專利名稱：一種釀酒酵母工程菌及其應用與飼料添加劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物工程菌領域，涉及一種釀酒酵母工程菌及其應用與飼料添加劑。
背景技術：
釀酒酵母是一類單細胞微生物，結構簡單，屬于真菌類。釀酒酵母具有個體大，蛋白質含量高，雜食性強，易分離，易培養，代謝產物多，綜合利用廣等特點，在飼料工業中得到了廣泛研究和應用。酵母可以改善動物胃腸道環境和菌群結構，增強動物免疫力，對幼年動物可刺激其胃腸道發育，并且，酵母可以產生一些生長因子，促進動物生長，因此是一類具有極高應用價值的飼料添加劑。但是酵母和飼用乳酸菌、芽孢桿菌等益生菌相比，缺少對有害菌的抑菌能力。
發明內容
本發明的目的是提供一種釀酒酵母工程菌，其構建方法與應用。本發明所提供的釀酒酵母工程菌，其是將豬防御素pBD2成熟肽的編碼序列和釀酒酵母信號肽的編碼序列克隆到釀酒酵母表達載體上，得到重組載體，將該重組載體轉化入釀酒酵母中，得到具有抑菌活性的酵母菌。其中，所述釀酒酵母為釀酒酵母YS58。其中，所述釀酒酵母表達載體為pAURl 23。在本發明的一個實施方案中，所述豬防御素PBD2成熟肽序列是指pBD2的26 69位氨基酸序列，所述釀酒酵母信號肽序列是指克隆自畢赤酵母表達質粒pPICZ a A的第941-1207位基因編碼的89個氨基酸殘基的釀酒酵母信號肽序列。在本發明另一個優選的實施方案中，所述的釀酒酵母工程菌的保藏編號為CGMCCN0.6921。本發明還提供所述的釀酒酵母工程菌的方法，將編碼豬防御素pBD2成熟肽的DNA序列和編碼釀酒酵母信號肽的DNA序列克隆入酵母表達載體PAUR123，得到具有抑菌功能的釀酒酵母工程菌，所述豬防御素PBD2成熟肽序列為豬防御素pBD2的26 69位氨基酸序列，所述釀酒酵母信號肽序列為克隆自畢赤酵母表達載體的含有89個氨基酸殘基的釀酒酵母信號肽序列。在本發明一個實施方案中，通過PCR擴增出豬防御素PBD2基因編碼第26 69位氨基酸的基因序列，通過擴增引物在基因5’端導入KpnI酶切位點，3’端導入SacI酶切位點，用KpnI和SacI將擴增的pBD2基因雙酶切后，連接在酵母表達載體pAUR123的KpnI和SacI酶切位點上，構建得到pABD2質粒；通過PCR方法擴增畢赤酵母表達質粒pPICZ a A的釀酒酵母信號肽序列的第941-1207位基因，并通過引物在序列兩端引入KpnI酶切位點；將PABD2質粒用KpnI單酶切，將P CR得到的信號肽序列插入pABD2質粒中，得到pABD2a質粒；將pABD2a質粒轉化入釀酒酵母YS58菌株中，通過AbA抗性篩選得到具有抑菌活性的釀酒酵母。本發明提供所述的釀酒酵母工程菌在飼料添加劑上的應用。本發明的釀酒酵母工程菌可以單獨或與其它有益微生物配伍，作為添加劑添加到動物飼料中，改善動物的生長性能，減少疾病，提升動物免疫力上的應用。本發明通過構建釀酒酵母工程菌，在釀酒酵母中轉入具有抑菌功能的豬防御素基因，使釀酒酵母也具有了抑菌功能，可以抑制金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬鏈球菌和豬霍亂沙門菌等豬常見的病原菌，為酵母更好的在畜牧養殖業中發揮作用奠定了新的基礎。
圖1:酵母重組載體pABD2a的構建過程。圖2:pAUR123載體的酶切和豬防御素基因pBD2的擴增(1.8%瓊脂糖凝膠)。1、Marker II ;2、lkb plus DNA ladder ;3、4 pAUR123/KpnI+SacI ;5、6pBD2 基因 PCR 擴增。圖3:酵母重組載體pABD2插入的豬防御素基因的PCR鑒定電泳圖譜(1.8%瓊脂糖凝膠)。UMarker II ;2、3酵母重組質粒pABD2載體的PCR驗證。圖4:pPICZ a A 質粒的 a-factor 的擴增(1.8% 瓊脂糖凝膠)。I> Marker II ;2、3a -factor 的 PCR 擴增。圖5:酵母重組載體pABD2 α插入的a -factor基因的PCR鑒定電泳圖譜(1.8%瓊脂糖凝膠)。UMarker 11;2、陰性對照；3、4酵母重組載體pABD2a插入的a-factor的PCR驗證。