖類，酵母菌則是以糖類物質為基質進行發酵，生成酒精和一定量的香味物質。所以酵母品種是釀造果酒的關鍵因素之一，酵母性狀的好壞直接影響到所釀果酒的口感和風味，決定果酒品質的優劣。果酒有很多種，其中以葡萄釀造的葡萄酒規模最大，目前使用的果酒酵母多為葡萄酒釀造專用酵母。我國是柑橘生產大國，具有豐富的資源，但高品質柑橘酒釀造酵母很少。因此篩選出一種高品質柑橘果酒釀造用酵母菌是柑橘果酒生產的關鍵課題。盡管果酒因其具有的營養和保健作用而備受現代人喜愛，但果酒酵母菌在生產或者發酵品質上仍然存在不少的問題1、專用發酵菌種缺乏，目前果酒生產中所采用的酵母大多數為葡萄酒酵母，這種酵母是針對葡萄酒生產工藝的特點開發出來的，在其他果酒生產中效果并不好。市場上缺少高品質的柑橘果酒釀造用的酵母菌。2、產品風味不穩定用篩選的純種釀酒酵母作為發酵菌種釀造的酒通常風味過于平淡。因此，目前選育果酒酵母已不只局限于釀酒酵母cere而擴展到水果中天然存在的一些產香酵母、產酯酵母,如孢漢遜酵母屬Hanseniaspora、克勒克酵母屬JHoecAera和畢赤酵母屬/7ZcAia等酵母的選育。這些酵母會對果酒的總體風味產生積極的影響，能生成很多芳香物質和特殊風味成分，使酒的風味特征明顯改善。
3、產品質量不穩定有的新果酒產品剛上市不久，就出現了質量問題，主要表現為顏色加重、氧化感增加、果香變淡，嚴重時有失光、沉淀現象。果酒的質量不穩定與酵母菌的質量有關。本發明以野生柑橘-皺皮柑CYtrw1S verrucosa Hort.為原料，以發酵力和發酵原酒品質作為指標，篩選出了一株高品質柑橘果酒發酵專用酵母菌。
發明內容
本發明從江漢平原廣泛分布的一種野生柑橘-皺皮柑的汁液中，采用微生物分離純化的方法，獲得了一種高品質果酒釀造專用酵母菌。該酵母菌經培養，用于柑橘果酒的釀造，酒質穩定、口感柔和。該酵母菌具有良好的應用前景。本發明高品質果酒釀制用酵母菌的篩選純化及培養是這樣進行的。具體步驟為1、將野生皺皮柑剝皮，榨汁，裝入瓶中，在適宜溫度下，皺皮柑汁液可進行自行發酵，酒體散發果香味，但品質不穩定，酒液呈淡淡酸味。證實野生皺皮柑中存在釀造果酒所用的酵母菌。2、收集自行發酵帶酒香的皺皮柑汁液，吸取0.2mL涂布均勻涂布于裝有已滅菌固體豆芽汁培養基的培養皿上，28°C恒溫箱培養2d后進行鏡檢。從中挑取生長菌落良好，有明顯酵母菌菌落特征，呈酒香的菌體。在無菌操作臺上，挑取選定的酵母菌劃線接種于新鮮斜面培養基上，培養3d。除了酵母菌外還伴有少量霉菌，進一步進行純化，挑取形態特征突出的釀酒酵母菌分區劃線，重復以上步驟:T5次，直到分離出純單菌株。經培養，單菌株在斜面培養基上生長的菌落呈乳白色，酵母菌長勢良好，并伴有濃郁的酒香味。將該分離純化培養的柑橘果酒釀造專用酵母菌于2012年11月22日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC No =2012472,名稱為釀酒酵母ZGJ-KfeccAart與fcmcerevisiae ZGJ-1 )。保藏地址中國.武漢.武漢大學。以下簡稱ZGJ-1。ZGJ-1菌株的菌學特性
