專利名稱：多酚污染物生物降解過程中的相互作用及研究方法
技術領域：
本發明涉及一種多酚污染物生物降解過程中的相互作用及研究方法。
背景技術：
酚類化合物是指一系列芳香族碳氫化合物羥基衍生物的統稱，會嚴重刺激呼吸系統和眼睛，腐蝕皮膚引起灼傷和皮炎，甚至造成慢性中毒引起消化系統障礙，神經系統紊舌L內臟受損等，在細胞內部會與蛋白質結合使其凝固，從而殺死細胞，具有極大原生質性的毒性危害。在水中存在的酚類化合物耗氧量較高，嚴重打破了水體生態中的氧平衡，而且在較低濃度下(l-10mg/L)會造成水體生物的大量死亡，抑制各種微生物生長，破壞水體生態平衡。含有酚類污染物的廢水主要來自石油化工廠、塑料廠、合成纖維廠、煉油廠、樹脂廠和焦化廠等化工企業，是水體的重要污染物之一。酚類污染物對所有生物活性體均能產生毒性，可通過與皮膚、粘膜的接觸不經肝臟解毒直接進入血液循環，致使細胞破壞并失去活力，也可通過口腔侵入人體，造成細胞損傷。高濃度的酚液能使蛋白質凝固，并能繼續向體內滲透，引起深部組織損傷，壞死乃至全身中毒，即使是低濃度的酚液也可使蛋白質變性。人如果長期飲用被酚污染的水能引起慢性中毒，出現貧血、頭昏、記憶力衰退以及各種神經系統的疾病，嚴重的會引起死亡。工業含酚廢水中同時含有苯酚、甲酚、氯酚、硝基酚等多種典型難降解酚類化合物，實現其無害化處理始終是一個世界性難題。酚類化合物被美國國家環境保護總局(EPA)列為129種優先控制污染物之一，并且規定廢水中的酚濃度不得超過lmg/L。同時我國也將其列入“水中優先控制污染物黑名單”，對含酚廢水的排放有著嚴格的標準。酚類污染物的處理手段有物理法，化學法與生物法。其中的生物法降解有機工業廢水是目前應用最為普遍的含酚廢水處理技術，但在生物處理過程中，有機污染物對微生物的毒害作用導致其降解效率低下，獲得特異性的微生物菌種成為實現污染物高效降解的核心問題。但在從實 驗室小試到實際廢水處理應用過程中，往往由于污染物的復雜性和難降解性導致過程崩潰。研究發現，自然界中存在一些特殊微生物菌群，由于其系統組成和功能的多樣性，能夠表現出單菌株不具備的有機污染物降解代謝能力。在實驗室條件下，多種純培養微生物的混合培養也表現出對某一種或幾種酚類污染物的降解作用的提高，甚至能夠獲得原先沒有的降解能力。菌群組成和功能多樣性帶來的高污染物壓力下的高效性和穩定性，為酚類污染物高效生物降解提供了繼活性污泥和純培養菌種之后的新思路。目前，含酚廢水的治理方法隨著對酚類危害認識和水處理技術不斷發展而逐步發展起來的，主要分為三大類物理處理法，化學處理法和生物處理法。而且隨著技術不斷的發展各種方法不斷結合和相互滲透，以達到更好的治理效果。生物法降解有機工業廢水是目前應用最為普遍的含酚廢水處理技術，至今已有一百多年的歷史。它的工作原理是利用微生物的新陳代謝作用將廢水中有機污染物轉化為C02、N2和H2O等無毒害小分子物質排放。生物法處理效率高、應用廣、處理能力強、設備較簡單、產生二次污染極少、出水水質好、運行與操作方便及運行費用較低等優點，在當前工業廢水處理技術中占主導地位。但生物處理過程受廢水pH值、溫度及含酚量和種類等因素的影響較大，所以對操作條件要求比較嚴格。盡管大量的苯酚降解野生菌已經被篩選出來，但是生產中含酚廢水往往同時含有多種難降解化合物，限制純菌株的應用發展。近些年研究發現，多種微生物的共同培養有利于它們代謝功能的有機結合。在實際廢水中往往存在多種污染物，在其降解過程中存在著各種各樣的相互作用，主要表現為相互抑制和促進的共代謝模式。因此單底物模型不能夠描述這類混合物的降解。由于酚類污染物的復雜性和多樣性，所以研究酚類污染物中各種組分對微生物降解的作用具有重要的實際意義。
發明內容
本發明提供了一種多酚污染物生物降解過程中的相互作用。本發明的另一個目的是提供對這種相互作用的一種研究方法。本發明所應用到的酚類污染物降解菌是銅綠假單胞菌 GMT1. 074。具體技術方案如下一種多酚污染物生物降解過程中的相互作用的研究方法，其步驟如下I)配置用于降解多酚污染物的培養基；酚類降解實驗所用的選擇性培養基是在無機鹽培養基基礎上添加苯酚或間甲酚作為碳源；在研究不同間甲酚濃度對苯酚降解影響時，固定苯酚的濃度，選擇間甲酚的濃度不同濃度的幾個梯度水平；在研究不同苯酚濃度對間甲酚的降解影響時，固定間甲酚的濃度，選擇苯酚的不同濃度的幾個梯度水平；每個梯度進行平行實驗；2)利用銅綠假單胞菌GMT1. 074接種到培養基中進行培養；3)采用光密度法和恒重干`燥法進行測量菌體濃度；采用高效液相色譜法測定降解體系中的酚類物質濃度；4)根據培養過程中細胞濃度的變化和苯酚與間甲酚降解情況的變化，得到多酚污染物生物降解過程中的相互作用數據。所述的培養基是500mg(NH4)2S04，200mgKH2PO4, IOOmg MgSO4,800mgNa2HP04 · 12H20，20mg 酵母浸粉，IOmL 痕量元素母液和 IOOOmL H20。所述的痕量元素母液成分如下0· 4g MnSO4 · 4Η20，0· 4g ZnSO4 · 7H20，
