穩定的多肽組合物的制作方法

專利名稱：穩定的多肽組合物的制作方法
穩定的多肽組合物本申請是申請日為2007年03月19日、中國申請號為200780017774.3、發明名稱為“穩定的多肽組合物”的發明申請的分案申請。相關申請本申請要求享有以下美國臨時專利申請的優先權，其每一篇為所有目的而全文納入本文參考:I)美國臨時專利申請60/783，622號，其提交于2006年3月17日，其名稱為“穩定化的多肽和用于評估和增加其穩定性的方法”；2)美國臨時專利申請60/812,688號，其提交于2006年6月9日，其名稱為“穩定化的多肽和用于評估和增加其穩定性的方法”；3)美國臨時專利申請60/873，502號，其提交于2006年12月8日，其名稱為“用于評估和增強多肽生物物理性質的方法”;和4)美國臨時專利申請60/873，996號，其提交于2006年12月8日，其名稱為“穩定化的多肽組合物”。本說明書中引用的任何專利、專利申請、和參考文獻的內容都全文納入本文參考。
背景技術：
現在，蛋白質穩定性被認為是蛋白質(如，抗體分子)開發和升級的中心議題。抗體的重鏈和輕鏈可變區序列處在選擇壓力之下，其序列可在不同抗體之間有顯著差別(Wu和Kabat，1970)。在人基因 組內嵌有大量功能性胚系可變重鏈Γ40 ；Tomlinson等，1992 ；Tomlinson 等，1994 ；Matsuda 和 Honjo, 1996)、可變 κ 鏈( 40 ；Meindl 等，1989 ；Cox 等，1994 ;Barbie 和 Lefranc, 1998)和可變 λ 鏈( 30 ;Williams 等，1996 ;Kawasaki,等，1997)基因。免疫系統產生許多重鏈和輕鏈可變區胚系組合的能力是產生抗體多樣性的一種機制(Edelman, 1959 ;Fraftek, 1961)。其它多樣性源自在可變區和恒定結構域之間插入可變連接肽區域——J-連接肽(加上重鏈的D-連接肽)(Leder，1982)。選擇抗特定抗原的胚系抗體，接著，表達單一抗體(所述抗體帶有所選擇的可變區胚系和(D-)J-連接肽)的B細胞在可變重鏈和輕鏈結構域內進行超體細胞突變(hypersomatic)過程,從而增加針對抗原的抗體親和性(Leder, 1982 ;Tomlinson等，1996)。在可變區內也經常可觀察到超體細胞插入或缺失，然而其比超體細胞突變頻率低得多(de Wildt等，1999)。因而，抗特定抗原而加以選擇的成熟的抗體將具有高度獨特的可變區序列，不必對其穩定性進行優化。當在多種細胞系統中(如在細菌或哺乳動物表達系統中)表達時,穩定性差可影響抗體或抗體結構域適當折疊的能力。錯誤折疊或穩定性不良也可導致部分非功能性材料群體(Martsev等，1998)和/或有形成大的可溶聚集體傾向的抗體,所述聚集體在用于治療時有潛在危險或有免疫原性。其他穩定性問題包括重折疊受阻、降解、親合性削弱、聚集，或儲存后喪失活性。穩定性問題不限于天然產生的抗體，也可發生在基因工程化的抗原結合分子中，例如用于生產和臨床目的的重組抗體文庫(Hoogenboom，2005)、抗體片段(Holt等，2003 ；Todorovska 等，2001 ;Worn 和 Pliickthun, 2001 ;Reiter 和 Pastan, 1996)和基因工程化的或人源化的治療性抗體(Ewert等,2004 ；Carter和Merchant, 1997)。另外，多價形式的抗體(如雙特異性分子)可有穩定性的問題。盡管雙特異性抗體因其能用于人的治療所以是所希望的，但是其生產是不可預測的。例如，雙特異性抗體可導致熱穩定性、產品產量的實質性減少，或導致形成低分子量聚集體。在人源化嚙齒動物抗體時，也可出現Vh和'結構域的非天然改變。通常將嚙齒動物互補決定區(CDR)移植到最相似的人胚系可變區上來進行人源化(Hurle和Gross，1994)。被選擇來進行人源化的胚系不可能以高頻率地被免疫系統所使用，而且為獲得足夠的抗原結合性經常需要改變人框架。蛋白質不穩定會產生許多問題，包括以下的一個或多個:不適合在生物反應器中規模化生產(例如因為產量低，不需要的副產品(如未組裝的產物和/或聚集材料)的水平顯著高)，蛋白質難以純化，和不適于藥物制備和使用(如，由于分解產物的水平顯著高、產品質量差、和/或藥物動力學性質不良)。抗體、Fab、Fv、或單鏈Fv(ScFv)的可變區內的不穩定性可導致這些問題中的許多問題。scFv構建體尤其已顯示出穩定性、溶解性、表達、聚集、分解產物、和在細菌和哺乳動物表達系統中整體可制造性的問題(參見Worn和Pluckthun, 2001)。另外，將scFv分子整合入原本穩定的重組抗體產物中，經常給新的重組設計帶來這些通常不需要的特性。因此，需要預測蛋白質(如抗體)穩定性的改進方法和對于適于規模化生產的改進的穩定化抗原結合分子。也需要一些改進的方法，以規模化生產適于藥物應用的穩定化的抗原結合分子群。發明簡述本發明至少部分基于開發改進的多肽組合物(如改進的結合分子)和制備它們的方法，所述多肽組合物包括穩定性改善的scFv分子,或由穩定性改善的scFv分子組成。

在一個方面，本發明涉及穩定化的scFv分子群，其中穩定化的scFv分子包含:i)插入Vh結構域和\結構域之間的scFv接頭，其中Vh和\結構域由Vh結構域中的氨基酸和\結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中scFv分子的Vh和\結構域具有大于55° C的Tm值；或ii)插入Vh結構域和\結構域之間的scFv接頭，其中乂11和\結構域由Vh中的氨基酸和\結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中scFv分子具有大于49° C的