a、形態特征細胞個體呈球形或橢圓形，大小為5. 2MmX 12. 7Mm0單個或成雙，芽殖；培養物為奶油狀；菌落中間呈圓錐狀凸起、表面光滑、邊緣整齊；有濃郁的酒香味，在培養基上生長速度快。b、生理生化特征ZGJ-1與GenBank上其他酵母菌的18S rRNA和26S rRNA核苷酸序列的一致性分別為99%和97%,該菌株屬于釀酒酵母cerevisiae0在碳源的氧化測定中，當以蔗糖、a -D-葡萄糖為唯一碳源時，GZJ-1具有強氧化能力，測定結果呈陽性，菌株生長能力好，代謝產物積累顯著；當以D-棉子糖為唯一碳源時，GZJ-1氧化能力呈弱陽性，菌株生長能力較弱，代謝產物積累不顯著。在碳源利用上，ZGJ-1可以有效利用蔗糖和a -D-葡萄糖，其次利用D-棉子糖和水蘇糖，不能利用龍膽二糖、麥芽糖、D-半乳糖、核糖醇等。該菌株 最適生長溫度范圍為26 28°C。本發明應用釀酒酵母ZGJ-1 (CCTCC No :2012472)用于柑橘果酒釀造的生產方法，其步驟為
1、原料處理選用成熟度高、無腐爛的柑橘為原料，清洗一去皮、分瓣一蒸鍋蒸3飛min，鈍化柑橘中的酶一用榨汁機打成漿一用滅菌的雙層紗布過濾于發酵瓶中一得到柑橘果漿，測出果漿的總糖度10%，并記錄結果；
2、果汁澄清(果膠酶處理):測定柑橘果漿的原始pH(pH=4. 5)，分裝在滅菌的發酵瓶中，加入0. 2%的果膠酶，50°C靜置澄清4h，待澄清完全，取上清液調整柑橘果漿糖度為20% (若沒有達到，則加白砂糖進行微調)。3、主發酵在含澄清已滅菌的果汁發酵瓶中，按照比例為5 10% (最佳7%)加入上述擴培后的種子液，同時按6(T80mg/L的比例加入偏重亞硫酸鉀，在20±1°C條件中靜置發酵擴12天，過濾即得柑橘果酒發酵原液；
4、果酒品質的指標測定結果測定發酵原液的各項指標，用pH酸度計測酸度、糖度計測糖度、用酒精計測乙醇含量。結果表明，用釀酒酵母ZGJ-1所釀造的果酒，其酸度(以檸檬酸計，mol/L)為0. 28、糖度(以葡萄糖計，g/L)為5. O、酒度(％vol)為12，三項指標顯示該發酵液已達到果酒國標要求。該果酒的品質指標明顯優于皺皮柑自行發酵15d后的果酒品質(酸度為0. 26、糖度為5. 0和酒度為4)。5、發酵原酒品質(感官評定)發酵產出的酒液經后酵2°C貯藏2個月即為成品柑橘果酒。外觀評價色澤和澄清度。用釀酒酵母ZGJ-1所釀造的果酒顏色為淡黃色，為柑橘果酒應有之色澤，酒體澄清透明、有光澤；具有純正和諧的柑橘果香，口味清爽細膩，酒體豐滿，具有柑橘果酒的獨特性。高品質果酒釀造酵母菌ZGJ-1的凝聚性及發酵力測定1、凝聚性試驗將釀酒酵母ZGJ-1與法國原裝釀酒酵母K1、市售安琪酵母分別接種于豆芽汁液體培養基中，25°C培養5d。取培養液以3500 r/min離心15min，收集酵母細胞，然后用無菌水洗滌2 3次。準確稱取酵母泥lg，放入15mL的離心管中，然后加入IOmL醋酸緩沖溶液搖勻，使其成懸浮狀態，并在20°C水浴中靜置20min，再將此懸浮液連續搖動5min，使酵母重新懸浮，再靜置，在20min內每Imin記錄I次沉淀酵母的容積，根據懸浮液靜置IOmin的沉淀容積確定凝聚性的強弱。本發明酵母菌的本斯值為2. 3mL，凝聚性為較強-適中，比法國釀酒酵母Kl和市售安琪酵母的凝聚性好，達到了優質酵母的標準。2、發酵力的測定采用失重法測定發酵力。將活化好的釀酒酵母ZGJ-1接入已滅菌的豆芽汁液體培養基，25°C發酵。發酵時每24h測I次重量,培養12d，以不接菌種的豆芽汁培養基作為空白對照。培養12d后，ZGJ-1的總發酵力達到了 12. 79g/50mL。在發酵過程中失重高峰在前5d，說明該酵母菌發酵旺盛期是前5d，發酵力為7. 36g/50mL。本發明的優點及應用前景
