專利名稱：Egfr基因突變檢測的擴增引物、檢測探針和液相芯片的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫學體外診斷技術，具體涉及EGFR基因上與酪氨酸激酶抑制劑(TKI)藥物療效相關突變檢測的擴增引物、檢測探針和液相芯片。
背景技術：
表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)是細胞表面受體酪氨酸激酶HER/ErbB家族成員，它可以與配體特異性結合，通過同源或異源二聚體的形式使自身磷酸化，進而調控細胞的生長或存活。以EGFR為靶點的分子靶向治療目前在NSCLC的治療中日漸突出，其中以EGFR酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI),如吉非替尼和俄羅替尼,最為重要。NSCLC的前期臨床試驗表明，在含鉬類藥物聯合化療失敗后，吉非替尼仍有12% 18%的客觀有效率，疾病控制率> 40%左右，中位生存期約為7個月左右，且受試者的癥狀改善且安全性良好。然而，并非所有NSCLC患者都對EGFR-TKI敏感，其中EGFR突變人群反應率可達到75%-90%，中位生存期提高至12-23個月。因此，EGFR基因突變可以作為接受靶向治療的NSCLC患者預后良好的分子標志，通過合理檢測EGFR基因突變篩選EGFR-TKIs受益人群以優化EGFR-TKIs藥物靶向治療，對NSCLC患者意義重大。與酪氨酸激酶抑制劑(TKI)藥物療效相關的突變主要位于EGFR基因的18、19、20和21號外顯子區域上，其中，19號外顯子的缺失突變(747-750位點)和21號外顯子的亮氨酸突變為精氨酸(L858R)占EGFR致敏突變的90%。針對EGFR基因突變的檢測方法多種多樣，主要有DNA測序法、酶切法、富集突變的PCR法、實時熒光定量PCR法、高效液相色譜法和毛細管電泳法等。DNA測序法通過正反雙向測序進行比較，是目前檢測EGFR基因突變的金標準，但是該法需對測序樣品進行擴增、純化、序列分析，步驟多，反應耗時長，可能增加錯誤的概率。此外，DNA測序法還存在著操作繁瑣，結果判讀復雜，對環境和操作者要求較高等諸多缺點，因而僅適合少數技術裝備精良的實驗室開展，各級醫院很少能獨立開展。實時熒光定量PCR法雖然能在較短時間內實現對較多樣本的檢測，但是每次反應往往只能對一個或少數突變進行檢測，無法實現高通量，此外也存在著假陰性的可能。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是高通量高靈敏度檢測EGFR基因突變體的方法，對預測患者使用吉菲替尼后的療效進行評估，為了克服現有檢測技術的不足，提供了一種EGFR基因突變檢測的擴增引物、檢測探針和液相芯片，該液相芯片可用于檢測與酪氨酸激酶抑制劑(TKI)藥物療效相關的八種常見突變，具體情況如表一所示。表一
權利要求
1.一種EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征在于，包括 A)PCR 擴增弓I物用于擴增出具有 18M、19M1 (I)、19M1 (2)、19M2、19M3、20M、2IMl 和 / 或21M2位點的擴增引物； B)LDR連接探針針對A)中擴增的位點分別設計的上游檢測探針和下游連接探針，所述上游檢測探針包括5’端的TAG序列和3’端的上游特異序列，所述下游連接探針為5’端進行磷酸化標記，3’端經熒光素標記的下游特異序列； OAnt1-TAG序列包被的微球分別包被有特異的Ant1-TAG序列的，具有不同顏色編碼的微球，所述Ant1-TAG序列與B)中所選的TAG序列互補配對。
2.根據權利要求1所述一種EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征在于，所述PCR擴增引物包括針對18外顯子的P18U和P18L、針對19外顯子的P19U和P19L、針對20外顯子的P20U和P20L以及針對21外顯子的P21U和P21L。
3.根據權利要求1所述一種EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征在于，所述上游特異序列是針對18M的L18U、針對19M1 (I)的L191 (I) U、針對19M1 (2)的L191 (2) U、針對19M2的L192U、針對19M3的L193、針對20M的L790U、針對2IMl的L211U和/或針對21M2的L212U，所述下游特異序列是針對18M的L18L、針對19M1⑴的L191(1)L、針對19M1⑵的L191(2)L、針對 19M2 的 L192L、針對 19M3 的 L193L、針對 20M 的 L790L、針對 21M1 的 L211L和/或針對21M2的L212L。
4.根據權利要求1所述一種EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征在于，所述TAG序列選自TAG1 TAG8。
5.根據權利要求1所述一種EGFR基因突變檢測的液相芯片，其特征在于，所述熒光素為藻紅蛋白。
6.一種EGFR基因突變檢測的PCR擴增引物，其特征在于，包括針對18外顯子的P18U和P18L、針對19外顯子的P19U和P19L、針對20外顯子的P20U和P20L以及針對21外顯子的P21U和P21L。
7.一種EGFR基因突變檢測的LDR連接探針，其特征在于，包括針對18M的L18U和L18L、針對 19M1(1)的 L191(1)U 和 L191(1)L、針對 19M1 (2)的 L191(2)U 和 L191(2)L、針對 19M2 的 L192U 和 L192L、針對 19M3 的 L193U 和 L193L、針對 20M 的 L790U 和 L790L、針對21M1 的 L211U 和 L211L 和 / 或針對 21M2 的 L212U 和 L212L。
全文摘要
本發明屬于醫學體外診斷技術，具體涉及EGFR基因上與酪氨酸激酶抑制劑(TKI)藥物療效相關突變檢測的擴增引物、檢測探針和液相芯片。所述EGFR基因突變檢測的液相芯片包括PCR擴增引物、LDR連接探針和Anti-TAG序列包被的微球。所述擴增引物包括針對18、19、20和21號外顯子的4對引物。所述連接探針包括針對與酪氨酸激酶抑制劑(TKI)藥物療效相關的8個主要突變位點的8對連接探針。本發明提供的液相芯片可對8種EGFR基因突變進行聯合檢測，單次反應就能對8個突變位點同時進行準確分析，具有低價格并適用于大量樣本平行檢測的特點。
文檔編號C12Q1/68GK103045746SQ201210592068
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月31日 優先權日2012年12月31日
發明者婁加陶, 周妍, 王勤熙 申請人:上海市胸科醫院, 婁加陶