丁50°在另一個方面，本發明涉及穩定化的scFv分子，其中穩定化的scFv分子包含:i) scFv接頭，其具有插入Vh結構域和\結構域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中Vh和\結構域由Vh氨基酸44位和\氨基酸100位之間的二硫鍵連接；ii) Vh結構域和'結構域，其中該分子具有至少一個替換，所述替換選自由如下組成的組:a)在VH的Kabat 13位上進行氨基酸替換；b)在VH的Kabat 16位上進行氨基酸替換；c)在VL的Kabat 46位上進行氨基酸替換；d)在VL的Kabat 49位上進行氨基酸替換；e)在VL的Kabat 50位上進行氨基酸替換；
f)在VL的Kabat 49和50位上進行氨基酸替換；g)在VH的Kabat 101位上進行氨基酸替換；h)在VH的Kabat 20位上進行氨基酸替換；i)在VH的Kabat 48位上進行氨基酸替換；j)在VL的Kabat 3位上進行氨基酸替換；k)在VH的Kabat 55位上進行氨基酸替換；I)在VH的Kabat 67位上進行氨基酸替換；m)在VH的Kabat 6位上進行氨基酸替換；η)在VH的Kabat 32位上進行氨基酸替換；ο)在VH的Kabat 49位上進行氨基酸替換；P)在VH的Kabat 43位上進行氨基酸替換；q)在VH的Kabat 72位上進行氨基酸替換；r)在VH的Kabat 79位上進行氨基酸替換；s)在VL的Kabat 50位上進行氨基酸替換；t)在VL的Kabat 75位上進行氨基酸替換；
`
u)在VH的Kabat 80位上進行氨基酸替換；V)在VH的Kabat 83位上進行氨基酸替換；或iii)在scFv的VH和VL之間帶有穩定界面的Vh結構域和Vlj結構域,其中所述分子在直接位于界面內的氨基酸位置上和/或在支撐VH和VL間相互作用的氨基酸位置上具有至少一個替換，其中所述至少一個氨基酸位置選自由如下所組成的組:按照Kabat編號的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L,79L,85L,98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和104L，而且其中該穩定化的scFv分子的T5tl大于沒有經過替換的scFv分子的
丁50°在另一個方面，本發明涉及穩定化的scFv分子，其包含插入Vh結構域和\結構域之間的(Gly4Ser)4ScFv接頭，其中V1^P \結構域由Vh中的氨基酸和\中的氨基酸間的二硫鍵連接。在另一個具體實施方式
中，本發明涉及包含￥11結構域和'結構域的穩定化的scFv分子，其中該分子具有至少一組選自由如下所組成的組的替換:a)在VH的Kabat 16位上進行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；和在VL的Kabat 46位上進行氨基酸替換，例如用賴氨酸；b)在VH的Kabat 16位上進行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上進行氨基酸替換，例如用賴氨酸；和在VH的Kabat 55位上進行氨基酸替換，例如用甘氨酸；和c)在VH的Kabat 16位上進行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上進行氨基酸替換，例如用賴氨酸；在VH的Kabat 55位上進行氨基酸替換，例如用甘氨酸；和在VH的Kabat 101位上進行氨基酸替換，例如用天冬氨酸。在另一個具體實施方式
中，穩定化的scFv分子具有在熱攻擊條件下與常規Fab片段相等的穩定性。在一個具體實施方式
中，穩定性通過測量結合靶分子的能力而測量。在一個具體實施方式
中，scFv分子包含氨基酸序列，其由選自由SEQ IDNO:9、14、16、和18組成的組的核苷酸序列編碼。在一個具體實施方式
中，scFv分子包含選自由SEQ ID NO: 10、15、17、和19組成的
組的氨基酸序列。在另一個具體實施方式
中，本發明涉及包含穩定化的scFv分子的融合蛋白。在一個具體實施方式
中，融合蛋白包含至少2個抗原結合位點。在另一個方面，本發明涉及穩定化的多價抗原結合分子群，其中穩定化的結合分子包含至少一個穩定化的scFv分子,所述穩定化的scFv分子包含插入Vh結構域和\結構域之間的scFv接頭，其中Vh和\結構域由二硫鍵連接，所述二硫鍵位于Vh中的氨基酸和'結構域中的氨基酸之間，而且其中穩定化的結合分子群包含單體形式的可溶蛋白，其中不超過10%以聚集形式呈現。在一個具體實施方式
中，穩定化的多價抗原結合分子在CHO或NSO細胞中表達。在另一個方面，本發明涉及穩定化的多價抗原結合分子群，其中每個多價抗原結合分子包含:i)至少一個scFv分子,其包含插入Vh結構域和Vlj結構域之間的scFv接頭,其中Vh和\結構域由Vh中的氨基酸和\結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中至少一個scFv分子的Vh和\結構域 具有大于55° C的Tm值；或ii)至少一個scFv分子,其包含插入Vh結構域和Vlj結構域之間的scFv接頭,其中V1^P \結構域由Vh中的氨基酸和\結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中多價抗原結合分子的至少一個scFv分子具有大于49° C的T5(l。在另一個具體實施方式
