專利名稱：一種用于禽肺病毒b亞群特異性檢測的熒光定量rt-pcr檢測試劑盒及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，特別涉及一種用于禽肺病毒B亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒及其應用，屬于病毒檢測領域。
背景技術：
禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)又稱火雞鼻氣管炎病毒(turkyrhinotracheits virus, TRTV)。肺病毒引起的疾病最早在火雞上發現,該病毒引起火雞的呼吸道疾病并導致產蛋量下降。在雞上禽肺病毒是引起腫頭綜合征的重要因素。在世界的許多地方APV對火雞和雞造成嚴重的威脅。根據編碼禽肺病毒G蛋白的基因不同將歐洲病毒株分為兩個亞型，即A亞群(APV/A)(英國)和B亞群APV/B (歐洲大陸)。APV/B亞型首先在歐洲大陸包括匈牙利、意大利和西班牙分離到。目前，在歐洲，APV/B亞型主要的流行亞型。在南美洲如巴西等國家也有對APV/B亞型流行的報道。在亞洲，日本、韓國和以色列有APV/B亞型分離鑒定的報道，值得關注的是，在以色列，從2002到2004年有APV/A和APV/B亞型的報道中，APV/B亞型已成為主要流行的亞型。在國內雖然尚無針對APV/B亞型的報道，但臨近國家如日本、韓國和以色列等國家APV/B亞型流行廣泛，很有可能對中國養禽業造成危害，因而建立一種針對APV/B亞型的快速診斷方法對預防和控制APV極為重要。目前，APV的實驗室常規診斷方法主要是RT-PCR，但是該方法在用于APV檢測時仍在敏感性、特異性和時效性等方面均存在不足，特別是在該病的早期診斷中體現得尤為明顯。本研究為針對B亞群APV檢測的熒光定量RT-PCR的檢測試劑盒及其引用，本發明的檢測試劑盒具有良好的敏感性和特異性，能夠區分亞群，為APV的臨床檢測提供了強有力的技術支撐，同時為APV感染、增殖規律的研究提供了重要的檢測手段，對APV的臨床診斷和致病機理的研究具有一定應用價值。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用于禽肺病毒(Avian pneumovirus, APV)B亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。為達到以上目的，本發明采用的技術手段為:根據GenBank中，禽肺病毒(APV) B亞群序列設計I對針對G基因的引物和I條特異性TaqMan探針，建立了一種快速檢測 APV B亞群病毒載量的特異性TaqMan熒光定量RT-PCR方法并組裝了檢測試劑盒。通過對反應條件和反應體系的優化，使得使用本發明的試劑盒進行的熒光定量RT-PCR檢測在I X IO3 I X IO9個拷貝 ii I/1范圍內具有良好的線性關系，靈敏度達到IO2個拷貝 ii L—1，是常規RT-PCR方法的10倍，而且與常規RT-PCR方法相比(BAYON.-AUB0YER M, JESTIN V, TOQUIN D, et al Comparison of F-, G-and N-basedRT-PCR protocols with conventional virological procedures for the detectionand typing of turkey rhinotracheitis virus.A rch Virol,1999,144:1091-1109 ；或 DAR A M, TUNE Kj MUNIR S，et al，PCR-based detection of an emerging avianpneumovirus in US turkey flocks, J Vet Diagn Invest，2001，13(3):201-205 ;或GHARAIBEH1S M, ALGHARAIBEHG R,Serological and Molecular Detection of AvianPneumovirus in Chickens with Respiratory Disease in Jordan, Poultry science，2007,86 (6): 1677-1681)，使用本發明的試劑盒進行的熒光定量RT-PCR檢測可對結果進行實時監控，無需進一步進行凝膠電泳分析。試驗表明，使用本發明的試劑盒進行的熒光定量RT-PCR檢測與其他禽 病病毒無交叉反應，且B亞群的熒光定量RT-PCR與其他亞群的RNA標準品不反應，說明本發明試劑盒具有良好的敏感性和特異性。將備檢樣品提取RNA后，不用反轉錄，直接進行熒光定量RT-PCR反應，利用所建立的熒光定量RT-PCR試劑盒可以在2h內快速準確地對APV B亞群進行檢測，既能進行定性檢測，又能準確定量，而且能夠對陽性樣品的亞群進行準確的判斷。本發明是一種用于禽肺病毒B亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR試劑盒，其特征在于包括特異性擴增禽肺病毒B亞群G基因的特異性引物對和探針，其中所述的引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如下所示:上游引物:5’CTCAGAAGGAGCAAAAAAATACTGT3’(SEQID N0.1 所示)下游引物:5’GCCCAATAAGTGTCCACACACTGTCG3’(SEQID N0.2 所示)所述的探針序列如下所示:5’FAM-GACGCTCACTAGCACTATTGTTATATCTAT-TAMRA3'。