本發明從江漢平原廣泛分布的一種野生柑橘-皺皮柑的汁液中分離得到了一株適應柑橘發酵的優良菌株。由于該菌株是從皺皮柑汁液中分離出來的，皺皮柑偏酸(PH=4. 5)、偏苦，所以該酵母菌株能夠用于生產耐受果汁酸度的果酒。通過鑒定該菌株為釀酒(高產酒)酵母菌類型。將本發明酵母菌ZGJ-1與法國釀酒酵母Kl及市售安琪酵母三種菌株產氣性能、產酒精能力、凝聚性、產香能力及感官評定進行比較，發現本發明酵母菌的發酵能力強、發酵特性好、發酵所得柑橘果酒品質優，且酒體澄清透明、色澤淡黃，具有果酒的典型風味。利用釀酒酵母ZGJ-1釀造的營養型 柑橘果酒，品質良好，已展現出良好的利用潛力。
圖1本發明酵母菌株ZGJ-1的菌落形態，
圖2本發明酵母菌株ZGJ-1的細胞形態(400X )。
具體實施例方式 實施例1 :高品質果酒釀制用酵母菌ZGJ-1的分離、純化及培養1、將野生皺皮柑剝皮，榨汁，裝入瓶中，在適宜溫度下，皺皮柑汁液可進行自行發酵，酒體散發果香味，但品質不穩定，酒液呈淡淡酸味。初步判定野生皺皮柑中存在有釀酒用酵母菌。2、在無菌操作臺上，將此酵母菌涂布于含有滅菌豆芽汁固體培養基的培養皿上，放入28°C恒溫箱中培養。3d后，發現培養基中除了酵母菌外還伴有少量霉菌。挑取酵母菌接種在重新配制的新鮮培養基上，培養3d后，重復以上步驟，直到分離出酵母菌純單菌株。在培養基上菌落呈乳白色，酵母菌長勢良好，較濕潤、透明，并伴有酒香味(見圖1)。根據菌落特征，確定為釀酒酵母cerevisiae系列。挑取酵母菌單菌體做裝片,在顯微鏡下可以觀察到酵母菌的形態(見圖2)。細胞為圓形或橢圓形，大小為5. 2MfflX 12. 7Mm。將該菌株進一步劃線培養后送鑒定，命名為酵母菌ZGJ-1，保藏號為CCTCC No :2012472。實施例2 :將酵母菌ZGJ-1 (CCTCC No =2012472)用于釀造柑橘果酒1、原料處理選用成熟度高、無腐爛的新鮮柑橘IOkg為原料。清洗一去皮、分瓣一蒸鍋蒸:T5min，鈍化柑橘中的酶一用榨汁機打成漿一用滅菌的雙層紗布過濾于滅菌后發酵罐中—得到柑橘果漿。測出果汁的總糖度，并記錄結果。2、果膠酶處理測定柑橘果漿的原始pH，加入0. 2%的果膠酶，50°C下靜置澄清4h，待澄清完全，取上清液調整柑橘果漿糖度為20%，若沒有達到，則加白砂糖進行調節。3、主發酵在滅菌的發酵瓶中，加入5^10% (最佳7%)的本發明酵母菌ZGJ-1，按6(T80mg/L的比例加入偏重亞硫酸鉀，在20土1°C條件中靜置發酵9_12d，即得柑橘果酒發酵液。4、果酒品質的測定結果用本酵母菌所釀造的果酒，其酸度(以檸檬酸計，mol/L)為0. 28、糖度(以葡萄糖計，g/L)為5. O、酒度(％vol)為12 (若發酵液繼續保溫發酵3d，酒度可達到18)，符合果酒國標要求。