中，本發明涉及穩定化的多價抗原結合分子，其包含:i)至少一個穩定化的scFv分子,其中穩定化的scFv分子包含插入Vh結構域和\結構域之間的(Gly4Ser)n scFv接頭,而且其中Vh和Vlj結構域由二硫鍵連接；ii)至少一個穩定化的scFv分子,其包含具有插入Vh結構域和\結構域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n的scFv接頭，其中Vh和\結構域由Vh第44位氨基酸和\第100位氨基酸之間的二硫鍵連接；iii)至少一個穩定化的scFv分子,其中該穩定化的scFv分子包含至少一個選自由如下所組成的組的替換:a)在VH的Kabat 13位上進行氨基酸替換；b)在VH的Kabat 16位上進行氨基酸替換；c)在VL的Kabat 46位上進行氨基酸替換；d)在VL的Kabat 49位上進行氨基酸替換；e)在VL的Kabat 50位上進行氨基酸替換；f)在VL的Kabat 49和50位上進行氨基酸替換；g)在VH的Kabat 101位上進行氨基酸替換；h)在VH的Kabat 20位上進行氨基酸替換；i)在VH的Kabat 48位上進行氨基酸替換；
j)在VL的Kabat 3位上進行氨基酸替換；k)在VH的Kabat 55位上進行氨基酸替換；I)在VH的Kabat 67位上進行氨基酸替換；m)在VH的Kabat 6位上進行氨基酸替換；η)在VH的Kabat 32位上進行氨基酸替換；ο)在VH的Kabat 49位上進行氨基酸替換；P)在VH的Kabat 43位上進行氨基酸替換；q)在VH的Kabat 72位上進行氨基酸替換；r)在VH的Kabat 79位上進行氨基酸替換；s)在VL的Kabat 50位上進行氨基酸替換；t)在VL的Kabat 75位上進行氨基酸替換；u)在VH的Kabat 80位上進行氨基酸替換；V)在VH的Kabat 83位上進行氨基酸替換；或iv) Vh結構域和\結構域，其帶有位于scFv的VH和VL之間的穩定界面,其中該分子在直接位于界面內的氨基酸位置上和/或在支撐VH和VL間相互作用的氨基酸位置上具有至少一個替換，其中該 至少一個氨基酸位置選自由如下所組成的組:按照Kabat編號的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L,79L,85L,98L,58L,74L,77L,83L，89L，和 104L。在另一個方面，本發明涉及穩定化的多價抗原結合分子，其包含至少一個穩定化的scFv分子，所述穩定化的scFv分子包含插入Vh結構域和Vlj結構域之間的(Gly4Ser)4ScFv接頭,其中Vh和\結構域由二硫鍵連接,所述二硫鍵位于Vh中的氨基酸和'結構域中的氨基酸之間。ii)至少一個穩定化的scFv分子,其包含scFv接頭,所述接頭具有插入Vh結構域和\結構域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中V1^P \結構域由二硫鍵連接，所述二硫鍵位于Vh44位氨基酸和'100位氨基酸之間；或iii)至少一個穩定化的scFv分子,其中該穩定化的scFv分子包含至少一個選自由如下所組成的組的替換:a)替換在VL的Kabat 3位上的氨基酸(如，谷氨酰胺)，例如用丙氨酸、絲氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、或甘氨酸；b)替換在VL的Kabat 46位上的氨基酸(如，絲氨酸)，例如用亮氨酸；c)替換在VL的Kabat 49位上的氨基酸(如，絲氨酸)，例如用酪氨酸或絲氨酸；d)替換在VL的Kabat 50位上的氨基酸(如，絲氨酸或纈氨酸)，例如用絲氨酸、蘇氨酸、和精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、或賴氨酸；e)分別用酪氨酸和絲氨酸；酪氨酸和蘇氨酸；酪氨酸和精氨酸；酪氨酸和甘氨酸；絲氨酸和精氨酸；或絲氨酸和賴氨酸替換在VL的Kabat 49位上的氨基酸(如，絲氨酸)和Kabat 50位上的氨基酸(如，絲氨酸)；f)替換在VL的Kabat 75位上的氨基酸(如，纈氨酸)，例如用異亮氨酸；g)替換在VL的Kabat 80位上的氨基酸(如，脯氨酸)，例如用絲氨酸或甘氨酸；
h)替換在VL的Kabat 83位上的氨基酸(如，苯丙氨酸)，例如用絲氨酸、丙氨酸、甘氨酸、或蘇氨酸；i)替換在VH的Kabat 6位上的氨基酸(如，谷氨酸)，例如用谷氨酰胺；j)替換在VH的Kabat 13位上的氨基酸(如，賴氨酸)，例如用谷氨酸；k)替換在VH的Kabat 16位上的氨基酸(如，絲氨酸)，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；I)替換在VH的Kabat 20位上的氨基酸(如，纈氨酸)，例如用異亮氨酸；m)替換在VH的Kabat 32位上的氨基酸(如，天冬酰胺)，例如用絲氨酸；η)替換在VH的Kabat 43位上的氨基酸(如，谷氨酰胺)，例如用賴氨酸或精氨酸；ο)替換在VH的Kabat 48位上的氨基酸(如，甲硫氨酸)，例如用異亮氨酸或甘氨酸；P)替換在VH的Kabat 49位上的氨基酸(如，絲氨酸)。