圖6:釀酒酵母工 程菌YSBD58發酵上清對金黃色葡萄球菌的抑制作用。其中I為空白對照；2為釀酒酵母工程菌YSBD58發酵上清對金黃色葡萄球菌的抑制作用。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。實施例1酵母表達質粒pABD2的構建酵母表達質粒pABD2的構建過程如圖1所示。根據豬防御素pBD2的序列設計上游引物pBD2-F:5’ -CTTGGTACCATGACTGGTTTGGGTC-3，和下游引物 pBD2-R_N_2:5 ’ -TTCGAGCTCTTATCTAATACAACACTTAGC-3’，在上游引物5’端引入酶切位點ΚρηΙ，在下游引物5 ‘端引入終止密碼子TTA和酶切位點SacI。用英駿公司合成的豬防御素pBD2多肽基因為模板進行PCR擴增。PCR擴增條件為94°C預變性5分鐘；94°C熱變性30秒，60°C退火30秒，72°C延伸30秒，30個循環；72°C延伸 3 分鐘。PCR 體系為:引物 pBD2-F I μ L，pBD2-R_N_2 I μ L, IOXdNTP 2 μ L,IOXExTaq Buffer 2 μ L，ExTaq酶0.5 μ L，加超純水補充體系到20 μ L。PCR擴增結果經1.8%瓊脂糖凝膠電泳的結果見圖2，PCR產物用PCR純化試劑盒(天根公司)純化，純化步驟詳見試劑盒說明書。純化產物送測序公司測序，測序結果用DNAman軟件比對正確。用KpnI和SacI酶切PCR純化的產物，酶切體系為:PCR純化產物20 μ L，IOXbuffer 25 μ L，KpnI和SacI各3 μ L，滅菌超純水補充體系到250 μ L,酶切條件是37°C溫育3小時。釀酒酵母表達載體pAUR123 (TaKaRa公司)的酶切體系是:PCR純化產物25 μ L，IOXbuffer 25 μ L，KpnI和SacI各3 μ L，滅菌超純水補充體系到250 μ L,酶切條件是37°C溫育3小時。酶切產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳的結果見圖2。豬防御素pBD2多肽基因的酶切產物和pAUR123的酶切產物用PCR純化回收試劑盒回收。回收后進行連接，連接體系是:pAUR123/KpnI和SacI 3 μ L，PCR酶切回收產物3yL,10XT4 DNA連接buffer I μ L，T4-DNA連接酶I μ L，加滅菌超純水補充體系到10 μ L，4°C過夜連接。連接產物轉化大腸桿菌熱激感受態細胞JM109 (天根公司)。大腸桿菌熱激轉化的方法為:將100 μ L感受態細胞在冰上融化，加入IOyL連結產物，輕輕敲打混勻，冰上放置20分鐘。42°C水浴熱擊90秒，取出置于冰上放置5分鐘，力口Λ 900 μ L的LB培養基。37°C搖床150rpm震蕩培養I小時后，取出200 μ L培養液涂布加Λ 20 μ g/mL Ap抗生素的平板，37°C過夜培養。挑取單菌落做菌落PCR，PCR體系和條件如上所述。PCR產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳的結果見圖3，PCR產物測序后，與預期片段的同源性達到100%。將構建的重組酵母豬防御素pBD2表達載體命名為pABD2。實施例2酵母胞外表達質粒pABD2 α的構建酵母胞外表達質粒pABD2 α的構建過程如圖1所示。根據畢赤酵母胞外表達載體 pPICZaA 的 α 信號肽序列設計上游引物 afactor-F:5’ -ATGGTCGACACGATGAGATTTCCTTC-3’ 和下游引物 afactor-R:5’ -ATCCTCGAGGAATTCTACGTAAGCTTC-3’，在上游和下游引物 5’端引入酶切位點ΚρηΙ。用稀釋100倍的pPICZ a A質粒作為模板。PCR擴增條件為94°C預變性5分鐘；94°C熱變性30秒，60。。退火30秒，72 °C延伸30秒，30個循環；72°C延伸3分鐘。PCR 體系為:引物 afactor-F I μ L, afactor-R I μ L, 10X dNTP 2 μ L, IOXExTaq Buffer2 μ L，ExTaq酶0.5 μ L，加超純水補充體系到20 μ L。PCR擴增結果經1.8%瓊脂糖凝膠電泳的結果見圖4，PCR產物用PCR純化試劑盒(天根公司)純化，純化步驟詳見試劑盒說明書。純化產物送測序公司測序，測序結果用DNAman軟件比對正確。
