用于柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的基因操作和表達系統的制作方法

用于柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的基因操作和表達系統的制作方法
【專利摘要】本發明涉及分離的啟動子和合成顯性選擇構建體和增強子用于基因靶向的應用，用于在選自柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的物種中有效生產遺傳修飾的細胞，所述物種特別是選自紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、擲孢酵母屬或黑粉菌屬的物種。
【專利說明】用于柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的基因操作和表達系統
[0001] 相關申請的奪叉引用
[0002] 本申請涉及于2011年6月10日提交的美國臨時專利申請序列號61/495, 619且 要求其優先權。這個申請通過引用并入本文。
[0003] 序列提奪
[0004] 本申請隨同電子格式的序列表一起提交。序列表名稱為 2577207SequenceListing.txt，于2012年4月11日創建并且大小為31kb。序列表的電子 格式中的信息是本申請的部分，并且整體引入本文作為參考。

【背景技術】
[0005] 本發明涉及植物分子生物學領域，更具體而言涉及在柄銹菌亞門 (Pucciniomycotina)和黑粉菌亞門（Ustilaginomycotina)的物種中的高效率基因操作和 強基因表達系統。
[0006] 本文用于闡明本發明背景的出版物及其他材料以及特別提供關于實踐的另外細 節的案例通過引用并入，并且為了方便起見通過作者和日期在下述正文中提及，并且在所 附參考書目中按作者字母順序列出。
[0007] 柄銹菌亞門是擔子菌門中的真菌亞門（Kirk等人，2008)。它擁有具有重 要工業應用的許多物種。例如，紅冬孢酵母屬（Rhodosporidium)和鎖擲酵母屬 (Sporidiobolus)中的許多物種，例如圓紅冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides) (也稱為瘦弱紅酵母（Rhodotorula gracilis)、Rhodosporidium glutinis)、粘紅酵母 (Rhodotorula glutinis)、Torula koishikawensis和Torula rubescens)和赫色擲抱酵母 (Sporobolomyces salmonicolor)，是能夠高密度發酵的富油單細胞酵母（Hu等人，2009; Meng等人，2009)。這些物種具有作為用于生產長鏈烴的宿主的極大潛力，所述長鏈烴例如 三酰基甘油（TAG或脂肪）、脂肪酸酯（生化柴油）、脂肪醇、醇、內酯、萜類和維生素（Wu等 人，2010a ;Wu等人，2010b ;Zhao等人，2010a ;Zhao等人，2010b)。盡管基于PEG介導的原 生質體轉染的方法已在圓紅冬孢酵母中報道（Tully和Gilbert，1985)，但該方法是高度不 可靠的且需要營養突變型用于轉化。由于質粒PHG2的不穩定性，轉化載體不能應用于工業 菌株的基因操作，所述質粒PHG2含有圓紅冬孢酵母的苯丙氨酸氨裂解酶（PAL)編碼基因 (PAL)和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的LEU2基因作為選擇標記，和DNA載體 整合的位點特異性模式。類似地，不存在可以在紅冬孢酵母屬中用于驅動實用基因或選擇 標記表達的功能啟動子。類似情況在擲孢酵母屬（Sporobolomyces)中發現（Ianiri等人， 2011)。在另一個例子中，黑粉菌亞門中的物種特別是黑粉菌屬（Ustilago)和Pseudozyma 已知生產糖脂，所述糖脂可以充當表面活性劑或殺真菌劑（Hewald等人，2005 ;Teichmann 等人，2010)。
