專利名稱：一種快速檢測kras基因突變的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測KRAS基因突變的方法。
背景技術：
基因突變是指基因組DNA分子在結構功能上發生堿基組成或排列順序的改變，主要包括堿基的替代和片段的插入缺失，是導致基因型疾病的重要原因之一。基因突變分析在生物醫學研究中，尤其是在基因型疾病診斷及病理研究中有著非常重要的作用。KRAS基因編碼的蛋白參與由表皮生長因子受體(EGFR)介導的細胞信號轉導通路，影響細胞的增殖、生長和轉移；正常的KRAS基因編碼的蛋白在接受上游信號活化后被激活，并將在信號
傳遞給下游細胞因子后恢復非激活狀態；而突變的KRAS基因所編碼的蛋白無需上游信號活化便始終處于激活狀態，導致細胞的非正常增殖和生長，引起惡性腫瘤。抗EGFR類腫瘤藥物通過特異性阻滯EGFR與受體結合，阻斷細胞轉導通路，從而達到抑制癌細胞增殖的目的；多項研究發現，接受抗EGFR藥物治療的結直腸癌患者中，KRAS基因野生型的病人較KRAS基因突變型病人更能從治療中受益具有更高的藥物客觀反應率和較長的生存時間。因此，能夠準確檢測KRAS突變狀態對指導結直腸癌患者臨床用藥有重要意義。傳統檢測KRAS基因突變的方法多種多樣，其中最為經典是雙脫氧測序技術，此外還包括等位基因特異性寡核苷酸雜交(ASO)、連接酶檢測反應(LDR)、多聚酶鏈限制性長度多態性分析(PCR-RFLP)和TaqMan技術。雖然這些方法能夠檢測突變是否存在，但大多數方法不能確定突變的類型并且只能檢測到突變的一部分；同時大多數方法需要瓊脂糖凝膠電泳等PCR后處理檢測才能分析結果，準確度和靈敏度受到限制。近年來，等位基因特異性PCR(Allele-specific PCR,ARMS)、高分辨溶解曲線(HRM)、變性高效液相色譜分析(dHPLC)和焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)等方法改善了檢測的靈敏度和特異性，但仍存在假陽性現象嚴重和操作繁瑣等缺點。分子信標探針(Molecular Beacon)是一種可以自發形成莖環結構的雙標記寡核昔酸探針，其5’末端標記有突光基團，3’末端標記有洋滅基團；當頸環結構形成后，突光基團和淬滅基團空間距離靠近，發生熒光共振能量轉移(FRET)，熒光基團被外界光源激發后發出的光子被淬滅基團吸收，此時探針不能被激發出熒光；若體系中存在與探針序列相匹配的模板，當分子信標探針與模板雜交后，其發夾結構被打開，使得熒光基團與淬滅基團空間距離增大，此時突光基團被激發出的突光未被淬滅，可以檢測突光信號；同時由于突光強度與體系中模板的量呈正比，故分子信標探針可以用于實時定量PCR反應。當分子信標與模板鏈雜交后，若繼續升高溫度可導致探針與模板再次分離，從而使得熒光強度隨溫度升高而降低。將熒光強度對溫度變化時間求導數便得到熔解曲線，熔解曲線的峰值為熒光信號降低速率最大時對應的溫度，即為模板與探針結合強度(Tm值)。由于序列的差別，探針與野生型模板和突變型模板的結合強度有差別，表現在熔解曲線(熔解峰)的不同。傳統的熔解曲線法靈敏度較低，使得檢測結果不準確。
發明內容
為了克服傳統探針熔解曲線法靈敏度低，檢測不精確的缺點，本發明提出一種快速檢測KRAS基因突變的方法，不僅節省了耗材，同時具有高靈敏度，高特異性的特點，檢測
結果更可靠。為實現以上發明目的，本發明提供如下基本技術方案。
一種快速檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟(I)分子信標探針和模板擴增引物的設計及合成上游引物(25nt):5’ -GATAGTGTATTAACCTTATGTGTGA-3’延伸阻滯引物(38nt):
權利要求
1.一種快速檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟 (1)分子信標探針和模板擴增引物的設計及合成 上游引物(25nt):·5’ -GATAGTGTATTAACCTTATGTGTGA-3’ 延伸阻滯引物(38nt):
2.根據權利要求I所述的快速檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于 以單管反應體系25iil計，反應管中加入上游引物500nM，延伸阻滯引物50nM，UNG酶(尿嘧啶-N-糖基化酶)0. 2U，5’ 一3’外切酶活性缺失聚合酶(TIANNIUM Taq DNAPolymerase) 0. 5U，dNTPs (脫氧核糖核苷三磷酸)200 u M，dUTP (脫氧尿苷三磷酸)400 u M，分子信標探針 250nM，10 X PCRBuffer (TIANNIUM Taq PCR Buffer) 2. 5 y 1，ddH20補足體積·25 u I。
3.根據權利要求2所述的快速檢測KRAS基因突變的方法，其特征在于 PCR 反應參數設置如下:50°C，2 5min ;95°C，12 15min ;95°C，2 5sec ;56°C，(Tlsec ；·65 °C,O^lsec ;55 65個循環；熔解95°C，l 5min ;50°C— 72 °C每秒收集熒光15 20次，0.02 0. 05 °C梯度升溫。
全文摘要
本發明提出一種快速檢測KRAS基因突變的方法，以克服傳統探針熔解曲線法靈敏度低，檢測不精確的缺點。該快速檢測KRAS基因突變的方法，包括以下步驟(1)分子信標探針和模板擴增引物的設計及合成；(2)提取被測樣本的KRAS基因組DNA；(3)配制反應體系；(4)PCR反應；PCR反應完成后進行熔解曲線分析，通過熔解峰的Tm值判斷出被測樣本中是否發生了KRAS突變。本發明將分子信標探針和延伸阻滯引物結合起來，并利用無5’→3’外切酶活性聚合酶進行體外快速檢測KRAS突變，不僅節省了耗材，同時具有高靈敏度，高特異性的特點，使檢測結果更可靠。
文檔編號C12Q1/68GK102796817SQ201210233750
公開日2012年11月28日 申請日期2012年7月6日 優先權日2012年7月6日
發明者陳超, 劉金輝, 戴鵬高, 王浩, 王剛 申請人:陜西北美基因股份有限公司