專利名稱：Pcr-ssp法定性檢測hla-b*1502基因的方法及臨床試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種定性檢測HLA-B*1502基因的方法及相應的臨床檢測試劑盒。
背景技術：
癲癇病是一種高發性神經性疾病，發病人數在國外每年為40 70/10萬人口，國內為30/10萬左右[1]，治療癲癇的主要藥物有苯妥英鈉、卡馬西平、乙琥胺、丙戊酸鈉等常規藥物及拉莫三嗪、奧卡西平、托吡酯等新型藥物。卡馬西平和苯妥英鈉是目前常用的一線抗癲癇藥，對復雜部分性發作的癲癇具有顯著的療效。抗癲癇藥物的副反應有頭痛頭暈、行走不穩、厭食、惡心、嘔吐，長期服用對人體的記憶、運動速度、神經系統有很大危害，會導致精神失常、人體各器官機能損傷，兒童智力發育受影響及可能威脅生命的皮膚不良反應，皮膚不良反應包括輕度的斑丘包疹及重度的重型藥疹Stevens-Johnson綜合征(SJS)和中毒性表皮壞死松解癥(TEN)。SJS和TEN是罕見的皮膚疾病，其發病率分別為每年每百萬人1.2 6和0.4 1.2人次[2]，SJS的死亡率是5%，TEN的死亡率達25_35%。多種抗癲癇藥物都會誘導SJS-TEN，包括芳香環藥物卡馬西平、苯妥英鈉、苯巴比妥及非芳香環的拉莫三嗪，發病率為1-10/10000左右。對亞洲人群(中國東南部[3]，馬來西亞[4]，泰國[5 ])研究證實卡馬西平、苯妥英鈉誘導的SJS-TEN與患者是否攜帶HLA-B*1502基因有很大關聯。美國食品藥物管理局(FDA)給出了相關警告且將HLA-B*1502列為卡馬西平和苯妥英鈉誘導SJS-TEN的基因關聯生物標記物。美國食品藥物管理局(FDA)的資料顯示，中國、泰國、馬來西亞和臺灣等亞洲地區帶有HLA-B*1502的人群高達10%以上，而日本、韓國帶有HLA-B^l502的人群的比率低于1%，歐洲人群的HLA_B*1502則很罕見[6]。因此對癲癇病人首先進行HLA-B*1502分型再決定是否給病人服用卡馬西平、苯妥英鈉還是其他替代藥物是很有意義的。人的主要組織相容性復合體(MHC)稱為HLA(human leukocyte antigen)。HLA復合體位于第6號染色體短臂上6p21`.3 (6號染色體短臂2區I帶3亞帶)，全長約4000kb。HLA-B*1502是其中的一個等位基因，代表一種單體型。HLA-B基因序列比較復雜，每個基因型與其他相比有數個不同且不相連的位點差異，因此一般的PCR難以進行分型。目前檢測 HLA_B*1502 的主要方法為 PCR-SBT (Polymerase chain reaction sequence-basedtyping,基于測序分型的聚合酶鏈反應)m、PCR-SSP (Polymerase chain reactionsequence specific primer,序列特異引物引導的聚合酶鏈反應)M和PCR - SSO (PCRusing sequence-specific oligonucleotides,序列特異性寡核苷酸探針雜交聚合酶鏈反應)[9]三種方法檢測。PCR-SBT方法是對HLA基因的B位點進行測序，進而確定HLA_B*1502的高分辨率方法，但是其需要很高的人力及物力花費，需要精密的高端儀器在專門的研究中心實驗，并且周轉時間較長(大于I天)；PCR-SSP方法是利用與HLA等位基因序列互補的引物，對待測樣本DNA進行特異特異性PCR擴增，具有人力、物力花費低，時間短的特性；PCR-SS0方法是PCR擴增產物用一組與HLA等位基因序列互補探針進行雜交，然后確定HLA-B基因型的方法，其缺點是設備要求高、操作過程復雜，難以在短時間內完成全部HLA等位基因的分型。總的來說PCR-SSP相對是比較簡單方便、特異性高的方法。傳統的PCR-SSP方法需要四對特異引物和兩對內參引物進行6次PCR反應，這不僅造成檢測繁瑣，分析困難，而且無論是靈敏度還是特異度均不夠理想。如果想把PCR-SSP方法推廣到臨床應用當中，其價格、反應時間還可以再進行優化。