[0008] 完整的基因操作和表達系統一般由下述組成：組成型或誘導型啟動子；可選擇標 記；DNA載體；將DNA引入宿主細胞內以整合到基因組內或作為附加體復制的方法；和抑制 或阻斷目的基因表達的方法。
[0009] 根瘤土壤桿菌（Agrobacterium tumefaciens)介導的轉化（ATMT)是用于轉化許 多真菌物種的方便方法（De Groot等人，1998)。轉化效率可以通過下述得到改善：最佳化 用于土壤桿菌屬（Agrobacterium)的pH值、在共培養過程中受體細胞和供體細胞的比例和 絕對值（Ji等人，2010)和使用衍生自T-DNA的增強子DNA序列（YE和Gilbertson，2009)。 在植物物種的ATMT中，已報道了改善轉化的幾種技術，包括植物組織的超聲處理和真空滲 入（de Oliveira等人，2009);驅動選擇標記表達的更強啟動子（Maehara等人，2010)和宿 主防御應答的控制（Khanna等人，2007 ;Vega等人，2008)。這些修飾的效應在真菌的ATMT 中仍未得到證實。
[0010] 眾所周知真菌細胞還可以通過下述進行轉化：完整細胞或原生質體的電穿孔（Wu 和Letchworth，2004);和原生質體的轉染（(Meyer，2008;Turgeon等人，2010)或簡單化 學誘導以增加細胞壁滲透性（Gietz和Woods，2002 ;Hill等人，1991 ;Ito等人，1983)。隨 機插入誘變是用于快速鑒定未知基因的有力工具。盡管限制性酶介導的整合（REMI)可以 用于改善在PEG介導的轉化方案中線性化DNA載體的整合（B0lker等人，1995 ;Maier和 Schafer，1999)，但這種方法受阻于基因組DNA的大缺失、多重插入和未加標簽的誘變包括 染色體重排（:B6lker等人，1995 ;Meyer 等人，2003 ;Sweigard 等人，1998)。另一方面，ATMT 已公認為這個方面的優良工具（Choi等人，2007 ;Soltani等人，2008)。
[0011] 真菌轉化體的選擇已由表達修飾抗生素和除草劑的蛋白質的人工構建體證實。常 用基因包括賦予針對潮霉素 B的抗性的潮霉素磷酸轉移酶（hpt)(Bundock等人，1995); 賦予針對諾爾絲菌素的抗性的諾爾絲菌素乙酰轉移酶（nat) (Ji等人，2010 ;KrUgel等人， 1988)、賦予針對卡那霉素或G418或新霉素的抗性的氨基糖苷3'-磷酸轉移酶（aph)或新 霉素磷酸轉移酶（npt) (Goldstein和McCusker，1999 ;Scorer等人，1994)、賦予針對博來霉 素（Zeocin)的抗性的印度斯坦鏈異壁菌（Streptoalloteichus hindustanus)博來霉素基 因（ble) (Pfeifer等人，1997 ;Takeno等人，2005);賦予針對除草劑草甘膦的抗性的5-烯 醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合成酶（aroA)基因（Comai等人，1983);賦予針對除草劑雙丙氨 磷的抗性的草胺膦乙酰轉移酶（pat) (Goldstein和McCusker，1999);賦予針對除草劑磺酰 脲的抗性的乙酰乳酸合酶（acs)基因（Haughn等人，1988)。
[0012] 基因缺失和重排是現代遺傳學中至關重要的基因靶向技術。然而，由于低基因靶 向頻率，生成此類突變體通常是非常有挑戰性的。顯著改善基因靶向頻率的技術在許多生 物體中是高度尋求的。
[0013] 在高等真核DNA非同源末端連接（NHEJ)系統中，DNA依賴性蛋白激酶（DNA-PK) 全酶包含稱為Ku70和Ku80的約70和80kDa的多肽異二聚體，其與DNA鏈斷裂結合，從而 召募且激活稱為DNA-PKcs的470-kDa催化亞基（Smith和Jackson，1999)。雖然Rad51和 Rad52對于HR途徑中的DSB修復是必需的（van Attikum等人，2003)，但DNA-PKcs/Ku復合 體和XRCC4/連接酶IV在哺乳動物系統中的NHEJ途徑中是至關重要的（van Attikum等人， 2001)。然而，關于DNA-PKcs亞基的同系物在真菌中仍未鑒定。近年來，已存在關于通過缺 失其關鍵組分中的一個或多個破壞NHEJ途徑來成功改善基因缺失頻率的幾個報道（KUck 和Hoff，2010)。這種技術難以應用。
