專利名稱：豬流行性腹瀉病毒變異株檢測用引物及其檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及豬流行性腹瀉病毒變異株檢測用引物及其檢測試劑盒。屬于生物檢測技術領域。
背景技術：
豬流行性腹灣(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)是由豬流行性腹灣病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV)引起的一種急性、高度接觸性的傳染病,常以急性腸炎和伴有脫水的水樣腹瀉為特征，各種年齡的豬均易感。本病于1971年首先發現于英國，此后，歐洲和亞洲各國也報道了該病的暴發。我國在1973年分離到PEDV(經典毒株)。2010年冬季至2011年春季全國各地豬場的豬群中先后發生嚴重的傳染性腹瀉疾病，發病突然，傳播較快，流行范圍廣，流行時間長，應用各種抗生素防治無效，其發病率與死亡率很高，造成重大 的經濟損失。經研究表明，豬流行性腹瀉病毒變異株是此次疫情的兀兇(Jianfei Chen 等 Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic DiarrheaVirus Variant. J. Virol, 2012, 86: 3408)。豬流行性腹灣病毒變異株(Yanjun Zhou等Complete Genome Sequence of a Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain.J. Virol, 2012, 86: 13862)與原來毒株 PEDV (經典毒株)(Jianfei Chen 等 CompleteGenome Sequence of a Chinese Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain.J. Virol, 2012，86: 3408)的基因組同源性在97%左右，變異最大的為S基因，同源性在94%以下，且存在氨基酸發生缺失和插入的序列特征(Wentao Li等New variants ofporcine epidemic diarrhea virus, China, 2011. Emerg.1nfect. Dis, 2011, 85:11538)。此前，我國尚無PEDV變異株(命名為PEDV-V)的特異檢測技術。常規RT-PCR技術不能區分PEDV (經典毒株)和PEDV-V (PEDV變異株)，因此不能特異地檢測PEDV變異株。現如今，對豬流行性腹瀉病毒變異株的檢測只能通過基因測序來確定該病毒的感染，操作繁雜、耗時長、成本較高。因此，基于以上的研究和當前的需求，申請人根據豬流行性腹瀉病毒變異株S基因發生核苷酸缺失和插入的特征，設計并合成了一對檢測豬流行性腹瀉病毒變異株的引物，采用RT-PCR方法擴增S基因，通過擴增片段的分子量大小，判斷是否存在豬流行性腹瀉病毒變異株，從而特異、敏感、省時、省力、低成本地檢測出豬流行性腹瀉病毒變異株。目前其他RT-PCR方法不能解決該問題；基因測序技術需要時間較長，且費時、費力、成本高。因此，該技術可對豬流行性腹瀉病毒變異株的診斷和監測起到重要作用。
發明內容
技術問題
本發明目的在于提供用于PEDV變異株RT-PCR檢測的引物序列及其檢測試劑盒。
技術方案
本發明通過分析PEDV變異株的S基因序列，在S基因發生核苷酸插入和缺失的序列處設計引物。所述的引物對由正向和反向引物組成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO.1和 SEQ ID NO. 2 所示。具體地，本發明提供了一種PEDV變異株檢測用引物，該引物的正向引物(PEDV-VF)序列SEQ ID NO.1和反向引物(PEDV-VR)序列SEQ ID NO. 2的核苷酸序列為
SEQ ID NO.1 :5’ -TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’
SEQ ID NO. 2 :5’ -CAACACTATGTTCACTCA-3’。該引物從感染豬流行性腹瀉病毒變異株的病料提取的總RNA中擴增出327 bp DNA片段。本發明還提供了一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒變異株的試劑盒，該試劑盒含有上述引物 SEQ ID NO.1 和 SEQ ID NO. 2。具體的，該試劑盒包括
(1)陰性對照取滅菌的DEPC水，置-20°c冰箱保存；
(2)RT反應液
無菌 DEPC 水4. 75 μ L
10ymol/L dNTPI μ L
20 μ moI/L PEDV-VR I μ L 5X反轉錄緩沖液4yL40 U/ μ L RNA酶抑制劑 I μ L
O.1 mmol/L DTT2 μ L
200U/yL 反轉錄酶O. 25 μ L
混勻后_20°C保存；
(3)PCR反應液
無菌 DEPC 水32. 5 μ L
20 μ mol/LPCR弓丨物混合液 2 μ L 10XPCR緩沖液5yL