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用KpnI酶切PCR純化的產物，酶切體系為:PCR純化產物20 μ L，10 X buffer25 μ L，KpnI 3 μ L，滅菌超純水補充體系到250 μ L，酶切條件是37°C溫育3小時。在實施例1中構建的載體pABD2的酶切體系是:PCR純化產物25 μ L，IOXbuffer25 μ L，KpnI 3 μ L，滅菌超純水補充體系到250 μ L，酶切條件是37°C溫育3小時。酶切產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳驗證酶切效果。α信號肽基因和pABD2質粒的KpnI酶切產物用PCR純化回收試劑盒回收。回收后進行連接，連接體系是:pABD2/KpnI 3 μ L，α信號肽基因酶切回收產物3 μ L，10XΤ4 DNA連接buffer 14 1^，了4-0嫩連接酶14 1^，加滅菌超純水補充體系到1(^1^，41:過夜連接。連接產物轉化大腸桿菌熱激感受態JM109(天根公司)。大腸桿菌熱激轉化的方法見實施例1。37°C搖床150rpm震蕩培養I小時后，取出200 μ L培養液涂布加入20 μ g/mL Ap抗生素的平板，37°C過夜培養。挑取10個單菌落做菌落PCR，PCR體系和條件如上所述，其中有6個菌落是陽性克隆。PCR產物經1.8%瓊脂糖凝膠電泳的結果見圖5，PCR產物測序后，與預期片段的同源性達到100%。將構建的重組酵母胞外表達載體命名為pABD2ci。實施例3重組質粒轉化釀酒酵母YS58用化學法將實施例2構建的重組酵母胞外表達載體pABD2a轉化入釀酒酵母YS58，轉化方法是:過夜培養釀酒酵母YS58，第二天1%接種量轉接50mL YH)培養基，30°C振蕩培養6小時，使0D660到1-2，IOOOg離心5分鐘，IOmL溶液A重懸細胞(IOOmM Lithiumacetate, IOmM Tris-HCl ρΗ7.5，ImM EDTA)，IOOOg 離心 5 分鐘。用溶液 A 再次重懸細胞，使0D660達到150，IOOuL每管分裝細胞于離心管中，30°C溫育I小時，在離心管中加入5uL質粒DNA (pABD2 α )和150uL助質粒(小牛胸腺DNA)。加入850uL溶液B (將40g聚乙二醇4000溶于IOOmL溶液A中)，輕輕混勻。30°C溫育30分鐘，42°C溫育15分鐘，室溫放置10分鐘，5000rpm離心I分鐘，菌泥重懸于5mLYPD培養基。30°C過夜培養，5000-10000rpm離心，菌泥重懸于1-1OmL的生理鹽水中。吸取IOOuL細胞懸浮液于YPD選擇培養基(0.5ug/mL Aureobasidin A)，30°C培養2_3天,隨機挑取10個克隆,分別提取質粒和PCR驗證,其中7個驗證為陽性克隆子。實施例4YSBD58酵母的培養將挑取的7個陽性酵母菌于5mL YI3D試管中，30°C過夜震蕩培養。第二天1%接種量轉接于50mL YPD三角瓶中繼續培養，每6小時取樣離心，測定發酵液的抑菌活性。通過比較7個陽性酵母菌的出現抑菌圈的時間和抑菌圈的直徑，發現在48小時時4號陽性酵母菌的抑菌圈直徑最大，見圖6,將4號菌命名為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)YSBD58，并于2012年11月30日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為 CGMCC N0.6921。抑菌活性的測定方法為:在每個無菌平皿中等距放入4個牛津杯，配制MH培養基(瓊脂含量1.0%) 15mL，濕熱滅菌后恒溫至60°C，加入5%金黃色葡萄球菌菌液混勻，配制成帶金黃色葡萄球菌的瓊脂，震蕩混勻后直接倒在無菌培養皿中，緩緩轉動平板使培養基均勻鋪開。待其凝固，用無菌鑷子小心夾出牛津杯，4°C備用。