專利名稱：利用生物質制備乙醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種在以生物質作為原料利用同步糖化發酵制備乙醇的方法中，通過原料的混合使用降低發酵用微生物的初期使用量的技術。
背景技術：
近年來，作為化石燃料的替代品，被認為有助于抑制溫室氣體產生的生物燃料受到矚目。其中，生物乙醇在碳平衡的思想下，以巴西、美國等為代表，其在世界上的生產量不斷增加。另一方面，來自食物的生物乙醇，因其在原料生產時使用很多能量，因此在能否降低溫室氣體、與糧食的競爭導致糧食價格的上漲問題、伴隨新開墾農用地帶來的環境進一步惡化等方面令人擔心，作為不與糧食競爭的已有生物質的應用，林中殘木或農作物的不可食部分、稻桿等農業殘渣之類的纖維素類生物質的應用被人們寄予希望。這種纖維素類生物質，全纖維素占到該有機物組成的一半以上，因其結構單元為單糖，因此人們正在研究將其分解并進行能量轉換。對這種纖維素類生物質，人們嘗試使用酸或堿的化學處理、施加熱或壓力的物理處理或基于酶的水解，此外，也在研究同時使用這些方法。特別地，對環境負荷小，幾乎沒有副產物生成的酶糖化法是有效的方法之一。在進行纖維素類生物質的酶糖化，作為乙醇制備原料的情況下，大致分為在糖化后發酵糖化液的糖化后發酵方法，以及同時進行糖化和發酵的同步糖化發酵(simultaneous saccharification and fermentation,以下稱為 SSF)的兩種方法。選擇糖化后發酵的情況下，如果想要在乙醇發酵后進行蒸餾，則要考慮蒸餾時的能量損失，可考慮制備來自高濃度原料的糖化液或者濃縮來自低濃度原料的糖化液兩種方法。前者通過酶的競爭性抑制(生成物抑制)導致酶活性慢慢降低，而后者在糖液的濃縮上需要很多能量。作為能夠解決對于這種高濃度原料的問題的方法，近年來特別是SSF作為有效的方法之一被人們所認識。SSF反應除原料以外，至少還需要發酵用微生物和水解酶，通過其量的平衡能夠實現有效反應。以纖維素類生物質作為原料進行SSF反應時，添加作為水解纖維素的酶的纖維素酶，作為發酵用微生物使用酵母或發酵單胞菌屬菌等，由水解得到的糖轉換為乙醇。目前，纖維素酶的價格高，需要降低成本，但另一方面，酵母等微生物在反應中也需要很多的量。例如，在非專利文獻I中，在IOOml的SSF反應中，將8g的玉米秸桿用作原料，添加各種營養鹽后，使用Ig干酵母進行反應，最大可以得到27.8g/l的乙醇濃度，但為了生產此時使用的Ig干酵母，通常置于托盤的酵母培養液至少需要25ml左右以上，且必須進行SSF反應的至少1/4以上規模的預培養。另一方面，在非專利文獻2中有每單位干重使用0.5g/l的酵母的報道。此外，在專利文獻I中所研究的SSF (并行復發酵)開始時的酵母使用量為配制成0D600nm=2的濁度，可認為其使用量為0.5^2g/l左右。若至少生成因競爭性抑制導致活性降低程度的糖，則SSF反應的優勢會被抑制，因此，為了維持作為所使用的酶活性的水解能力，可認為SSF反應時所需要的酵母量需要添加得多一些。在基于目前已工業化的分批發酵進行的乙醇發酵反應中，每單位反應容量、每單位時間所生成的乙醇量為1.3 1.5g/l/h (非專利文獻3)，兩天后可以制備60-70g/l的乙醇，但這種情況需要容量為發酵槽的數分之一的預培養槽，并且預培養需要大量的培養基和營養成分。現有技術文獻專利文獻專利文獻1:日本特開2011-004730號公報非專利文獻非專利文獻1:Fuel Processing Technology(染料加工技術),第90卷,第10期，2009 年 10 月，第 1193-1197 頁。非專利文獻2:Bioresource Technology (生物資源技術),第101卷,第9期,2010年5月，第3126-3131頁。非專利文獻3:乙醇手冊第9版(1997)、發酵手冊200