2. 5 mmol/L dNTP8μ L
5U/ μ L DNA 聚合酶 O. 5 μ L 混勻后_20°C保存。所述的試劑盒，還包括陽性對照為豬流行性腹瀉病毒變異株JS-HZ2012發生腹瀉的糞便樣品。有益效果
本發明是根據豬流行性腹瀉病毒變異株S基因序列設計的引物，本發明的引物是經過大量PEDV的S基因序列比對和篩選得到的，而且應用該引物及本發明中的檢測試劑盒能夠快速地判斷樣品中是否含有豬流行性腹瀉病毒變異株，為豬的腹瀉病提供檢測工具。
同時，進過大量的臨床檢測和測序分析比對，都證實本發明的檢測引物和檢測試劑盒能夠準確無誤的檢測目前我國流行的豬流行性腹瀉病毒變異株，且不能檢測出豬流行性腹瀉病毒經典毒株，能夠達到區分變異株和經典株的目的，而以往檢測方法無法區分變異株和經典株。本發明的引物和檢測試劑盒能夠為臨床上檢測豬腹瀉病提供有效的工具。
圖1是豬流行性腹瀉病毒變異株(PEDV-V)的RT-PCR檢測結果，其中M DL2000DNA ladder ;1、豬流行性腹瀉病毒變異株；2、豬流行性腹瀉病毒經典毒株(PEDV);3、豬傳染性胃腸炎病毒(TGVE) ;4、豬輪狀病毒(PRV) ;5、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) ;6、陰性對照。圖2是本發明檢測方法的靈敏度實驗結果。其中M DL2000 DNA ladder ;1_11表示反轉錄反應體系中加入的連續10倍稀釋的RNA模板；12、陰性對照。
具體實施例方式下面實施例用于對本發明的進一步說明，但不用來限制本發明的范圍。實施例11、引物的設計和合成
根據豬流行性腹瀉病毒變異株S基因的核苷酸序列，采用Primer 5. O設計引物，經過大量篩選得到如下序列的引物序列
正向引物(PEDV-VF)的序列為SEQ ID NO. 1，反向引物(PEDV-VR)序列為SEQ ID NO. 2，具體序列的組成如下
SEQ ID NO.1 :5’ - TTGGTGAAAACCAGGGTGTC -3’
SEQ ID NO. 2 :5’ - CAACACTATGTTCACTCA-3’。
根據上述核苷酸序列信息合成正向引物PEDV-VF和反向引物PEDV-VR。將上述引物PEDV-VF和PEDV-VR分別配置成濃度為20 μ mo I/L的溶液，備用。2、一種檢測豬流行性腹瀉病毒變異株的試劑盒，按下表組裝
表I試劑盒組成
權利要求
1.豬流行性腹瀉病毒變異株檢測用的引物，包括正向引物 PEDV-VF (SEQ ID NO.1) :5’ -TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’ 和反向引物 PEDV-VR (SEQ ID NO. 2) 5，-CAACACTATGTTCACTCA-3，； 該引物從感染豬流行性腹瀉病毒變異株的病料提取的總RNA中擴增出327 bp DNA片段。
2.一種用于檢測豬流行性腹瀉病毒變異株的試劑盒，該試劑盒含有權利要求1所述的引物。
3.、如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，包括 (1)陰性對照取滅菌的DEPC水，置-20°C冰箱保存； (2)RT反應液 無菌 DEPC 水4. 75 μ L 10ymol/L dNTPI μ L 20 μ moI/L PEDV-VR I μ L 5X反轉錄緩沖液4yL 40 U/ μ L RNA酶抑制劑 I μ L O.1 mmol/L DTT2 μ L 200U/yL 反轉錄酶O. 25 μ L 混勻后_20°C保存； (3)PCR反應液 無菌 DEPC 水32. 5 μ L 20 μ mol/LPCR弓丨物混合液 2 μ L 10XPCR緩沖液5yL 2. 5 mmol/L dNTP8μ L 5U/ μ L DNA 聚合酶 O. 5 μ L 混勻后_20°C保存。
4.如權利要求2或3所述的試劑盒，還包括陽性對照為豬流行性腹瀉病毒變異株JS-HZ2012發生腹瀉的糞便樣品。
全文摘要
本發明提供了豬流行性腹瀉病毒變異株檢測用引物及其檢測試劑盒，屬于生物技術領域。所述正向引物PEDV-VF(SEQ ID NO.1)5’-TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’和反向引物PEDV-VR(SEQ ID NO.2)5’-CAACACTATGTTCACTCA-3’。本發明還進一步提供了檢測豬流行性腹瀉病毒變異株的檢測試劑盒。其檢測方法以總RNA為模板，利用上述引物進行反轉錄PCR(RT-PCR)擴增，反應結束后根據擴增片段的位置判定結果。本發明的引物特異性好，檢測方法快速簡單，準確性高，為豬流行性腹瀉病毒變異株的檢測提供了保證。
文檔編號C12N15/11GK103060474SQ201310012559
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月7日 優先權日2013年1月7日
發明者李彬, 何孔旺, 杜露平, 郭容利, 倪艷秀, 溫立斌, 俞正玉, 張雪寒, 茅愛華, 呂立新, 胡屹屹, 周俊明, 王小敏, 祝昊丹, 于洋 申請人:江蘇省農業科學院