例如用甘氨酸或丙氨酸；q)替換在VH的Kabat 55位上的氨基酸(如，纈氨酸)，例如用甘氨酸；r)替換在VH的Kabat 67位上的氨基酸(如，纈氨酸)，例如用異亮氨酸或亮氨酸；S)替換在VH的Kabat 72位上的氨基酸(如，谷氨酸)，例如用天冬氨酸或天冬酰胺；t)替換在VH的Kabat 79`位上的氨基酸(如，苯丙氨酸)，例如用絲氨酸、纈氨酸、或酪氨酸；和u)替換在VH的Kabat 101位上的氨基酸(如，脯氨酸)，例如用天冬氨酸。在另一個方面，本發明涉及多價抗原結合分子，其包含至少一個穩定化的scFv分子，其中該穩定化的scFv分子包含至少一組選自由如下所組成的組的替換:a)在VH的Kabat 16位上進行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；和在VL的Kabat 46位上進行氨基酸替換，例如用賴氨酸；b)在VH的Kabat 16位上進行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上進行氨基酸替換，例如用賴氨酸；和在VH的Kabat 55位上進行氨基酸替換，例如用甘氨酸；和c)在VH的Kabat 16位上進行氨基酸替換，例如用谷氨酸或谷氨酰胺；在VL的Kabat 46位上進行氨基酸替換，例如用賴氨酸；在VH的Kabat 55位上進行氨基酸替換，例如用甘氨酸；和在VH的Kabat 101位上進行氨基酸替換，例如用天冬氨酸。在一個具體實施方式
中，至少一個穩定化的scFv分子是通過基因工程與抗體融合的。在另一個具體實施方式
中，兩個穩定化的scFv分子是通過基因工程與抗體融合的。在一個具體實施方式
中，至少一個穩定化的scFv分子是通過基因工程與抗體輕鏈或重鏈的羧基末端融合。在一個具體實施方式
中，至少一個穩定化的scFv分子通過基因工程與抗體輕鏈或重鏈的氨基末端融合。在一個具體實施方式
中，本發明結合分子包含至少一個結合位點，該位點結合優先在癌細胞上表達的分子。
在一個具體實施方式
中，本發明的scFv分子Vh結構域源自BHAlO抗體。在一個具體實施方式
中，本發明的scFv分子'結構域源自BHAlO抗體。在一個具體實施方式
中，本發明的結合分子包含至少一個結合位點，該位點特異于選自由下列所組成的組的分子:HER1，HER3，CD80，CD86，PD_1，CTLA4，B7-H4, RON, CD200，CD4, BAF R, EGFR, IGFR, VEGFR，受體 TNF 家族的成員，Tie 受體，MET, IGFl, IGF2, TNF，TNF配體，IL-6, TWEAK, Fnl4, CD20, CD23, CRIPTO, HGF，α 4β I 整聯蛋白，α 5β I 整聯蛋白，α6β4整聯蛋白，和ανβ6整聯蛋白。在一個具體實施方式
中，本發明的結合分子包含至少一個結合位點，該位點結合參與調節免疫應答的分子。在一個具體實施方式
中，所述分子是Fe受體。在一個具體實施方式
中，本發明的結合分子包含至少一個結合位點，該位點結合參與調節血管生成的分子。在一個具體實施方式
中，本發明的所述結合分子結合VEGF或血管生成素(angiopoitin)。在一個具體實施方式
中，本發明的結合分子包含至少一個結合位點，該位點結合神經學上的靶。在一個具體實施方式
中，本發明的結合分子是多特異性的。在一個具體實施方式
中，本發明的結合分子是雙特異性的。在另一個具體實施方式
中，本發明的結合分子結合TNF受體家族的兩個成員。在一個具體實施方式
中，本 發明的結合分子結合LTiiR和Trail R2。在一個具體實施方式
中，本發明的結合分子包括通過基因工程方法與14A2抗體融合的BHAlOscFv分子。在一個具體實施方式
中，本發明的結合分子包含具有下述序列的重鏈，所述序列選自由 SEQ ID NO:33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ IDNO:51, SEQ ID NO:53，和 SEQ IDNO:55 所組成的組。在一個具體實施方式
中，本發明的結合分子包含編碼下文項4_8、11、12、和18_22之任一的分子的多肽的核苷酸序列。在一個具體實施方式
中，本發明涉及含核苷酸序列的核酸分子，該核苷酸序列編碼穩定化的scFv分子或編碼含本發明的穩定化的scFv分子的結合分子。在一個具體實施方式
中，核酸分子在載體中。在另一個具體實施方式
中，本發明涉及包含這種載體的宿主細胞。在一個具體實施方式
中，宿主細胞是哺乳動物宿主細胞，如CHO細胞或NSO細胞。在一個具體實施方式
中，本發明涉及結合分子的群體，所述結合群體含scFv分子，該群體的聚集度與表達含常規scFv分子的結合分子群體的宿主細胞相比至少低10%。在一個方面,本發明涉及產生穩定化的結合分子的方法,包括在能產生穩定化的結合分子的條件下培養宿主細胞。在一個具體實施方式
中，每升宿主細胞培養基產生至少IOmg穩定化的結合分子，而且其中以聚集形式呈現的結合分子不超過10%。在一個方面，本發明涉及治療會受益于用本發明的結合分子治療的受試者的方法，包括向受試者施用結合分子，以使所述治療發生。在一個具體實施方式
中，受試者患有選自由下列所組成的組的疾病或病癥:癌癥、自身免疫性疾病或病癥、和神經學上的疾病或病癥。
在一個方面,本發明涉及穩定化scFv分子的方法,其包括用(Gly4Ser)nScFv接頭通過基因工程方法融合Vh結構域和\結構域，并基因工程化Vh結構域以在44位氨基酸上包含半胱氨酸，和基因工程化' 結構域以在100位氨基酸上包含半胱氨酸，從而形成穩定化的scFv分子。在一個方面，本發明涉及制備包含穩定化的scFv分子的穩定化的多價抗體的方法，該方法包括通過基因工程方法將穩定化的scFv分子與抗體分子輕鏈或重鏈的氨基末端或羧基末端融合。在一個具體實施方式