0.1gNa2MoO4 · 2Η20，0· Ig CuSO4 · 5H20,1. Og CaCl2,10. Og Na2SO4, 2. Og FeSO4 · 7Η20，0· 5mLH2SO4, 2. Og NaOH, 12. Og 乙二胺四乙酸二鈉和 IOOOmL H2O0所述步驟2)的培養方法是將純凈的初始OD6tltl值為O. 01的銅綠假單胞菌GIMT1. 074接種到培養基中，所有培養基初始pH值為7. 2，液體培養和固體培養溫度為30°C，搖床培養時轉速均為200rpm，培養時間為40小時。所述光密度法測量菌體濃度方法是光密度以相應的培養基做空白，在600nm波長下測定菌懸液的吸光度(OD6tltl);樣品的濃度超過O. 8的時候需要稀釋至0.8以下再用所測量的結果與稀釋倍數相乘得到菌液的實際0D_值。6.如權利要求1所述的方法，其特征是恒重干燥法測量菌體濃度方法是將耐高溫的離心管恒重至干重，稱量記錄，取一定體積不同生理時期不同濃度的菌液，離心，傾去上清液；用無菌蒸餾水沖洗細胞，反復洗滌兩次，棄上清，然后將離心管和菌體放置干燥箱中干燥至恒重，稱量記錄。所述高效液相色譜法是高效液相色譜法色譜型號為安捷倫高效液相色譜1200，色譜柱型號為Eclipse XDB-C18,4. 6 X 250mm, 5 μ m ;流動相采用體積比甲醇水=4:3，流速1.OmL/min ;進樣量為10 μ L，柱溫30°C，UV器檢測波長280nm。本發明利用銅綠假單胞菌GMT1. 074降解苯酚和間甲酚混合物的過程中發現I)間甲酚的濃度越高對苯酚降解的抑制作用越大，細胞濃度達到同樣OD值所用的時間越長，但是在充足的反應時間之后，間甲酚濃度越高，最終細胞濃度越大；同時，間甲酚的濃度越高，完全降解苯酚和間甲酚所需要的時間越長；2)苯酚的濃度越高，對間甲酚降解具有一定的抑制作用，細胞濃度達到同樣OD值所用的時間越短，但是在充足的反應時間之后，苯酚濃度越高，最終細胞濃度越大；同時，苯酚的濃度越高，完全降解間甲酚和苯酚的降解時間越長。本發明對培養過程中細胞濃度的變化和苯酚與間甲酚降解情況的變化進行分析，得到多酚污染物生物降解過程中的相互作用，這對于實際環境中酚類污染物的生物降解作用具有一定的理論指導意義和實際應用價值。
圖1是不同濃度的間甲酚存在對銅綠假單胞菌GMT1. 074苯酚生物降解特性的影響，其中包括菌體的生物量變化趨勢、體系中的苯酚濃度變化以及降解體系中間甲酚的濃
度變化。圖2是不同濃度的苯酚存在對銅綠假單胞菌GMT1. 074間甲酚生物降解特性的影響，其中包括菌體的生物量變化趨勢、體系中的苯酚濃度變化以及降解體系中間甲酚的濃
度變化。
具體實施例方式通過下面結合具體實例將有助于進一步理解本發明，但本發明的保護范圍并不限制于此I配置用于降解多酚污染物的培養基A、無機鹽培養基的成分是(NH4) 2S04500mg，KH2P04200mg, MgSO4IOOmg,Na2HPO4 · 12H20 800mg，酵母浸粉20mg，痕量元素母液10mL，H2O IOOOmL ;其中痕量元素母液成分如下MnSO4 · 4H20 O. 4g, ZnSO4 · 7H20 O. 4g, Na2MoO4 · 2Η20，0· lg, CuSO4 · 5H20 0. lg,CaCl 21· Og, Na2S0410. Og, FeSO4 · 7H20 2. Og, H2SO4O. 5mL, NaOH 2. Og,乙二胺四乙酸二鈉12. Og, H2O IOOOmL0B、酚類降解實驗所用的選擇性培養基是在無機鹽培養基基礎上添加苯酚或間甲酚作為碳源。苯酚滅菌經過O. 22μm膜過濾，其他試劑和培養基滅菌在115°C下進行30min。在研究不同間甲酚濃度對苯酚降解影響時，固定苯酚的濃度為600mg/L，選擇間甲酚的濃度為100、200、300、400、500mg/L五個梯度水平。在研究不同苯酚濃度對間甲酚的降解影響時，固定間甲酚的濃度為400mg/L，選擇苯酚的濃度為200、300、400、500、600mg/L五個梯度水平，通過在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時；總共十個梯度，每個梯度進行三組平行實驗。。每5小時取樣測量反應體系中的菌體濃度和剩余的酚類污染物的濃度并進行分析，關聯得到了不同成分對酚類污染物降解的影響作用方式。2銅綠假單胞菌GMT1. 074接種到培養基中培養將純凈的初始0D_值為O. 01的銅綠假單胞菌GMT1. 074接種到培養基中，進行培養，培養條件如下所有培養基初始PH值為7. 2，液體培養和固體培養溫度均為30°C，搖床培養時轉速均為200rpm。培養時間為40小時。3降解過程中的細胞濃度和酚類物質濃度測定方法是A.