(SEQ ID N0.3 所示)。在本發明中，所述的試劑盒中還可包括反應混合液，I7RNA聚合酶以及不含RNase的雙蒸水。其中，反應混合液中包含有PCR擴增所需要的成分:25mmol/L MgCl2以及10mmol /T, dNTPs。所述的反應混合液可為 2 X QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix,購自Qiagen 公司。進一步的，本發明還提出了所述的試劑盒在制備禽肺病毒B亞群檢測試劑中的應用。及所述的試劑盒在制備以禽肺病毒G基因為靶點區分禽肺病毒亞群試劑中的應用。
圖1為熒光定量RT-PCR的動力學曲線；圖2為熒光定量RT-PCR的標準曲線；圖3為常規RT-PCR的敏感性試驗；圖4為使用熒光定量RT-PCR對APV的A、B和C亞群的G基因以及B亞群病毒進行擴增的動力學曲線。
具體實施例方式下面通過實驗并結合實施例對本發明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發明的保護范圍。實施例1本發明試劑盒中探針及引物序列的設計和合成根據GenBank中APV的B亞群的G基因序列(GenBank登錄號為Gb:AB548428.1)設計I對分別針對目的基因的上下游引物:
上游引物GBF:5’CTCAGAAGGAGCAAAAAAATACTGT3’(SEQ ID N0.1 所示)下游引物GBR:5’ GCCCAATAAGTGTCCACACACTGTCG3’ (SEQ ID N0.2 所示)及I條特異性Taqman探針:探針GB j’FAM-GACGCTCACTAGCACTATTGTTATATCTAT-TAMRAS'。(SEQ ID N0.3 所示)。引物由北京六合華大基因公司合成，探針由TaKaRa公司合成。實施例2本發明試劑盒在檢測禽肺病毒(APV) B亞群病毒中的應用I材料與方法1.1菌株與質粒E.coli DH5a由本實驗室保存，APV的四個亞群的G基因(GenBank登錄號分別為Ga:AY640317.1，Gb:AB548428.1，GC:AY590688.1，GD:AJ251085.1)由哈爾濱博仕生物合成并克隆到 pBluescript IIKS ( + )載體上，分別命名為 PBL_Ga，PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd 由本實
驗室保存。1.2儀器與試劑LightCycler480熒光定量PCR儀購自Roche公司，紫外分光光度計購自GE公司；質粒提取試劑盒購自AxyGen公司；0neStep RT-PCR試劑盒和QuantiTect'、Probe RT-PCR試劑盒購自Qiagen公司，T7RNA polymerase購自Pragma公司。1.3探針的設計與合成按照實施例1方法制備。1.4陽性RNA標準品的制備以合成的PBL-Ga, PBL-Gb, PBL-Gc, PBL-Gd 質粒為模板，利用 I7RNA polymerase 試劑盒分別生成RNA，測其濃度后，換算成拷貝數，并稀釋至IOltl個拷貝 y L'-SOt:保存，用前稀釋作為陽性RNA標準品。1.5熒光定量RT-PCR反應條件的優化以陽性RNA標準品為模板，在不同退火溫度下進行常規RT-PCR反應，擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，確定最佳的引物退火溫度。應用矩陣法對熒光定量RT-PCR的引物和探針濃度進行優化，以得到最佳的反應體系和反應條件。1.6熒光定量RT-PCR標準曲線的建立將陽性標準品10倍梯度稀釋至濃度范圍為IXlO3 IXlO9個拷貝 UL'以稀釋的RNA標準品為模板，每個稀釋度設3個重復，進行熒光定量RT-PCR檢測，繪制標準曲線。1.7敏感性試驗將陽性RNAlO倍梯度稀釋至最低濃度為每微升10個拷貝，每個梯度做3個重復，進行熒光定量RT-PCR反應，確定檢測的敏感性。同時以等量的RNA為模板，進行常規RT-PCR反應，具體引物(Gb/Gy)和退火溫度參照文獻(BAYC)N-AUBOYER M, JESTIN V，TOQUINDj et al Comparison of F—，G _and N-based RT-PCR protocols with conventionalvirological procedures for the detection and typing of turkey rhinotracheitisvirus.Arch Viro 1，1999，144:1091-1109)。取擴增產物5 u L，用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行分析，比較二者敏感性的差異。