每個孔中加入100 μ L待測發酵上清，蓋好皿蓋，小心移至37 °C培養箱，平皿正放靜置培養。培養20小時后，打開皿蓋，移去牛津杯，用卡尺測量抑菌圈直徑。實施例5YSBD58的抗菌譜鑒定鑒定YSBD58發酵上清液的抑菌譜，測試菌株是常見豬病原菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬鏈球菌和豬霍亂沙門菌，測試結果見表1。表1 YSBD58對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、豬鏈球菌、沙門氏菌和副豬嗜血桿菌的抑菌效果
權利要求
1.一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌,其是將豬防御素pBD2成熟肽的編碼序列和釀酒酵母信號肽的編碼序列克隆到釀酒酵母表達載體上，得到重組載體，將該重組載體轉化入釀酒酵母中，得到具有抑菌活性的酵母菌。
2.根據權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于:所述釀酒酵母為釀酒酵母YS58。
3.根據權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于:所述釀酒酵母表達載體為PAUR123。
4.根據權利要求1所述的釀酒酵母工程菌，其特征在于:所述豬防御素PBD2成熟肽序列是指PBD2的26 69位氨基酸序列，所述釀酒酵母信號肽序列是指克隆自畢赤酵母表達質粒pPICZ a A的第941-1207位基因編碼的89個氨基酸殘基的釀酒酵母信號肽序列。
5.根據權利要 求1 4任一項所述的釀酒酵母工程菌，其保藏編號為CGMCCN0.6921。
6.一種構建權利要求1 5任一項所述的釀酒酵母工程菌的方法，將編碼豬防御素PBD2成熟肽的DNA序列和編碼釀酒酵母信號肽的DNA序列克隆入酵母表達載體pAUR123，得到具有抑菌功能的釀酒酵母工程菌，所述豬防御素PBD2成熟肽序列為豬防御素pBD2的26 69位氨基酸序列，所述釀酒酵母信號肽序列為克隆自畢赤酵母表達載體的含有89個氨基酸殘基的釀酒酵母信號肽序列。
7.根據權利要求6所述方法，其特征在于:通過PCR擴增出豬防御素pBD2基因編碼第26 69位氨基酸的基因序列，通過擴增引物在基因5’端導入KpnI酶切位點，3’端導入SacI酶切位點，用KpnI和SacI將擴增的pBD2基因雙酶切后，連接在酵母表達載體pAUR123的KpnI和SacI酶切位點上，構建得到pABD2質粒；通過PCR方法擴增畢赤酵母表達質粒pPICZ a A的釀酒酵母信號肽序列的第941-1207位基因，并通過引物在序列兩端引入KpnI酶切位點JfpABD2質粒用KpnI單酶切，將PCR得到的信號肽序列插入pABD2質粒中，得到pABD2a質粒；將pABD2a質粒轉化入釀酒酵母YS58菌株中，通過AbA抗性篩選得到具有抑菌活性的釀酒酵母。
8.權利要求1 5任一項所述的釀酒酵母工程菌在飼料添加劑上的應用。
9.含有權利要求1 5任一項所述的釀酒酵母工程菌的飼料添加劑。
全文摘要
本發明公開了一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌，其是將豬防御素pBD2成熟肽的編碼序列和釀酒酵母信號肽的編碼序列克隆到釀酒酵母表達載體上，得到重組載體，將該重組載體轉化入釀酒酵母中，得到具有抑菌活性的酵母菌。本發明通過構建釀酒酵母工程菌，在釀酒酵母中轉入具有抑菌功能的豬防御素基因，使釀酒酵母也具有了抑菌功能，為酵母更好的在畜牧養殖業中發揮作用奠定了新的基礎。
文檔編號C12R1/865GK103074241SQ20131001377
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月15日 優先權日2013年1月15日
發明者彭子欣, 謝飛, 馮秋月, 吳雅琨, 陳慧鑫, 王安如 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 北京科高大北農飼料有限責任公司, 浙江大北農農牧科技有限公司