專利名稱：一種tmc1耳聾基因突變篩查方法
技術領域：
本發明涉及一種基因突變篩查方法，具體涉及一種TMCl耳聾基因突變篩查方法。
背景技術：
研究表明，60%耳聾由遺傳因素導致，另外40%與環境因素有關。以往由于人們缺乏對耳聾遺傳病因學的深入認識以及診斷技術，無法明確耳聾分子病因，更無法預防其發生。近30年來，伴隨耳聾遺傳病因學及分子生物學技術的快速發展，至今已有84個耳聾基因被克隆，一些常見基因得到了深入的認識，耳聾分子病因學診斷成為可能。雖然歐美自上世紀末開展了耳聾基因診斷工作，但因缺乏對中國耳聾人群致聾遺傳因素的系統性研究，并缺乏符合中國國情及遺傳背景的耳聾基因篩查及診斷工具，我國臨床耳聾基因診斷工作受到嚴重限制而遠遠滯后。TMCl基因突變可以引起常染色體顯性及隱性耳聾。如“耳聾相關基因TMC1”(《國際耳鼻喉頭頸外科雜志》，2008年第05期)中報道，TMCl基因突變具有常染色體隱性遺傳和顯性遺傳兩種遺傳方式，相對應出現兩種截然不同的聽力表型特征，正逐漸為聽力學家、遺傳學家和耳科學臨床工作者所關注。研究表明:TMClc.1714G>A(p.D572N)是引起常染色體顯性遺傳性耳聾的熱點突變，近期的研究也在中國發現了攜帶該突變的耳聾家庭。由于該突變區域缺乏酶切位點，不能進行酶切反應，因此目前國際上檢測該突變主要是采用Sanger測序法。此方法成本較高，限制了該突變的大規模人群篩查。發明目的有鑒于此，為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種TMCl耳聾基因突變篩查方法，該方法簡單、快速、經濟，解決了 TMClc.1714G > A(p.D572N)熱點難以進行人群大規模篩查的難題。本發明提供的一種TMCl耳聾突變基因篩查方法，所述方法包括(I)提取外周血白細胞DNA; (2)以外周血白細胞DNA為模板，以上游引物:TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC下游引物:AACCTGGGAGGCTITTCTGT進行PCR擴增，(3)以限制性內切酶Sal I酶切所述PCR擴增產物，得到160bp，130bp，30bp三條帶即為TMCl耳聾基因陽性突變樣本。進一步，酶切所述PCR擴增產物的反應條件為:37°C，4小時。進一步，所述PCR擴增產物酶切后以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。進一步，所述PCR擴增產物酶切后以8%聚丙烯凝膠電泳鑒定。本發明的有益效果在于:(1)易于實現:本發明技術方法不需要特殊昂貴設備，且能較快定購到實驗所需試劑，實驗前期準備時間短；(2)操作簡單:按照分子生物學試驗室的程序化操作即可完成。(3)成本低:所引入的限制性內切酶Sal I是普通常用酶，價格低廉(500U/80元)，每例樣品檢測需1U,加上凝膠、電泳液、酶切體系的配制,酶切反應成本約為3元/例，而傳統的Sanger測序法成本為25元/例。(4)準確率高:檢測結果與Sanger測序法結果完全吻合，無假陰性、假陽性。(4)解決了難題:鑒于以上優點，該技術可在基層單位廣泛開展，解決了TMClc.1714G > A(p.D572N)熱點難以進行人群大規模篩查的難題。本發明通過在引物設計中對突變位點上游第三位堿基進行修改，引入了 Sal I酶切位點，修飾了上游引物，采用修改后的引物進行PCR反應，擴增產物可采用酶切法對突變進行鑒定，大大降低了檢測成本。野生型樣本(即非突變樣本)酶切后為兩條帶130bp，30bp，雜合突變型樣本(即陽性突變樣本)為三條帶160bp，130bp，30bp，易于對比鑒定。
:圖1:2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切擴增產物。凝膠電泳結果，Iane1，21 為 PCR 產物；Iane 2，3，4，6，7，8，9，10，11，12，14，16，17，18，19，20，22，23，24 為野生型；lane 5，13，15 為突變型圖2:野生型和突變型酶切后的樣本瓊脂糖凝膠電泳結果判讀示意圖。圖3:野生型和突變型酶切后的樣本Sanger測序驗證。
具體實施方式
:實施例11、模板DNA:提取自外周血白細胞中DNA，2、PCR反應體系
權利要求
1.一種TMCl耳聾基因突變篩查方法，其特征在于:所述方法包括(I)提取外周血白細胞DNA; (2)以外周血白細胞DNA為模板，以 上游引物:TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC 下游引物:AACCTGGGAGGCTITTCTGT 進行PCR擴增，(3)以限制性內切酶Sal I酶切所述PCR擴增產物，得到160bp，130bp，30bp三條帶即為TMCl耳聾基因陽性突變樣本。
2.按照權利要求1所述的TMCl耳聾基因突變篩查方法，其特征在于:酶切所述PCR擴增產物的反應條件為:37°C，4小時。
3.按照權利要求1所述的TMCl耳聾基因突變篩查方法，其特征在于:所述PCR擴增產物酶切后以2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
4.按照權利要求1所述的TMCl耳聾基因突變篩查方法，其特征在于:所述PCR擴增產物酶切后以8%聚 丙烯凝膠電泳鑒定。
全文摘要
本發明提供一種TMC1耳聾突變基因篩查方法，所述方法包括(1)提取外周血白細胞DNA；(2)以外周血白細胞DNA為模板，以上游引物TCCTCTAGCCTTCATACACCGAAGTC下游引物AACCTGGGAGGCTTTTCTGT進行PCR擴增，(3)以限制性內切酶Sal 1酶切所述PCR擴增產物，得到160bp，130bp，30bp三條帶即為TMC1耳聾基因陽性突變樣本。本發明的有益效果在于，易于實現，操作簡單，成本低，準確率高，解決了TMC1c.1714G＞A熱點難以進行人群大規模篩查的難題。
文檔編號C12Q1/68GK103103257SQ201210579480
公開日2013年5月15日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者高雪, 戴樸 申請人:中國人民解放軍總醫院