專利名稱：一對用于篩選小麥赤霉病抗性的引物序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一對用于篩選小麥赤霉病抗性的引物序列及其應用
背景技術：
由禾谷鐮刀菌引起的小麥赤霉病是中國長江中下游麥區和東北春麥區小麥的重要病害，近年來向黃淮麥區迅速擴展。多雨的年份，小麥赤霉病的流行和大發生可導致小麥嚴重減產，同時被病菌感染的麥粒內會產生對人畜有害的毒素，食用后可使人畜嘔吐和中毒。化學藥劑雖然能防治小麥赤霉病，但對嚴重感病的品種來說采用藥劑防治的效果也不如人意，而且農藥防治還存在成本加大和環境污染的問題，因此培育抗病品種是控制此病的根本措施。小麥赤霉病抗性鑒定過程易受環境影響，且費時費力。分子標記輔助選擇可在DNA水平針對抗赤霉病的基因或QTL對育種材料進行選擇，因而可以克服赤霉病表型鑒定的不穩定性，降低表型評價的成本，提高抗病育種效率。為了獲得與小麥赤霉病抗性連鎖的分子標記，人們進行了大量研究，最早在抗赤霉病品種蘇麥3號及其衍生系中獲得了一個位于3B染色體短臂的主效QTL，可解釋表型變異的24% - 46%，后來在望水白、寧894037等抗性品種中也在同一染色體區段定位到了主效QTL。與此QTL連鎖且位于兩側的分子標記為SSR標記Xgwm493和Xgwm533,但是SSR標記距離抗性QTL遺傳距離較大,且在已知的抗病材料如蘇麥3號與望水白等品種中存在多態性位點不一致等問題，難以用于標記輔助選擇育種，因此有必要開發與抗性基因更近且在抗病品種中多態性位點一致的分子標記。Liu等(2008)報道在該小麥3BS赤霉病抗性QTL區域發現了 7個抗赤霉病候選基因，并根據其中的第2個基因序列設計引物，開發了一個與赤霉病抗性QTL緊密連鎖的分子標記UMNlO。該標記上游引物為CGTGGTTCCACGTCTTCTTA，下游引物為TGAAGTTCATGCCACGCATA。 引物經PCR擴增后，抗性品種擴增得到239bp的基因片段，而感病品種擴增得到236bp的基因片段，兩者只存在3個核苷酸堿基大小的差異，因此必須通過ABI DNA序列分析儀進行的毛細管電泳分析來區分赤霉病抗感品種。杜軍凱等(2010)報道針對該標記，利用特定的DNA單鏈構象多態性(SSCP)技術,也可以檢測到該標記。但是該項技術要求使用12%非變性聚丙烯凝膠進行電泳,凝膠體積為320mm*30mm*0.4mm,電泳功率為80W。而目前我國從事小麥育種的實驗室，對PCR擴增產物的檢測多以普通瓊脂糖凝膠電泳為主，所以利用分子標記UMNlO的引物無法在抗感品種間獲得多態性，也無法對抗感品種進行檢測分析。為了能使該抗性QTL在我國小麥育種得到可靠應用，我們將該標記的擴增產物進行了 DNA測序，根據抗感品種之間存在的單核苷酸位點差異，將其轉化為一般的實驗室可操作、利用瓊脂糖凝膠電泳即可分辨的SNAP引物，并將其應用于小麥的抗赤霉病分子標記輔助育種中，有效提高小麥雜交育種早世代赤霉病抗性選擇的有效性
發明內容
本發明的目的在于提供一對用于篩選小麥赤霉病抗性的弓I物序列及其應用。本發明的目的是這樣實現的:一對用于篩選小麥赤霉病抗性的引物序列，其特征在于，所述的一對特異性引物序列為:上游引物SEQ ID N0.1和下游引物SEQ ID N0.2。一種上述引物序列的應用，其特征在于，以SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2為引物，以待測小麥基因組DNA為模板進行PCR擴增，再對擴增產物在瓊脂糖凝膠中電泳分離檢測，若擴增產物中含有236bp左右大小的條帶，則待測小麥品種有赤霉病抗性，為抗病品種，否則待測小麥品種無赤霉病抗性，為感病品種。 在上述的引物序列的應用中:
PCR擴增的反應體系為:20-100ng的待測小麥基因組DNA, 5U/ μ L的Taq BI 0.25 μ L，4 μ mol/L 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 各 I μ L, IOmmoI/L 的 dNTP 0.5 μ L, 10XPCR 的Mg2+ Plus緩沖液2.5 μ L，余量為無菌蒸餾水；