[0014] 另一方面，已報道了抑制DNA-PK活性的大量化合物，包括渥曼青霉素 (wortmanin) (Boulton 等人，1996)、LY294002 (Rosenzweig 等人，1997)、香草醒（Durant 和 Karran，2003)、NU1025 (Boulton 等人，1999)、roi28763(Tentori 等人，2002)、 八614361(51?11行21^等人，2003)、顯7026[2-(嗎啉-4-基）-苯并[11]色-4-酮；2-(4-嗎 啉基）-4H-萘酚[1，2-b]吡喃-4-酮]和NU7441 [8-(4-二苯并噻吩）-2-(4-嗎啉 基）-4H-1-苯并吡喃-4-酮]。后面兩種被認為在動物中是更特異性和有力的DNA-PK抑制 劑（Veuger等人，2003;Willmore等人，2004)。在真菌中不存在DNA-PK的情況下，不了解 是否存在促進基因靶向的化合物。
[0015] 目前，紅冬孢酵母屬、擲孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬（Sporisorium)和黑粉菌屬中的 物種的遺傳轉化是完全不可用的或無效的，并且是可再生化學制品和生物燃料進展的主要 障礙。


【發明內容】

[0016] 本發明涉及使轉化細胞能夠高度有效生產的合成構建體和轉化方法，所述轉化細 胞選自柄銹菌亞門和黑粉菌亞門中的物種。特別相關的物種是紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌 屬、擲孢酵母屬和黑粉菌屬中的那些，在其中存在具有用于將可再生資源生物轉化成高價 值產品的極大潛力的許多物種，所述高價值產品例如甘油三酯、生物柴油、脂肪醇、維生素、 內酯、萜類和生物表面活性劑。
[0017] 在第一個方面，本發明提供了多核苷酸序列，其充當例如用于潮霉素磷酸轉移酶 (hpt)和諾爾絲菌素乙酰轉移酶基因（nat)的基因表達的強啟動子，并且允許轉化細胞在 選自紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬和黑粉菌屬的物種中的有效選擇。在一個實施方案中， 啟動子包含SEQ ID N0:1中所示的核苷酸序列。在另一個實施方案中，啟動子包含SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列。在另外的實施方案中，啟動子包含SEQ ID N0:3中所示的核苷 酸序列。在進一步的實施方案中，啟動子包含SEQ ID N0:4中所示的核苷酸序列。在另一 個實施方案中，啟動子是棉蚜（Ashibia gossipii)的tef啟動子，并且包含SEQ ID N0:5 中所示的核苷酸序列。在另外的實施方案中，啟動子包含SEQ ID N0:51中所示的核苷酸序 列。在進一步的實施方案中，啟動子包含SEQ ID N0:55中所示的核苷酸序列。在另一個實 施方案中，啟動子是粘紅酵母的硬脂酰-CoA δ 9-去飽和酶啟動子，并且包含SEQ ID N0:56 中所示的核苷酸序列。這些啟動子各自在紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、擲孢酵母屬、紅酵 母屬（Rhodotorula)、Pseudozyma和黑粉菌屬中執行強烈基因表達中是有效的。使用本文 描述的用于鑒定此類啟動子的技術，可以從曲霉菌屬（Aspergillus)、紅冬孢酵母屬、紅酵 母屬、擲孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、Pseudozyma和黑粉菌屬中的其他物種中鑒定另外的強啟 動子。此外，使用常規啟動子篩選測定法可以分離這些啟動子的可操作片段，并且使用本文 描述的技術可以篩選經轉化的真菌細胞的有效選擇。