該釀造果酒的品質指標也明顯優于皺皮柑自行發酵15d后的果酒品質(酸度為0. 26、糖度為5. 0和酒度為4)。實施例3 :柑橘果酒釀造時果膠酶添加量的確定1、選用成熟度高、無腐爛的新鮮柑橘為原料；清洗一去皮、分瓣一蒸鍋蒸T5min，鈍化柑橘中的酶一用榨汁機打成漿一用滅過菌的雙層紗布過濾于發酵瓶中一得到柑橘果漿。測出果汁的總糖度，并記錄結果。2、果膠酶處理測定柑橘果漿的原始pH，分裝在滅菌的發酵瓶中并編號，分別加入含量為0. 1%、0. 2%、0. 3%和0. 4%的果膠酶。將發酵瓶放在50°C恒溫箱內靜置澄清4h，然后分別取上清液在波長610nm處測定透光率，并記錄結果。若透光率越大，則表明過果汁的澄清度越高。由表I知添加0.2%的果膠酶，透光率可達到95%，果汁清澈。故本發明所采用果膠酶添加量為0. 2%。表I不同果膠酶用量下發酵液的粘度
權利要求
1.一種柑橘果酒釀造酵母菌，保藏號為CCTCC NO: 2012472;具備發酵能力強、產酒高、產香好的特點。
2.一種柑橘果酒生產方法，其步驟為 ⑴原料處理選用成熟度高、無腐爛的柑橘為原料，清洗一去皮、分瓣一蒸鍋蒸3-5min，鈍化柑橘中的酶一用榨汁機打成漿一用滅菌的雙層紗布過濾于發酵瓶中一得到柑橘果漿，測出果漿的總糖度，并記錄結果； ⑵果汁澄清及果膠酶處理測定柑橘果漿的原始PH，分裝在已滅菌的發酵瓶中，加入0.2%的果膠酶，50°C靜置澄清4h，待澄清完全，取上清液調整柑橘果漿糖度為20%，若沒有達到，則添加白砂糖進行微調； ⑶將保藏號為CCTCC NO: 2012472的釀酒酵母ZGJ-1用豆芽汁培養基進行斜面培養，然后進一步在250mL滅菌的三角瓶內進行逐級擴培，最終制備種子液； ⑷主發酵在含澄清已滅菌的果汁發酵瓶中，按照比例為5 10%加入上述擴培后的種子液，同時按6(T80mg/L的比例加入偏重亞硫酸鉀，在20± 1°C條件中靜置發酵9-12d，過濾即得柑橘果酒發酵原液； (5)果酒品質的指標測定發酵完后，用pH酸度計測酸度、糖度計測糖度、用酒精計測乙醇含量； (6)發酵產出的原酒液經后酵2°C貯藏2個月即得成品柑橘果酒。
3.根據權利要求2所述的一種柑橘果酒生產方法，其特征在于步驟中，上述果膠酶最佳加入量為0. 2% ;上述種子制備液最佳加入量為7%。
全文摘要
本發明提出了一種柑橘果酒釀造酵母菌，保藏號為CCTCC NO2012472，及其用它釀造高品質柑橘果酒的生產方法。其步驟為原料處理、果汁澄清(果膠酶處理)、發酵種子制備、主發酵、過濾除渣得原酒液，再經后酵2℃貯藏2個月即為成品柑橘果酒。利用本發明釀造的柑橘果酒顏色為淡黃色，酒體澄清透明、有光澤；具有純正獨特的柑橘果香，口味清爽細膩，酒體和諧豐滿，余味悠長，具備柑橘果酒的典型特征。此發明將為果農在柑橘深加工方面打開一條致富之路。
文檔編號C12N1/18GK103045495SQ20121056188
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月22日 優先權日2012年12月22日
發明者彭宇, 孫美玲, 楊艷燕, 楊登想, 楊燁, 劉芳, 柴靜 申請人:湖北大學