發明內容
通過SSF反應，在使用纖維素類生物質制備乙醇中，酵母的使用量成為高成本的原因，但減少使用量則無法實現穩定的反應，也會引起酶的使用量增加。在實際研究中的酵母使用量，需要以SSF反應槽的數分之一的容量進行預培養，在預培養成本及設備負擔方面成為問題，甚至很可能成為普及利用發酵制備生物乙醇的阻礙。本發明是鑒于上述情況而完成的，其目的在于提供一種乙醇的制備方法，該方法能夠減少發酵用微生物的初期使用量，并且能夠實現穩定的反應。本發明人進行了深入研究，結果發現通過將纖維素類生物質與有機性廢棄物一起進行同步糖化發酵反應，可以解決上述技術問題，從而完成本發明。即，本發明涉及:(I) 一種制備乙醇的方法，其將纖維素類生物質用水解酶和作為發酵微生物的酵母，通過同時反應的同步糖化發酵反應制備乙醇，其特征在于，將該纖維素類生物質與有機性廢棄物一起進行同步糖化發酵反應，所述有機性廢棄物由廚房垃圾、食品廢棄物、農產廢棄物、畜產廢棄物、下水污泥、有機性污泥中的一種以上構成；每個反應槽的酵母初期添加量以干重計為0.125 0.0025g/kg。(2)根據上述(I)所述的方法，其特征在于，同步糖化發酵反應時的所述纖維素類生物質的濃度為總反應量的10 25%。本發明將纖維素類生物質與有機性廢棄物一起進行同步糖化發酵反應，所述有機性廢棄物由廚房垃圾、食品廢棄物、農產廢棄物、畜產廢棄物、下水污泥、有機性污泥中的一種以上構成，每個反應槽的酵母初期添加量以干重計為0.125^0.0025g/kg。如此，本發明能夠減少發酵用微生物的初期使用量，而且能夠實現穩定的反應。
圖1是表示比較例I的結果的圖表。圖2是表示實施例1的結果的圖表。圖3是表示在實施例2中，通過SSF反應得到的乙醇濃度的結果的圖表。圖4是表示實施例2中，反應中的CFU的推移的圖表。圖5是表示根據本發明得到的效果的圖表。
具體實施例方式
下面，對本發明進行詳細的說明。本發明中的纖維素類生物質，只要其生物質的構成成分中全纖維素含量占據主要，則沒有特別限定，例如，廢材、鋸末、修剪下的樹枝、紙、紙屑、造紙漿、藻類、草本類、棉類、布類等，或它們的混合物。此外，與纖維素類生物質一起作為同步糖化發酵原料的有機性廢棄物，只要是不與食物競爭，且含有酵母增殖所必需的成分，則沒有特別限定，例如，可以由廚房垃圾、食品廢棄物、農產廢棄物、畜產廢棄物、下水污泥、有機性污泥中的一種以上構成。有機性廢棄物與纖維素類生物質的比例，以干重比計，優選為10飛0%。用于進行SSF反應時的水解酶，由于以纖維素類生物質作為原料，因而纖維素酶是必須為，并且，還可以添加木聚糖酶、半乳糖苷酶、甘露糖苷酶等其他糖鏈的水解酶。此夕卜，通過添加至少一種以上淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等水解酶作為水解一起用作原料的廚房垃圾、食品廢棄物、農產廢棄 物、畜產廢棄物、下水污泥、有機性污泥的酶，能夠促進反應的進行。這些原料在用于SSF反應之前，為了更好地進行反應，也可以實施預處理。作為這些預處理，有細化、破碎、加壓、加熱、藥劑處理、pH調節、濃度調整、脫水、加水、腐化、混合等，或它們的復合處理，但沒有特別限定。本發明中，關于將混合的生物質用作原料的情況下的SSF反應所需要的酵母量，可以在每單位反應量的酵母干重為0.125g/kg以下進行反應，可以在0.0025g/kg以上的量進行反應。