[0018] 在第二個方面，本發明提供了包含衍生自選自下述的物種的分離啟動子的合 成顯性選擇構建體：曲霉菌屬、紅冬孢酵母屬、擲孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、紅酵母屬、 Pseudozyma和黑粉菌屬，關于其的啟動子可操作地連接至合適標記的編碼序列，所述合適 標記的編碼序列可操作地連接至轉錄終止子。此類構建體在促進選自下述的物種中的轉 化細胞生產中是有效的：紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、擲孢酵母屬、紅酵母屬、Pseudozyma 或黑粉菌屬。在一個實施方案中，合適標記是賦予抗生素抗性的蛋白質。在另一個實施方案 中，合適標記是賦予除草劑抗性的蛋白質。在一個實施方案中，實現這種功能的標記的編碼 序列是天然存在或人工制備且含有至少約60%GC的編碼序列。在第二個實施方案中，實現 這種功能的標記的編碼序列是天然存在或人工制備且含有約63%GC的編碼序列。在第三個 實施方案中，實現這種功能的標記的編碼序列是天然存在或人工制備且含有約70%GC的編 碼序列。在一個實施方案中，此類編碼序列的至少約70%密碼子三聯體以C或G結束。在 另一個實施方案中，此類編碼序列的超過約80%密碼子三聯體以C或G結束。在一個實施 方案中，此類編碼序列在至少約40%的總絲氨酸（Ser)殘基中包含UCG密碼子。在一個實 施方案中，關于藥物抗性的編碼序列包含SEQ ID NO:6中所不的核苷酸序列。在另一個實 施方案中，關于藥物抗性的編碼序列包含SEQ ID NO:7中所示的核苷酸序列。在另外的實 施方案中，關于藥物抗性的編碼序列包含SEQ ID NO:8中所不的核苷酸序列。在一個實施 方案中，可以使用在真菌物種中可操作的任何轉錄終止子。
[0019] 在第三個方面，本發明提供了基于對物種顯性選擇的轉化方法，所述物種選自 柄銹菌亞門和黑粉菌亞門，特別是紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、黑粉菌屬、紅酵母屬、 Pseudozyma或擲孢酵母屬（鎖擲酵母屬）中的物種。在一個實施方案中，轉化方法是根瘤 土壤桿菌介導的轉化（ATMT)。在另一個實施方案中，轉化方法是電穿孔。在另外的實施方 案中，轉化方法是轉染。在進一步的實施方案中，轉化方法是生物射彈（biolistic)。
[0020] 根據ATMT實施方案，該方法包括下述步驟：（a)制備含有下述的合成DNA構建 體：可操作地連接至（ii)關于可選擇標記的編碼序列的（i)衍生自曲霉菌屬、紅冬孢酵母 屬、擲孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、紅酵母屬、Pseudozyma或黑粉菌屬的啟動子,所述可選擇標 記的編碼序列可操作地連接至（iii)可操作地連接的轉錄終止子；(b)將DNA構建體插入 T-DNA二元載體內；（c)將所得到的T-DNA載體引入土壤桿菌屬菌株內；（d)優選在土壤桿 菌屬毒力誘導物例如乙酰丁香酮（acetosynringone)(AS)的存在下，使土壤桿菌屬細胞與 真菌細胞一起在固體培養基上或放在固體培養基之上的膜上共培養，以轉化真菌細胞；（e) 在固體培養基上或放在固體培養基之上的膜上直接選擇經轉化的菌落。選擇培養基可以進 一步補充有以完全抑制土壤桿菌屬和未經轉化的真菌細胞生長的濃度的物質。在一個實施 方案中，啟動子是本文描述的啟動子。在另一個實施方案中，可選擇標記的編碼序列是本文 描述的編碼序列。在一個實施方案中，選擇培養基或共培養培養基含有至少約1.5%瓊脂。 在另一個實施方案中，選擇培養基或共培養培養基含有約2%-約3%瓊脂。