1.8特異性試驗雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)，禽流感病毒(AIV H5，AIV H7，AIV H9)，雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)，新城疫病毒(NDV)，雞病毒性關節炎病毒(ARV)和網狀內皮增生癥病毒(REV)等病毒的RNA，利用建立的rRT-PCR方法對其進行檢測，同時利用建立的針對B亞群的熒光定量RT-PCR檢測APV其他3個亞群的RNA標準品，同時設陰性和陽性對照。2 結果2.1熒光定量RT-PCR反應條件的優化B 亞群熒光定量 RT-PCR 反應體系共為 20 ii L，含 10 ii L2 X QuantiTect ProbeRT-PCR Master Mix，6.75 y L 水，0.25 y L Enzyme，0.125 y L 探針 GA (20nM),0.1875 u L上游引物GBF (40nM)，0.1875 u L下游引物GBR (40nM)，陽性RNA標準品2.5 y L。反應條件為:48°C 30min,95°C IOmin ；95°C 15sec,60°C lmin，40 個循環。2.2標準曲線的建立通過熒光定量RT-PCR反應條件進行優化，獲得了檢測APV B亞群的動力學曲線(見圖1)和標準曲線(見圖2)。標準品濃度從IX IO3 IX IO9個拷貝 UL—1具有良好的線性關系(Error均小于0.2, LightCycler480分析軟件計算得到的Error值為用于擬合線性回歸時的單個數據點的平均方差，它代表定量結果的準確性，可以接受的誤差值應小于
0.2)。圖1x軸為循環閾值，y軸為熒光強度。圖2x軸為RNA標準品拷貝數的對數值，y軸為循環閾值。2.3敏感性試驗
熒光定量RT-PCR能檢出的模板最低濃度為IO2個拷貝 ii L'而常規RT-PCR能檢出的模板最低濃度為IO3個拷貝 y L—1 (見圖3)，表明所建立的熒光定量RT-PCR的敏感性是常規RT-PCR的10倍。2.4特異性試驗用熒光定量RT-PCR 對 IBV，AIV H5，AIV H7，AIV H9，IBDV，NDV，ARV 和 REV 進行檢測，檢測結果均為陰性，這些病毒的擴增曲線均為水平線，未達到檢出閾值，而RNA標準品(GB:AB548428.1)，有良好的擴增。用熒光定量RT-PCR對APV的A、B和C亞群的G基因(GenBank登錄號分別為Ga:AY640317.1、Gb:AB548428.1 和 GC:AY590688.1)和 B 亞群病毒 RNA 進行檢測，結果以 B 亞群的G基因和B亞群全病毒RNA為模板的反應為陽性，其他兩個亞群均為陰性(見圖4)，這說明該方法可以直接用于B亞群禽肺病毒RNA的檢測。圖4x軸為循環閾值，y軸為熒光強度。以上所述僅為本發明的優選實施例，對本發明而言僅是說明性的，而非限制性的；本領域普通技術人員理解，在本發明權利要求所限定的精神和范圍內可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發明的保護范圍內。
權利要求
1.一種用于禽肺病毒B亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于包括特異性擴增禽肺病毒B亞群G基因的特異性引物對和I條特異性Taqman探針，其中所述的引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如下所示: 上游引物:5’ CTCAGAAGGAGCAAAAAAATACTGT3’ 下游引物:5’ GCCCAATAAGTGTCCACACACTGTCG3’ 所述的探針序列如下所示:5’ FAM-GACGCTCACTAGCACTATTGTTATATCTAT-TAMRA3’。
2.按權利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中還包括反應混合液，T7RNA聚合酶以及不含RNase的雙蒸水。
3.權利要求1或2所述的試劑盒在制備禽肺病毒B亞群檢測試劑中的應用。
4.權利要求1或2所述 的試劑盒在制備以禽肺病毒G基因為靶點區分禽肺病毒亞群試劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種用于禽肺病毒B亞群特異性檢測的熒光定量RT-PCR檢測試劑盒，其特征在于包括特異性擴增禽肺病毒B亞群G基因的特異性引物對和探針，其中所述的引物對中兩條引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、2所示，所述的探針序列如SEQ ID NO.3所示。使用本發明的試劑盒能夠實現對禽肺病毒B亞群病毒的檢測，本發明的試劑盒在1×103～1×109個拷貝·μL-1范圍內具有良好的線性關系，靈敏度達到102個拷貝·μL-1，是普通RT-PCR方法的10倍，且與其他禽病病毒無交叉反應。結果表明，本發明的試劑盒具有良好的敏感性和特異性，可用于禽肺病毒B亞群的定量檢測。
文檔編號C12Q1/70GK103088162SQ20131001445
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者高玉龍, 王笑梅, 祁小樂, 高宏雷, 秦立廷, 王永強 申請人:中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所