每隔5小時取出培養基中的樣品，進行測量菌體的濃度和降解體系中的酚類物質濃度，測量菌體濃度的方法如下a菌體濃度采用光密度法和恒重干燥法進行測量。具體操作如下光密度以相應的培養基做空白，在600nm波長下測定菌懸液的吸光度(OD600)0需要注意的是，樣品的濃度超過O. 8的時候需要稀釋至O. 8以下再用所測量的結果與稀釋倍數相乘得到菌液的實際OD60O 值。b恒重干燥法，將耐高溫的離心管恒重至干重，稱量記錄，取一定體積不同生理時期不同濃度的菌液，離心，傾去上清液。用無菌蒸餾水沖洗細胞，反復洗滌兩次，棄上清，然后將離心管和菌體放置干燥箱中干燥至恒重，稱量記錄。B.降解體系中的酚類物質濃度測定方法是 培養液中酚類物質的濃度采用高效液相色譜(HPLC)法測定。色譜型號為安捷倫(Agilent)高效液相色譜 1200,色譜柱型號為 Eclipse XDB-C18,4. 6 X 250mm, 5 μ m。流動相采用甲醇水=4:3 (V:V，流速1. OmL/min。進樣量為10 μ L，柱溫30°C，UV器檢測波長280nm。具體測試數據如下實施例1苯酚濃度對間甲酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加400mg/L的間甲酹，以及200mg/L的苯酹，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第10小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為86. 31mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酚和間甲酚的濃度分別為100. 45mg/L和348. 79mg/L。實施例2 苯酚濃度對間甲酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加400mg/L的間甲酹，以及200mg/L的苯酹，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第15小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為151. 34mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酚和間甲酚的濃度分別為3. O lmg/L和276. 34mg/L。實施例3苯酚濃度對間甲酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加400mg/L的間甲酹，以及200mg/L的苯酹，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第20小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為213. 51mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酹和間甲酹的濃度分別為Omg/L和75. 24mg/Lo
實施例4苯酚濃度對間甲酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加400mg/L的間甲酹，以及200mg/L的苯酹，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第25小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為299. 61mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酹和間甲酹的濃度分別為Omg/L和5. 49mg/L。實施例5苯酚濃度對間甲酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加400mg/L的間甲酹，以及600mg/L的苯酹，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第10小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為69. 28mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酚和間甲酚的濃度分別為596. 96mg/L和362. 49mg/L。實施例6苯酚濃度對間甲酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加400mg/L的間甲酹，以及600mg/L的苯酚，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第20小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為326. 95mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酚和間甲酚的濃度分別為28 6. 45mg/L和321. 4lmg/L0實施例7苯酚濃度對間甲酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加400mg/L的間甲酹，以及600mg/L的苯酚，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第30小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為658. 34mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酹和間甲酹的濃度分別為Omg/L和103. 81mg/Lo實施例8間甲酚濃度對苯酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加600mg/L的苯酹，以及100mg/L的間甲酹，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第10小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為87. 21mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酚和間甲酚的濃度分別為281. 15mg/L和98. 29mg/L。實施例9間甲酚濃度對苯酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及100mg/L的間甲酚，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第15小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為163. 26mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酚和間甲酚的濃度分別為12.1 lmg/L和83. 24mg/L。實施例10間甲酚濃度對苯酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及100mg/L的間甲酚，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第20小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為364. 41mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酹和間甲酹的濃度分別為Omg/L和Omg/L。實施例11間甲酚濃度對苯酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及500mg/L的間甲酚，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第10小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為45. 48mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酹和間甲酹的濃度分別為598. 14mg/L和496. 31mg/L。實施例12 間甲酚濃度對苯酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及500mg/L的間甲酹，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第20小時用細胞干重測量法測得細胞的濃度為170. 63mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酚和間甲酚的濃度分別為312. 54mg/L和306. 5lmg/L0實施例13間甲酚濃度對苯酚降解的影響按要求配置酚類降解的無機鹽培養基，在115°C下進行30min滅菌。固定添加600mg/L的苯酚，以及500mg/L的間甲酹，在200rpm下的轉速和30°C的搖床中培養40小時，在第30小時用細胞干重 測量法測得細胞的濃度為329. 15mg/L，運用液相色譜儀測量得到的苯酹和間甲酹的濃度分別為Omg/L和129. 46mg/L。測試數據繪制如圖1和圖2 :從圖中可以明確得出多酚污染物生物降解過程中的相互作用，利用銅綠假單胞菌GMT1. 074降解苯酚和間甲酚混合物的過程中發現1.兩種底物之間存在著相互抑制和促進作用，間甲酚的濃度越高對苯酚降解的抑制作用越大，細胞濃度達到同樣OD值所用的時間越長，但是在充足的反應時間之后，間甲酚濃度越高，最終細胞濃度越大；同時，間甲酚的濃度越高，完全降解苯酚和間甲酚所需要的時間越長。2.苯酚的濃度越高，對間甲酚降解具有一定的抑制作用，細胞濃度達到同樣OD值所用的時間越短，但是在充足的反應時間之后，苯酚濃度越高，最終細胞濃度越大；同時，苯酚的濃度越高，完全降解間甲酚和苯酚的降解時間越長。