中，本發明涉及制備穩定化的scFv分子的方法，包括替換在scFv分子的VH/VL界面中的至少一個氨基酸和/或支撐scFv分子的VH/VL界面的至少一個氨基酸。與常規scFv分子相比，所述一個或多個替換同時改善scFv分子VH和VL結構域的熱穩定性。在又一具體實施方式
中，本發明涉及制備穩定化的scFv分子的方法，包括替換在VH結構域或VL結構域中至少一個與VH和VL結構域之間界面上的兩個或多個氨基酸共變(covary)的氨基酸。在又一具體實施方式
中，本發明涉及制備含scFv分子的穩定化的融合蛋白分子的方法，包括替換在scFv分子的VH/VL界面中的至少一個氨基酸和/或替換在scFv分子的VH/VL支架(scaffold)中的至少一個氨基酸，并通過基因工程方法將scFv分子與多肽融合，由此制備穩定化的融合蛋白。

在又一具體實施方式
中，本發明涉及改善含至少一個scFv分子的多價分子的穩定性的方法，該方法包括將至少一個穩定化突變導入所述至少一個scFv分子中，由此改善多價分子的穩定性。在又一具體實施方式
中，本發明涉及改善scFv分子的穩定性的方法，該方法包括將至少一個穩定化突變導入scFv分子中，由此改善scFv分子的穩定性。在又一方面，本發明涉及大規模制備穩定化的融合蛋白的方法，該方法包括:(a)進行scFv分子的熱穩定性測試以確定候選scFv分子的熱穩定性；(b)將候選scFv分子的熱穩定性與合適對照比較，以鑒定與對照相比熱穩定性增加的穩定化scFv分子，(c)選擇步驟(b)中鑒定出的穩定化的scFv分子；(d)通過基因工程方法將至少一個穩定化的scFv分子與蛋白質融合，以形成穩定化的融合蛋白；(e)用帶有編碼穩定化的融合蛋白的核酸分子轉染哺乳動物宿主細胞，(g)在能使穩定化的融合蛋白表達的條件下培養步驟(f)的宿主細胞；其中當在IOL或更大的培養基中生長時，穩定化的融合蛋白被表達后蛋白質聚集不超過10%。在又一方面，本發明涉及從含候選氨基酸序列的免疫球蛋白(Ig)超家族多肽中確定蛋白質折疊的熱穩定性的方法，該方法包括以下步驟:a)提供序列的輔助參考集(curated reference set)的比對,所述序列與多肽的Ig折疊對應；b)計算比對的序列氨基酸殘基之間的共變(covariation),以產生出共變數據；
c)從共變數據內的共變中確定候選序列內氨基酸位置的序列位置特異性共變評分；和d)儲存或輸出氨基酸位置特異性序列共變評分以作為多肽穩定性量度。在一個具體實施方式
中，對于數種免疫球蛋白(Ig)超家族多肽，該方法包括至少重復步驟c)和d)。在又一具體實施方式
中，基于候選序列的序列位置特異性共變評分，該方法進一步包括從數種免疫球蛋白(Ig)超家族多肽中選出用于生產的Ig超家族多肽的步驟。 在另一個具體實施方式
中，該方法進一步包括生產所選擇的Ig超家族多肽和為治療用途而制備它的步驟。在另一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽源自選自由下列所組成的組的蛋白質:免疫球蛋白或其抗原結合片段、免疫球蛋白受體、細胞粘附蛋白、整聯蛋白、過敏原、T-細胞受體、和主要組織相容性復合物(MHC)。在一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽選自由重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(')、和單鏈抗體(scFv)所組成的組。在另一個具體實施方式
中，Ig折疊選自由V類折疊、I類折疊、Cl類折疊、和C2類折疊所組成的組。在一個具體實施方式
中，輔助參考集或比對具有至少50%的多樣性。在一個具體實施方式
中，比對中的每個序列與比對中的其它每個序列具有小于90%的同一性。在另一個具體實施方式
中，至少一個序列來自哺乳動物物種，而且至少一個序列來自非哺乳動物物種。在一個具體實施方式
中，對于在比對的相應位置上找到的令人滿意的正共變，候選序列被賦予殘基位置特異性共變正評分。在一個具體實施方式
中，對于在比對的相應位置上找到的令人滿意的負共變，候選序列被賦予殘基位置特異性共變負評分。在一個具體實施方式
中，正共變的Φ關聯系數(phi association coefficient)(Φ)約 +0.25 至約 +1.0。在一個具體實施方式
中，負共變的Φ關聯系數(Φ)約-0.25至約-1.0。在一個具體實施方式
中，比對選自由下列所組成的組:基于結構的序列比對、基于序列的序列比對、和基于結構的結構比對。在一個具體實施方式
中，確定比對中每個殘基位置上的所有可能殘基對的位置特異性共變評分。在一個具體實施方式
中，比對通過如下來獲得:(i)由初始比對產生隱馬爾可夫模型(Hidden Markov Model, HMM) ；(ii)用HMM獲得其他序列；和(iii)將其他序列與初始比對進行比對。在一個方面，本發明涉及計算機程序或計算機程序產品或計算機可讀介質，其具有處理器可執行指令集，當執行時，所述指令集使處理器進行本發明的方法。 在又一具體實施方式
中，本發明涉及適用于電子設備中的計算機程序或計算機程序產品或計算機可讀介質，其包括對應于本發明方法的比對的數據。
在又一具體實施方式
中，本發明涉及適用于電子設備中的計算機程序或計算機程序產品或計算機可讀介質，其包括本發明方法的共變數據。在一個具體實施方式