[0021] 在第四個方面，本發明提供了用于真菌中的基因靶向的改良方法。特別地，哺乳動 物DNA依賴性蛋白激酶（DNA-PK)抑制劑可以大量補充至用于轉化的培養基。在一個實施方 案中，DNA-PK抑制劑是NU7026(2-(嗎啉-4-基）-苯并[h]色-4-酮；2-(4-嗎啉基）-4H-萘 酚[l，2-b]吡喃-4-酮）。在另一個實施方案中，培養基中的NU7026量為約0. ΙμΜ-約 50 μ Μ。在另外的實施方案中，DNA-PK抑制劑可以與任何轉化方案一起使用，所述轉化方案 例如ATMT、電穿孔、轉染、生物射彈等。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1A-1D顯示轉化載體的圖示。圖1A :pEX2 ;Pgpd指玉米黑粉菌（Ustilago maydis)的gpd啟動子。圖IB :pEC3。圖1C :pEC3PxxxhptR ;Pxxx指示位于P盒中的多種 啟動子。圖ID :pEX3GPDA-EGFP。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和右邊界。T35S :花椰菜 花葉35S基因終止子；Tnos :根瘤土壤桿菌胭脂堿合酶轉錄終止子；egfp :增強型綠色熒光 蛋白基因。
[0023] 圖2A-2D顯示可選擇標記對圓紅冬孢酵母的ATMT的作用。對于玉米黑粉菌和圓 紅冬孢酵母，關于轉化體的選擇用100 μ g/ml潮霉素 B執行。圖2A :與AGL1共培養的圓紅 冬孢酵母。圖2B :與AGL1 (pEX2)共培養的圓紅冬孢酵母。圖2C :推定轉化體的菌落PCR。 圖2D :使用nat作為選擇標記的推定轉化體的菌落PCR。
[0024] 圖3A和3B顯示在潮霉素抗性菌落中的GFP表達。圖3A :針對100 μ g/ml潮霉素 B選擇8天的菌落；圖3B :針對200 μ g/ml潮霉素 B選擇8天的菌落。
[0025] 圖4 :顯示在多種共培養培養基pH下獲得的圓紅冬孢酵母轉化體的DNA印跡。WT ; 野生型圓紅冬孢酵母。印跡針對hpt-3進行探測。
[0026] 圖5顯示甘鹿鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum)轉化體的DNA印跡分析。基 因組DNA用BamHI消化且用[32P]_標記的hpt DNA片段探測。泳道1-18是來自推定轉化 體的DNA。泳道19是甘蔗鞭黑粉菌野生型DNA。分子標記在左側上指示。
[0027] 圖6顯示具有不同啟動子的粘紅酵母轉化體的DNA印跡。PgpdUm、PgpdA Kt、PgpdAAn 和PtefAg分別指來自玉米黑粉菌、圓紅冬孢酵母、構巢曲霉和棉蚜的gpd啟動子。印跡針對 hpt-3進行探測。
[0028] 圖7顯示DNA-PK抑制劑的結構是NU7026 (2-(嗎啉-4-基）-苯并[h]色-4-酮； 2-(4-嗎啉基）-4H-萘酚[1，2-b]批喃-4-酮）。

【具體實施方式】
[0029] 除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語都具有與本發明所屬領域技 術人員通常理解相同的含義。
[0030] 如本文使用的術語"有效選擇"意指使用任何真菌分離物在90mm培養皿中的至少 兩個真正轉化體的直接選擇。
[0031] 如本文使用的術語"強表達"意指標記蛋白質或mRNA表達至使用已知檢測方法可 檢測的水平，所述已知檢測方法例如GFP的熒光、GUS和lacZ基因的活性測定法。
[0032] 本發明涉及使轉化細胞能夠高度有效生產的合成構建體和轉化方法，所述轉化細 胞選自柄銹菌亞門和黑粉菌亞門中的物種。特別相關的物種是紅冬孢酵母屬、擲孢酵母 屬、孢堆黑粉菌屬、紅酵母屬、Pseudozyma和黑粉菌屬中的那些，在其中存在具有用于將可 再生資源生物轉化成高價值產品的極大潛力的許多物種，所述高價值產品例如甘油三酯、 生物柴油、脂肪醇、內酯、萜類和維生素和生物表面活性劑。此類菌株的例子包括但不限于 圓紅冬抱酵母、Rhodosporidium azoricum、Rhodosporidium babjevae、Rhodosporidium concentricum、雙倒卵形紅冬抱酵母（Rhodosporidium diobovatum)、Rhodosporidium fluvial> Rhodosporidium kratochvilovae、Rhodosporidium lusitaniae、海洋紅酵母 (Rhodosporidium paludigenum)、球紅冬抱酵母（Rhodosporidium sphaerocarpum)、圓 紅冬抱酵母、玫紅擲抱酵母（Sporobolomyces roseus)、Sporobolomyces carnicolor、 Sporobolomyces salmoneus、Sporisorium scitamineum、玉米黑粉菌、Pseudozyma Antarctica、Pseudozyma aphidis。