PCR擴增的反應條件為:95°C預變性5min，隨后94°C變性30sec，58°C條件下退火30sec, 72°C延伸30sec，進行35個循環；最后72°C延伸IOmin;在4°C下保存。在上述的引物序列的應用中:
對擴增產物在瓊脂糖凝膠中電泳分離檢測的是指:將擴增產物在0.8% - 2%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色，判斷擴增產物中是否含有236bp的條帶。本發明的優點在于:通過SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2對小麥基因組DNA進行PCR擴增，對擴增產物通過瓊脂糖電泳進行標記的檢測，不需要利用測序儀或者非變性凝膠電泳來進行檢測，操作簡單；以能否擴增出236bp大小條帶來判定小麥材料是否含有該赤霉病抗性基因，非常直觀，不需要通過測序或者比較條帶的大小。
圖1:利用瓊脂糖電泳檢測引物UMNlO對赤霉病抗感品種的擴增結果。圖2:利用SSCP方法檢測引物UMNlO對赤霉病抗感品種的擴增結果。圖3:利用瓊脂糖電泳檢測引物SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2對赤霉病抗感品種的擴增結果。圖1和圖3中:M:分子量標準DL2000 ;圖廣圖3中:1_7泳道依次為小麥品種蘇麥3號、望水白、Alondra、安農8455、綿陽28、寧麥9號、阿夫。
具體實施例方式實施例1:
UMNlO引物[已知引物，委托生工生物工程(上海)有限公司合成]:
上游引物:5 ’ -CGTGGTTCCACGTCTTCTTA-3，，
下游引物:5’ -TGAAGTTCATGCCACGCATA-3’。小麥品種:蘇麥3號、望水白、Alondra、安農8455、綿陽28、寧麥9號、阿夫。檢測方法:
以UMNlO為引物，以待測小麥基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系為:DNA20-100ng, Taq 酶(5U/y L) 0.25 μ L,上下游引物(4 μ mol/L)各 I μ L，dNTP (IOmmoI/L)
0.5 μ L，10 X PCR緩沖液(Mg2+ Plus) 2.5 μ L，然后用無菌蒸餾水補充反應體系至25 μ L ;將反應體系在95°C預變性5mi，隨后94°C變性30sec，58°C條件下退火30sec，72°C延伸30sec，進行35個循環；最后72°C延伸IOmin;在4°C下保存。將擴增產物在0.8% - 2%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色，獲得的檢測結果如圖1。由圖1可見，所有待測小麥品種的擴增產物中都含有一條擴增條帶，條帶大小相近，無法分清是239bp還是236bp，PCR鑒定結果無法確認上述小麥品種的抗性指標，必須通過毛細管電泳方式，或者是SSCP檢測方式(結果見圖2)，或者是傳統的田間抗性鑒定的方式進行進一步的分析。實施例2
引物[委托生工生物工程(上海)有限公司合成]:
上游引物SEQ ID N0.1
5’ - GTTCCACGTCTTCTTACATAATCCC -3’，
下游引物SEQ ID N0.2:
5’ - TGAAGTTCATGCCACGCATA -3’。小麥品種:蘇麥3號、望水白、Alondra、安農8455、綿陽28、寧麥9號、阿夫。檢測方法:
以UMNlO SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2為引物，以待測小麥基因組DNA為模板進行進行PCR 擴增，PCR 反應體系為:DNA 20_100ng，Taq 酶(5U/y L) 0.25 μ L，上下游引物(4μ mol/L) # IyL, dNTP (I Ommo I/L) 0.5 μ L，10XPCR 緩沖液(Mg2+ Plus) 2.5 μ L，然后用無菌蒸懼水補充反應體系至25 μ L ;將反應體系在95°C預變性5mi，隨后94°C變性30sec，58°C條件下退火30sec，72°C延伸30sec，進行35個循環；最后72°C延伸IOmin;在4°C下保存。將擴增產物在0.8% - 2%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色，獲得的檢測結果如圖2。由圖2可見，擴增產物中含有236bp大小條帶的有蘇麥3號、望水白、寧麥9號，證明其含有該赤霉病抗性基因，為抗病品種；而Alondra、安農8455、綿陽28和阿夫沒有擴增出條帶，證明其不含有該赤霉病抗性基因，為感病品種。進一步利用傳統的田間抗性鑒定方法進行驗證，各小麥品種于揚花期接種相同數量的病原菌孢子液，于接種后21天調查各小麥品種的病小穗率。抗病性鑒定結果表明，上述抗病品種蘇麥3號、望水白、寧麥9號的病小穗率分別為5.7%、5.4%和6.8%，證明其確實高抗赤霉病；而上述感病品種Alondra、安農8455、綿陽28和阿夫的病小穗率分別為24.9%、17.7%,27.7%和26.0%，證明其確實不抗赤霉病，為感病品種。通過對圖1和圖2的比對，我們可以看出:通過SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2對小麥基因組DNA進行PCR擴增，可以直接通過瓊脂糖電泳，以能否擴增出236bp大小條帶來判定小麥材料是否含有該赤霉病抗性基因，檢測方法操作簡單，檢測結果非常直觀，檢測效果明顯。
權利要求
1.一對用于篩選小麥赤霉病抗性的引物序列，其特征在于:所述的一對特異性引物序列為:上游引物SEQ ID N0.1和下游引物SEQ ID N0.2。
2.如權利要求1所述引物序列的應用，其特征在于^SEQID N0.1和SEQ ID N0.2為引物，以待測小麥基因組DNA為模板進行PCR擴增，再對擴增產物在瓊脂糖凝膠中電泳分離檢測，若擴增產物中含有236bp大小的條帶，則待測小麥品種有赤霉病抗性，為抗病品種，否則待測小麥無赤霉病抗性，為感病品種。
3.根據權利要求2所述的引物序列的應用，其特征在于: PCR擴增的反應體系為:20-100ng的待測小麥基因組DNA, 5U/ μ L的Taq BI 0.25 μ L，4 μ mol/L 的 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 各 I μ L, IOmmoI/L 的 dNTP 0.5 μ L, IOXPCR 的Mg2+ Plus緩沖液2.5 μ L，余量為無菌蒸餾水； PCR擴增的反應條件為:95°C預變性5min，隨后94°C變性30sec，58°C條件下退火30sec, 72°C延伸30sec，進行35個循環；最后72°C延伸IOmin;在4°C下保存。
4.根據權利要求2或3所述的引物序列的應用，其特征在于:對擴增產物在瓊脂糖凝膠中電泳分離檢測的是指:將擴增產物在0.8% - 2%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，EB染色，判斷擴增產物中是否含 有236bp的條帶。
全文摘要
本發明涉及一對用于篩選小麥赤霉病抗性的引物序列及其應用。所述引物序列SEQIDNO.1和SEQIDNO.2，對小麥基因組DNA進行PCR擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳后可通過判斷擴增產物中是否含有236bp的條帶，直觀獲得小麥品種是否具有赤霉病抗性，只有含236bp左右大小條帶的小麥品種才有赤霉病抗性。
文檔編號C12N15/11GK103224978SQ201310013279
公開日2013年7月31日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者馬鴻翔, 王磊, 張旭, 余桂紅, 杜軍凱 申請人:江蘇省農業科學院