中，本發明涉及被安排來執行本發明方法的設備。在一個方面，本發明涉及計算設備中的系統，包括:(i)初始序列收集過程；(ii)能從下文項58-74之任一的比對中保存序列數據的儲存位置(storagelocation)；(iii)分析工具(analysis facility),其程序性地分析比對內殘基對之間的共變以獲得共變數據；

(iv)與所述電子設備有交互界面的輸出設備，所述輸出設備輸出所述共變數據。在一個具體實施方式
中，本發明涉及計算設備中的介質，其保存進行包括本發明方法任何步驟的方法的可執行步驟。在又一具體實施方式
中，對殘基使用頻率數據的顯示包括矩陣，其包括(i)對應于多肽序列的連續殘基位置；和(ii)針對每個殘基位置上的殘基類型的殘基使用頻率。在又一具體實施方式
中，符號化描述殘基使用頻率。在一個具體實施方式
中，要表示所有20種天然氨基酸、缺口、和不明確的殘基。在一個具體實施方式
中，殘基使用頻率與符號大小相關。在一個具體實施方式
中，殘基使用頻率與符號大小正相關。在一個具體實施方式
中，(i)殘基位置以列顯示；和(ii)殘基使用頻率以行顯示。在另一個具體實施方式
中，共變殘基中的共變由網絡覆蓋圖來描述。在一個方面,本發明涉及圖形用戶界面(graphical user interface),包括用圖形顯示:(i)柵格布局(grid layout)，其包括多肽序列參考集的殘基使用頻率數據集；和(ii)共變覆蓋圖(covariation overlay) 在一個具體實施方式
中，界面進一步包括:(iii)對感興趣的序列的顯示。在一個方面，本發明涉及產生具有改善的生物物理性質的免疫球蛋白(Ig)超家族多肽的方法，所述方法包括以下步驟:a)提供對應于多肽的Ig折疊的序列輔助參考集的比對；b)計算比對的序列殘基之間的共變以鑒定出共變的殘基；c)替換未能滿足與在比對的相應位置上找到的共變殘基的共變的多肽殘基。在另一個具體實施方式
中，生物物理性質選自由下列所組成的組:熱穩定性、pH解折疊譜、糖基化的穩定去除、溶解性、生化功能、和其組合。在一個具體實施方式
中，生化功能選自由蛋白質靶或化學部分的識別所組成的組，該化學部分選自由磷酸、甲基、乙酰基、脂、去污劑、金屬離子、鹵素、RNA、DNA、寡核苷酸、和寡核苷所組成的組。在一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽源自蛋白質，所述蛋白質選自由抗體或其抗原結合片段、免疫球蛋白受體、細胞粘附蛋白、整聯蛋白、過敏原、T-細胞受體、和主要組織相容性復合物(MHC)分子所組成的組。在一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽選自由重鏈可變區(VH)、輕鏈可變區(')、和單鏈抗體(sFv)所組成的組。在一個具體實施方式
中，Ig折疊選自由V類折疊、I類折疊、Cl類折疊、和C2類折疊所組成的組。在另一個具體實施方式
中，Ig超家族多肽是修飾的抗體，所述修飾的抗體選自由結構域抗體、人源化抗體、人抗體、非人單克隆抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、含scFv的抗體、和結構域缺失的抗體所組成的組。在一個具體實施方式
中，共變的殘基是選自由二硫鍵、鹽橋、配體結合口袋或表面的一部分、和范德華網絡、氫鍵、和/或電荷-電荷相互作用所組成的組的結構特征的一部分。在另一個具體實施方式
中，本發明涉及產生具有改善的穩定性的抗體或修飾的抗體的方法，所述方法包括以下步驟:a)提供經實驗確認為穩定的模板抗體的高解析度結構模型；b)用結構模型鑒定模板抗體中的VH/VL界面和/或支撐界面的殘基；c)用同源模型鑒定抗體或修飾的抗體中對穩定界面至關重要的相應VH/VL界面殘基；和d)用來自模板蛋白質的界面殘基替換抗體或修飾的抗體中的相應VH/VL界面殘基。在一個具體實施方式
中，模板蛋白質的界面殘基掩蓋(bury)該界面中至少10A2:的表面區域。在一個具體實施方式
中，修飾的抗體選自由單結構域抗體、人源化抗體、人抗體、非人單克隆抗體、嵌合抗體、雙特異性抗體、含scFv的抗體、和結構域缺失的抗體所組成的組。在另一個具體實施方式
中，本發明涉及本發明的方法產生的多肽。在一個具體實施方式
中，多肽顯示出生物物理性質有改善，所述生物物理性質選自由熱穩定性、PH解折疊譜、糖基化的穩定去除、溶解性、生化功能、和其組合所組成的組。在一個具體實施方式
中，生化功能是配體結合親和性或特異性。在另一個方面，本發明涉及產生含穩定化的scFv分子的文庫的方法，該方法包括:(a)提供對應于scFv分子可變區序列的序列參考集；(b)鑒定可變區內在參考集中相應位置上缺失或以低頻率存在的氨基酸；和(c)將該信息與共變數據相組合，所述共變數據提示修飾參考集中以低頻率鑒定出的氨基酸可滿足可變區內現有的共變限制；和(d)用候選穩定化氨基酸替換步驟(b)的氨基酸，由此產生含穩定化的scFv分子的文庫。在一個具體實施方式
中，步驟(b)的氨基酸具有小于0.5的共有(concensus)評分。在另一個具體實施方式
中，步驟(b)的氨基酸在參考集的序列中少于10%。在另一個具體實施方式
中，步驟(b)的氨基酸是非共有殘基。在一個具體實施方式
中，候選的穩定化氨基酸在參考集內相應位置上被發現。在又一具體實施方式
中，候選的穩定化氨基酸是共有氨基酸。
在一個具體實施方式
中，通過分析可變區序列的3-D結構來鑒定候選的穩定化氨基酸。在另一個具體實施方式
中，通過側鏈重包裝計算(side-chain repackingcalculation)來鑒定穩定化氨基酸。