權利要求
1.一種多酚污染物生物降解過程中的相互作用的研究方法，其特征是步驟如下 1)配置用于降解多酚污染物的培養基；酚類降解實驗所用的選擇性培養基是在無機鹽培養基基礎上添加苯酚或間甲酚作為碳源；在研究不同間甲酚濃度對苯酚降解影響時，固定苯酚的濃度，選擇間甲酚的濃度不同濃度的幾個梯度水平；在研究不同苯酚濃度對間甲酚的降解影響時，固定間甲酚的濃度，選擇苯酚的不同濃度的幾個梯度水平；每個梯度進行平行實驗； 2)利用銅綠假單胞菌GIMT1.074接種到培養基中進行培養； 3)采用光密度法和恒重干燥法進行測量菌體濃度；采用高效液相色譜法測定降解體系中的酚類物質濃度； 4)根據培養過程中細胞濃度的變化和苯酚與間甲酚降解情況的變化，得到多酚污染物生物降解過程中的相互作用數據。
2.如權利要求1所述的方法，其特征是所述的培養基是500mg(NH4) 2S04，200mgKH2P04，IOOmg MgSO4,800mg Na2HPO4 · 12H20，20mg 酵母浸粉，IOmL 痕量元素母液和 IOOOmL H20。
3.如權利要求2所述的方法，其特征是所述的痕量元素母液成分如下O. 4gMnS04 ·4Η20，0· 4g ZnSO4 ·7Η20，0· IgNa2MoO4 ·2Η20，0· Ig CuSO4 ·5Η20，1. Og CaCl2,10. OgNa2SO4, 2. Og FeSO4 ·7Η20，0· 5mL H2SO4, 2. Og NaOH, 12. Og 乙二胺四乙酸二鈉和 IOOOmL H2O0
4.如權利要求1所述的方法，其特征是步驟2)的培養方法是將純凈的初始0D_值為O. 01的銅綠假單胞菌GIMT1. 074接種到培養基中，所有培養基初始pH值為7. 2，液體培養和固體培養溫度為30°C，搖床培養時轉速均為200rpm，培養時間為40小時。
5.如權利要求1所述的方法，其特征是光密度法測量菌體濃度方法是光密度以相應的培養基做空白，在600nm波長下測定菌懸液的吸光度(OD6tltl);樣品的濃度超過O. 8的時候需要稀釋至O. 8以下再用所測量的結果與稀釋倍數相乘得到菌液的實際0D_值。
6.如權利要求1所述的方法，其特征是恒重干燥法測量菌體濃度方法是將耐高溫的離心管恒重至干重，稱量記錄，取一定體積不同生理時期不同濃度的菌液，離心，傾去上清液；用無菌蒸餾水沖洗細胞，反復洗滌兩次，棄上清，然后將離心管和菌體放置干燥箱中干燥至恒重，稱量記錄。
7.如權利要求1所述的方法，其特征是高效液相色譜法是高效液相色譜法色譜型號為安捷倫高效液相色譜1200，色譜柱型號為Eclipse XDB-C18，4. 6 X 250mm，5 μ m ;流動相采用體積比甲醇水=4:3，流速1.0mL/min ;進樣量為1(^1^，柱溫301，UV器檢測波長280nm。
8.一種多酚污染物生物降解過程中的相互作用，其特征是利用銅綠假單胞菌GIMT1. 074降解苯酚和間甲酚混合物的過程中發現 1)間甲酚的濃度越高對苯酚降解的抑制作用越大，細胞濃度達到同樣OD值所用的時間越長，但是在充足的反應時間之后，間甲酚濃度越高，最終細胞濃度越大；同時，間甲酚的濃度越高，完全降解苯酚和間甲酚所需要的時間越長； 2)苯酚的濃度越高，對間甲酚降解具有一定的抑制作用，細胞濃度達到同樣OD值所用的時間越短，但是在充足的反應時間之后，苯酚濃度越高，最終細胞濃度越大；同時，苯酚的濃度越高，完全降解間甲酚和苯酚的降解時間越長。
全文摘要
本發明涉及一種多酚污染物生物降解過程中的相互作用及研究方法。配置用于降解多酚污染物的培養基；酚類降解實驗選擇性培養基是在無機鹽培養基上添加苯酚或間甲酚作為碳源；在研究不同間甲酚濃度對苯酚降解影響時，固定苯酚的濃度，選擇間甲酚的濃度不同濃度的幾個梯度水平；利用銅綠假單胞菌GIMT1.074接種到培養基中在研究不同苯酚濃度對間甲酚的降解影響時，固定間甲酚的濃度，選擇苯酚的不同濃度的幾個梯度水平；每個梯度進行平行實驗；對培養過程中細胞濃度的變化和苯酚與間甲酚降解情況的變化進行分析，得到多酚污染物生物降解過程中的相互作用，這對于實際環境中酚類污染物的生物降解作用具有一定的理論指導意義和實際應用價值。
文檔編號C12Q1/02GK103060420SQ201210576260
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月25日 優先權日2012年12月25日
發明者賈曉強, 周征西, 聞建平 申請人:天津大學