將其換算成濁度，在用約0D600nm測量的情況下，雖然根據所使用的酵母不同而不同，但最大為0.1以下。用于通常分批發酵的菌體量為數g/1，鑒于研究報告進行的SSF反應所使用的酵母量的下限為0.5g/kg左右，酵母的使用量為從數分之一到數百分之一的使用量。進行SSF反應時的原料濃度雖然沒有特別限定，但因為以生物質作為原料，因此不能從原料100%轉換成乙醇，考慮到抑制后續階段的蒸餾中的能量損失，纖維素類生物質的濃度為總反應量的1(T25%的濃度，即優選含水率為75、0%。通過抑制由酶帶來的競爭性抑制來維持酶活性從而降低酶的成本是SSF反應的最大優點，但考慮到即使延長反應時間也能夠降低酶的成本，且延長酵母的增殖時間才更有可能實現穩定的SSF反應，因而，雖然SSF反應時間沒有特別限定，但優選進行2天以上。用于通常分批發酵的酵母菌體量至少為數g/1，鑒于研究報告進行的SSF反應所使用的酵母量的下限為0.5g/kg左右，則本發明的每單位反應量的酵母干重為0.125g/kg以下這一使用量為酵母培養基成本的數分之一到數百分之一以下。
通常來說，酵母從平皿培養經燒瓶培養，以每次約10倍的規模(scale)進行預培養。因此，通過本發明可以實現省略最大的預培養設備，減少冷藏保存時的保存地點及保存設施。此時，通過添加作為本發明要素的纖維素類生物質和與之一起反應的有機性廢棄物的混合原料、酵母及酶而開始SSF反應，由于減少了酵母的添加量，從反應剛開始起，主要使用來自有機性廢棄物的營養鹽和由酶水解得到的結構糖，引發增殖直至對SSF反應充分的量，因此可以降低酵母量。因此，雖然由于增殖所需要的能量，即原本應轉換成乙醇的糖類被消耗，導致乙醇的生成量降低，但作為實際的效果確認是增加的。僅將不適于增殖的條件下的纖維素類生物質用作原料時，如果初期不使用大量酵母引發SSF反應，則由于酶的競爭性抑制SSF反應的進行受到抑制，為了在SSF反應期間維持該程度的大量存在的酵母，將消耗卡路里，因而不會轉換成乙醇。如此，在本發明中所減少的酵母使用量還具有回收由過量菌體消耗的能量的效果。圖5用圖表中的網狀部分表示了這種回收的能量。此外，在SSF反應后殘 存有很多的酵母，因此在再利用反應液時，可以減少或省略酵母的再次添加量。下面，通過實施例更具體地說明本發明。實施例比較例I用手進行分類，從普通的廢棄物中挑選出紙類，進行制漿(離解)處理。用過濾網除去得到的漿中的異物后，用螺旋壓榨機脫水，將脫水后的紙漿作為纖維素類生物質。得到的紙漿的全纖維素含量約為85%。將制得的紙漿配制成10%重量濃度的漿料后，使水解酶和酵母同時作用，進行同步糖化發酵反應。水解酶使用杰能科公司生產的Axel race，酵母使用量在0.125^2.5g-干/kg-反應量的范圍內，在38°C下進行SSF反應。取樣后，在沸水中進行失活處理，通過生物傳感器(王子測量機生產的BF-5)對離心后的上清液分析乙醇濃度。其結果示于圖1中。僅將紙漿用作原料的情況下，依賴于酵母使用量的乙醇生成量增加，為了穩定及有效進行SSF反應大約需要Ig-干/kg左右以上的酵母使用量。實施例1從一般廢棄物中用手進行分類，細分出廚房垃圾，然后再用攪拌機將細分出的廚房垃圾與所述紙漿混合，進行SSF反應。將紙漿及廚房垃圾分別以15%及10%的重量比進行混合，將其用作混合原料，使水解酶和酵母同時作用，在38°C下進行同步糖化發酵反應。水解酶使用杰能科公司生產的Axel race和諾維信公司制造的Spirizyme,酵母的使用量在0.0025^2.5g-干/kg-反應量的范圍。取樣后，在沸水中進行處理，通過生物傳感器(王子測量機生產的BF-5)對離心后的上清液分析乙醇濃度。其結果示于圖2中。與比較例I所示的只有紙漿的原料下所需要的酵母使用量Ig-干/kg相比，即使使用量為其百分之一，反應也在進行，并且結果為酵母的使用量少的