在又一方面，本發明涉及產生穩定化的scFv分子的方法，該方法包括:(a)提供根據下文項56的方法設計的scFv文庫，(b)用熱攻擊試驗篩選scFv文庫以鑒定候選scFv分子，(c)將scFv文庫的候選scFv分子的熱穩定性與合適對照比較，由此，候選scFv分子的熱穩定性相對于對照增加，則鑒定出作為穩定化的scFv分子的候選scFv分子。在另一個具體實施方式
中，本發明涉及用本發明的方法鑒定出的穩定化的scFv分子或含本發明穩定化的scFv分子的融合蛋白。在另一個方面，本發明涉及預測候選蛋白質的穩定性的方法，所述候選蛋白質含具有候選結構域序列的氨基酸序列，該方法包括:(a)提供氣基酸序列參考集，其對應于候選蛋白質的候選結構域序列；(b)確定在測試結構域序列內的各氨基酸位置上的殘基頻率以獲得共有評分；和(C)用共有評分預測候選蛋白質的穩定性，其中共有評分與候選蛋白質的穩定性相關。在另一個方面，本發明涉及預測候選蛋白質的穩定性的方法，該方法包括:(a)提供序列參考集，其對應于候選蛋白質的測試結構域序列；(b)確定在測試結構域序列內的各氨基酸位置上的殘基頻率以獲得共有評分；和(C)用共有評分預測候選蛋白質的穩定性，其中共有評分與候選蛋白質的穩定性相關。在另一個具體實施方式
中，本發明涉及預測候選蛋白質的穩定性的方法，該方法包括:(a)提供序列參考集，其對應于候選蛋白質的測試結構域序列；(b)確定在測試結構域序列內的氨基酸位置上的殘基頻率以獲得共有評分；(C)確定在參考集序列內的相應氣基酸位置上的殘基頻率以確定平均共有評分；(d)比較共有評分與平均共有評分以確定序列評分；和(e)用序列評分預測候選蛋白質的穩定性，其中共有評分與候選蛋白質的穩定性直接相關。在又一具體實施方式
中，本發明涉及預測候選抗體或候選修飾的抗體的穩定性的方法，該方法包括:(a)提供VH結構域的序列參考集，其對應于候選抗體或修飾的抗體的測試VH結構域序列；(b)確定在測試VH結構域序列內的氨基酸位置上的殘基頻率以獲得共有評分；(c)確定在參考集序列內的相應氨基酸位置上的殘基頻率以確定平均共有評分；(d)比較共有評分與平均共有評分以確定序列評分；和(e)用序列評分預測候選抗體或修飾的抗體的穩定性，其中共有評分與候選抗體或修飾的抗體的穩定性直接相關。
在一個具體實施方式
中，參考集包含蛋白質序列，所述蛋白質序列來自帶有與候選蛋白質類別相同的蛋白質折疊的蛋白質。在另一個具體實施方式
中，參考集包含直系同源序列(orthologous sequence)。在一個具體實施方式
中，參考集包含人序列，如人VH序列，諸如同一 Kabat類別的人VH序列。在一個具體實施方式
中，參考集包含人VH胚系序列。在一個具體實施方式
中，測試結構域序列是候選蛋白質的結構域序列的一部分。在一個具體實施方式
中，確定測試序列每個位置的共有評分，以獲得總共有評分，其中總共有評分與蛋白質穩定性相關。在另一個具體實施方式
中，用以下公式計算總共有評分:
權利要求
1.穩定化ScFv分子群,其中所述穩定化scFv分子包含 i)插入Vh結構域和\結構域之間的scFv接頭，其中Vh和\結構域由Vh結構域中的氨基酸和\結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中scFv分子的Vh和\結構域具有大于55° C的Tm值；或 )插入Vh結構域和\結構域之間的scFv接頭，其中V1^P \結構域由Vh中的氨基酸和\結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中scFv分子具有大于49° C的T5Q。
2.穩定化scFv分子,其包含 i)具有插入Vh結構域和\結構域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n的scFv接頭，其中Vh和\結構域由Vh位置44的氨基酸和\位置100的氨基酸之間的二硫鍵連接； ii)VH結構域和\結構域，其中該分子具有至少一個選自由如下所組成的組的替換: a)在VH的Kabat位置13上替換氨基酸； b)在VH的Kabat位置16上替換氨基酸； c)在VL的Kabat位46上替換氨基酸； d)在VL的Kabat位置49上替換氨基酸； e)在VL的Kabat位置50上替換氨基酸； f)在VL的Kabat位置49和50上替換氨基酸； g)在VH的Kabat位置101上替換氨基酸； h)在VH的Kabat位置20上替換氨基酸； i)在VH的Kabat位置48上替換氨基酸； j)在VL的Kabat位置3上替換氨基酸； k)在Kabat位置55上替換氨基酸； I)在VH的Kabat位置67上替換氨基酸； m)在VH的Kabat位置6上替換氨基酸； η)在VH的Kabat位置32上替換氨基酸； O)在VH的Kabat位置49上替換氨基酸； P)在VH的Kabat位置43上替換氨基酸； q)在VH的Kabat位置72上替換氨基酸； r)在VH的Kabat位置79上替換氨基酸； s)在VL的Kabat位置50上替換氨基酸； t)在VL的Kabat位置75上替換氨基酸； u)在VH的Kabat位置80上替換氨基酸； V)在VH的Kabat位置83上替換氨基酸；或 iii)帶有位于scFv的VH和VL之間的穩定化界面的Vh結構域和\結構域，其中該分子在直接位于所述界面內的氨基酸位置上和/或在支撐VH和VL間相互作用的氨基酸位置上具有至少一個替換，其中該至少一個氨基酸位置選自由如下所組成的組:按照Kabat編號的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和 104L,而且其中該穩定化scFv分子具有比缺少所述替換的scFv分子大的T5(l。