[0033] 在一個方面，本發明提供了包含可操作地連接至關于可選擇標記的編碼序列的啟 動子的多核苷酸構建體，所述關于可選擇標記的編碼序列可操作地連接轉錄終止子。啟動 子衍生自選自下述的真菌物種：黑粉菌屬的物種、曲霉菌屬的物種和紅冬孢酵母屬的物種， 并且提供編碼序列在柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的經轉化的真菌細胞中的強表達。多核苷酸 構建體提供了柄銹菌亞門和黑粉菌亞門的經轉化的真菌細胞的有效選擇。多核苷酸構建體 特別用于有效選擇紅冬孢酵母屬、孢堆黑粉菌屬、黑粉菌屬、紅酵母屬、Pseudozyma和擲孢 酵母屬（鎖擲酵母屬）的經轉化的真菌細胞。
[0034] 在一個實施方案中，啟動子衍生自編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶（gpd)的基因或編碼 蛋白質翻譯延伸因子（tef)的基因。
[0035] 在一個實施方案中，啟動子包含SEQ ID NO: 1中所示的核苷酸序列。在另一個實 施方案中，啟動子包含SEQ ID N0:2中所示的核苷酸序列。在另外的實施方案中，啟動子包 含SEQ ID N0:3中所示的核苷酸序列。在進一步的實施方案中，啟動子包含SEQ ID N0:4中 所示的核苷酸序列。在另一個實施方案中，啟動子是SEQ ID N0:5中所示的棉姆的tef啟 動子。在另外的實施方案中，啟動子包含SEQ ID N0:51中所示的核苷酸序列。在進一步的 實施方案中，啟動子包含SEQ ID N0:55中所示的核苷酸序列。在另一個實施方案中，啟動 子是粘紅酵母的硬脂酰-CoA δ 9-去飽和酶啟動子，并且包含SEQ ID N0:56中所示的核苷 酸序列。使用本文描述的用于鑒定此類啟動子的技術，可以從曲霉菌屬、紅冬孢酵母屬、紅 酵母屬、擲孢酵母屬和黑粉菌屬中的其他物種中鑒定另外的強啟動子。此外，使用常規啟動 子篩選測定法可以分離這些啟動子的可操作片段，并且使用本文描述的技術可以篩選經轉 化的真菌細胞的有效選擇。
[0036] DNA操作領域技術人員眾所周知的技術，核酸雜交可以用于鑒定其他合適的多核 苷酸。依照本發明，使用的其他合適啟動子可以通過鑒定多核苷酸而獲得，所述多核苷酸通 過在低嚴格條件、中等嚴格條件或高嚴格條件下雜交與上文描述的啟動子選擇性雜交。選 擇性雜交序列一般彼此具有至少50%序列相同性，優選至少70%、80%或90%序列相同性，并 且最優選95%、98%或99%序列相同性。
[0037] 使用本領域技術人員眾所周知的算法或計算機程序和這些技術，基因組和核苷酸 數據庫的數據庫搜索和同源性搜索基于核苷酸的比對鑒定相似的DNA或RNA分子。依照本 發明，使用的其他合適多核苷酸可以通過調節序列的多核苷酸的計算機芯片鑒定而獲得， 所述調節序列彼此具有至少50%序列相同性，優選至少70%、80%或90%序列相同性，并且最 優選95%、98%或99%序列相同性。
[0038] 在一個實施方案中，啟動子包含（i)與SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少50% 相同性的核苷酸序列，（ii)與SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷酸序 列，（iii)與SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)與SEQ ID NO: 2的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)與SEQ ID NO: 2的核苷酸序列 具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)與SEQ ID NO: 2的核苷酸序列具有至少95%相同 性的核苷酸序列，和（vii)與SEQ ID N0:2的核苷酸序列具有至少98%相同性的核苷酸序 列。