一方得到乙醇量多。因此，通過在纖維素類生物質的紙類中混合廚房垃圾得到的混合原料的SSF反應，能夠減少酵母的使用量，且能夠確認其減少率最大為數百分之一以下。
此外，通過以減少了的酵母使用量進行反應，還表現出乙醇的生成量增加。實施例2對下列四組情況在與實施例1相同的條件下進行SSF反應，即，在只有紙漿的原料中使用充分的酵母量(1.25g/kg)的情況；在只有紙漿的原料中使用少量的酵母使用量(0.025g/kg)的情況；在含有十分之一廚房垃圾的混合原料中使用充分的酵母使用量(0.025g/kg)的情況；以及，在含有十分之二廚房垃圾的混合原料中使用充分的酵母使用量(0.025g/kg)的情況。取樣后，在沸水中進行處理，通過生物傳感器(王子測量機生產的BF-5)對離心后的上清液分析乙醇濃度。此外，另行取樣，稀釋成IO2IO4后接種到YPD (2%葡萄糖)平皿上，在30°C下培養后，通過計數酵母菌落數量，調查CFU (菌落形成單位)。將通過SSF反應得到的乙醇濃度的結果示于圖3中，反應中的CFU的推移示于圖4中。在僅以紙漿作為原料的情況下，與使用了充分的酵母量(1.25g/kg)的SSF反應相t匕，在只使用了 1/50的少量酵母使用量(0.025g/kg)的SSF反應中，乙醇的生成量明顯減少。另一方面，在使用混合了十分之一或十分之二廚房垃圾的原料的SSF反應中，雖然I天后的乙醇量稍少，但在2天以后生成了與僅用紙漿且添加50倍酵母的情況相同的乙醇量。對于CFU的結果，在僅以紙漿作為原料的情況下，當添加充分的酵母量時只是在減少；但在1/50量的條件下，在I天以后一直在增殖。但是，其增殖量與使用等量酵母的廚房垃圾混合原料相比少。
在SSF反應中，隨著乙醇的含量增多，對酵母的刺激將增加，并且，由于反應中酶活性的降低和基質的減少，每單位時間水解所生成的糖量減少。因此，隨著反應時間的推移，酵母的可繁殖數降低，但在圖4中，可以確認在混合原料中維持著活菌數。
權利要求
1.一種制備乙醇的方法，其將纖維素類生物質利用水解酶和作為發酵微生物的酵母，通過同時反應的同步糖化發酵反應制備乙醇，其特征在于， 將該纖維素類生物質與有機性廢棄物一起進行同步糖化發酵反應，所述有機性廢棄物由廚房垃圾、食品廢棄物、農產廢棄物、畜產廢棄物、下水污泥、有機性污泥中的一種以上構成； 每個反應槽的酵母初期添加量以干重計為0.125 0.0025g/kg。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，同步糖化發酵反應時的所述纖維素類生物質的濃度為總反應量 的10 25%。
全文摘要
本發明提供一種乙醇制備方法，其能夠減少發酵用微生物的初期使用量，且能夠實現穩定的反應。本發明提供一種制備乙醇的方法，其將纖維素類生物質利用水解酶和作為發酵微生物的酵母，通過同時反應的同步糖化發酵反應制備乙醇，其特征在于，將該纖維素類生物質與有機性廢棄物一起進行同步糖化發酵反應，所述有機性廢棄物由廚房垃圾、食品廢棄物、農產廢棄物、畜產廢棄物、下水污泥、有機性污泥中的一種以上構成；每個反應槽的酵母初期添加量為0.125~0.0025g/kg。
文檔編號C12P19/14GK103205467SQ201310011260
公開日2013年7月17日 申請日期2013年1月11日 優先權日2012年1月13日
發明者林俊介, 增成伸介, 吉良典子 申請人:日立造船株式會社