3.穩定化多價抗原結合分子群，其中所述穩定化結合分子包含至少一個穩定化scFv分子，其包含插入Vh結構域和\結構域之間的scFv接頭，其中Vh和\結構域由Vh中的氨基酸和\結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中所述穩定化結合分子群包含單體的可溶蛋白，這種蛋白中不超過10%以聚集形式呈現。
4.穩定化多價抗原結合分子群，其中每個多價抗原結合分子包含 i)至少一個scFv分子,其包含插入Vh結構域和\結構域之間的scFv接頭,其中Vh和Vl結構域由Vh中的氨基酸和\結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中至少一個scFv分子的Vh和\結構域具有大于55° C的Tm值；或 ii)至少一個scFv分子,其包含插入Vh結構域和\結構域之間的scFv接頭,其中Vh和\結構域由Vh中的氨基酸和\結構域中的氨基酸之間的二硫鍵連接，而且其中多價抗原結合分子的至少一個scFv分子具有大于49° C的T5(l。
5.穩定化多價抗原結合分子，其包含 i)至少一個穩定化scFv分子,其包含插入Vh結構域和Vlj結構域之間的(Gly4Ser)nscFv接頭，而且其中V1^P \結構域由二硫鍵連接； ii)至少一個穩定化scFv分子,其包含scFv接頭,所述接頭具有插入Vh結構域和Vlj結構域之間的氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中V1^P \結構域由由Vh位置44的氨基酸和 '位置100的氨基酸之間的二硫鍵連接； iii)至少一個穩定化scFv分子,其中該穩定化scFv分子包含至少一個選自由如下所組成的組的替換: a)在VH的Kabat位置13上替換氨基酸； b)在VH的Kabat位置16置上替換氨基酸； c)在VL的Kabat位置46上替換氨基酸； d)在VL的Kabat位置49上替換氨基酸； e)在VL的Kabat位置50上替換氨基酸； f)在VL的Kabat位置49和50上替換氨基酸； g)在VH的Kabat位置101上替換氨基酸； h)在VH的Kabat位置20上替換氨基酸； i)在VH的Kabat位置48上替換氨基酸； j)在VL的Kabat位置3上替換氨基酸； k)在VH的Kabat位置55上替換氨基酸； I)在VH的Kabat位置67上替換氨基酸； m)在VH的Kabat位置6上替換氨基酸； η)在VH的Kabat位置3 2上替換氨基酸； O)在VH的Kabat位置49上替換氨基酸； P)在VH的Kabat位置43上替換氨基酸； q)在VH的Kabat位置72上替換氨基酸； r)在VH的Kabat位置79上替換氨基酸； s)在VL的Kabat位置50上替換氨基酸；t)在VL的Kabat位置75上替換氨基酸； u)在VH的Kabat位置80上替換氨基酸； V)在VH的Kabat位置83上替換氨基酸；或 iv)帶有位于scFv的VH和VL之間的穩定化界面的\^結構域和Vlj結構域,其中該分子在直接位于所述界面內的氨基酸位置上和/或在支撐VH和VL間相互作用的氨基酸位置上具有至少一個替換，其中該至少一個氨基酸位置選自由如下所組成的組:按照Kabat編號的 47H,37H,45H,46H,51H,59H,109H,14H,26H,27H,40H,69H,103H,29H,38H,44H,49H,55H,63H,54H,68H,72H,74H,79H,82bH,8H,32H,39H，41H，62H,85H，91H，24H,60H,37L,36L,44L,59L,57L,64L,46L,48L,63L,67L,68L,39L,45L,47L,54L,56L, 79L, 85L, 98L, 58L, 74L, 77L,83L，89L，和 104L。
6.穩定scFv分子的方法，其包括用(Gly4Ser)nscFv接頭通過基因工程將Vh結構域和Vl結構域融合，并改造Vh結構域使之在位置44的氨基酸上包含半胱氨酸和改造\結構域使之在氨基酸100位上包含半胱氨酸，從而形成穩定化scFv分子。
7.制備包含穩定化scFv分子的穩定化多價抗體的方法，該方法包括通過基因工程將穩定化scFv分子與抗體分子輕或重鏈的氨基末端或羧基末端融合。
8.制備穩定化scFv分子的方法，包括替換scFv分子的VH/VL界面中的至少一個氨基酸和/或替換支撐scFv分子的VH/VL界面的至少一個氨基酸，其中所述替換使scFv分子的VH結構域和VL結構域兩者的熱穩定性都比常規scFv分子的提高。
9.制備穩定化scFv分子的方法，包括替換VH結構域或VL結構域中的至少一個氨基酸，該氨基酸與位于所述VH和VL結構域之間界面上的兩個或多個氨基酸一起變化。
10.制備含ScFv分子的穩定化融合蛋白的方法，包括替換scFv分子的VH/VL界面中的至少一個氨基酸和/或scFv分 子的VH/VL支架中的至少一個氨基酸，并通過基因工程將所述scFv分子與多肽融合，由此制備穩定化融合蛋白。
全文摘要
本發明涉及穩定的多肽組合物。本發明至少部分基于開發由穩定化scFv組成或包含它的穩定化結合分子和制備這些穩定的分子的方法。
文檔編號C12N15/13GK103073639SQ20121056303
公開日2013年5月1日 申請日期2007年3月19日 優先權日2006年3月17日
發明者斯蒂芬.德馬雷斯特, 斯科特.格拉澤, 布賴恩.R.米勒, 吳秀鳳, 威廉.B.斯奈德, 諾曼.王, 莉薩.J.克羅納, 亞歷克西.A.盧戈夫斯科伊 申請人:比奧根艾迪克Ma公司