[0039] 在另一個實施方案中，啟動子包含（i)與SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少 50%相同性的核苷酸序列，（ii)與SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷 酸序列，（iii)與SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)與 SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)與SEQ ID N0:51的核 苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)與SEQ ID NO: 51的核苷酸序列具有至 少95%相同性的核苷酸序列，和（vii)與SEQ ID N0:51的核苷酸序列具有至少98%相同性 的核苷酸序列。
[0040] 在進一步的實施方案中，啟動子包含⑴與SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少 50%相同性的核苷酸序列，（ii)與SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷 酸序列，（iii)與SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)與 SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)與SEQ ID N0:55的核 苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)與SEQ ID NO: 55的核苷酸序列具有至 少95%相同性的核苷酸序列，和（vii)與SEQ ID N0:55的核苷酸序列具有至少98%相同性 的核苷酸序列。
[0041] 在另一個實施方案中，啟動子包含（i)與SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少 50%相同性的核苷酸序列，（ii)與SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少60%相同性的核苷 酸序列，（iii)與SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少70%相同性的核苷酸序列，（iv)與 SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少80%相同性的核苷酸序列，（v)與SEQ ID N0:56的核 苷酸序列具有至少90%相同性的核苷酸序列，（vi)與SEQ ID NO: 56的核苷酸序列具有至 少95%相同性的核苷酸序列，和（vii)與SEQ ID N0:56的核苷酸序列具有至少98%相同性 的核苷酸序列。
[0042] 關于可選擇標記的編碼序列編碼可選。可選擇標記編碼序列用于選擇經轉化的細 胞或組織。通常，可選擇標記編碼序列將編碼抗生素抗性，其中合適的編碼序列包括下述中 的至少一組：編碼針對抗生素壯觀霉素的抗性的編碼序列、針對zeomycin的抗性的編碼序 列、編碼鏈霉素抗性的鏈霉素磷酸轉移酶（spt)基因、編碼卡那霉素或遺傳霉素抗性的新 霉素磷酸轉移酶（nptll)基因、編碼針對潮霉素的抗性的潮霉素磷酸轉移酶（hpt或aphiv) 基因、編碼針對諾爾絲菌素的抗性的乙酰乳酸合酶（als)基因或諾爾絲菌素乙酰轉移酶基 因。可替代地，植物可選擇標記編碼序列將編碼除草劑抗性例如針對磺酰脲型除草劑、草 銨膦、草甘膦、銨、溴苯腈、咪唑啉酮和2, 4-二氯苯氧乙酸鹽（2, 4-D)的抗性，包括編碼針對 作用于抑制谷氨酰胺合酶作用的除草劑例如草胺膦或basta的抗性的基因（例如bar基 因）。一般參見國際
【發明者】L·H·紀, Y·B·劉, C·M·J·許, L·H·孫 申請人:淡馬錫生命科學研究院有限公司