目前市場已有的基于PCR-SSP方法單特異引物檢測HLA-B*1502試劑盒是臺灣的Pharmigene公司的PG1502試劑盒_，其特異度為98.35% (616個樣本)，由于價格較高，不便在內地市場推廣。另外，其檢測引物不能區別HLA-B*15:13， 15:31， 15:55， 15:88， 15:89， 18:20， 95:12， 95:21， 95:44， 95:70 等HLA-B等位基因，會產生假陽性。且該試劑盒沒有采取防PCR污染的措施，在臨床檢測中也容易導致假陽性。假陽性結果使得病人無法選擇合適的藥物，其后果對于兒童癲癇患者特別嚴重。相比其他藥物卡馬西平對兒童的副作用較小，丙戊酸鈉會對肝臟產生重大損傷，而苯巴比妥會造成兒童智力下降。若檢測有假陽性存在會導致兒童無法正確選用卡馬西平而服用其他藥物，造成可能的損害。本發明提供了一種快速，簡便地定性檢測HLA_B*1502基因的PCR-SSP方法，具有快速、簡便、高特異度，抗污染的的優點。
發明內容
本發明的目的在于提供一種快速、簡便，特異度高的定性檢測HLA_B*1502基因的PCR-SSP 方法。本發明提供的定性檢測HLA-B*1502基因的PCR-SSP方法，首先進行HLA_B*1502特異位點的解析和PCR-SSP引物設計區域的確定:通過對超過200個HLA-B等位基因的序列比對，得到HLA-B*1502的6個特異區域，它們位于HLA-B等位基因的第2和第3外顯子，見附圖1所示；然后根據這6個特異區域，設計PCR-SSP檢測的特異引物，這些特異引物見表2所示。具體操作步驟為:
(I)收集 IMGT/HLA 數據庫(http: //www.eb1.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)的 HLA-B，特別是HLA-B*15單體型的基因組、轉錄組的序列，找出HLA-B*1502的特異區域。(2)通過序列比對，得到HLA_B*1502基因第2和第3外顯子的6個特異區域(附圖1)，HLA-B^l502單體型的基因序列中第126至第140個堿基為第一特異區域，其序列為 CCGAGGATGGCGCCC (SEQ N0.1)，其中核心位點為 Gm，A132, T133, C136, C140 ;第 182 至第 199個堿基為第二特異區域，其序列為CCGGM￡ACACAGATCT￡ (SEQ N0.2)，其中核心位點為A186,C188, C199 ;第229至第246個堿基為第三特異區域，其序列為SCCTGCGGAAC￡IGC￡CS (SEQN0.3)，其中核心位點為G229, A238, C240, T241, G244, G246 ;第274至第296個堿基為第四特異區域，其序列為 CTCACATCATCCAGAGGATGTAT (SEQ N0.4)，其核心位點為 T28tl，C281，A282 , T283，C284,G289, G290, A295, T296 ;第331至第347個堿基為第五特異區域，其序列為GCGGGIAT￡ACCAGT￡C(SEQ N0.5)，其核心位點為T336，G339, C346 ;第460至第487個堿基為第六特異區域，其序列為AGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCCT (SEQ N0.6)，其核心位點為 C465，T466, C467, C486, T4870(3)依據上述特異區域設計引物，共6個，這些引物見表2所示；從這6個引物中，隨機組合出15對引物，見表3。其中p2，p3，p4，p5為雙向引物。通過序列比對，分別找出其可能造成假陽性的HLA-B基因型，選用其中可能假陽性數目較少即特異度較高的引物組進行特異性、靈敏度的比較實驗，篩選得一對高特異性、高靈敏度特異引物(參見如表4B1502-SSP-F2 和 B1502-SSP-R5)。(4)選擇一對內參引物用于檢測DNA模板的質量(參見如表4 B1502_iCTRL_F和B1502-1CTRL-R)。本發明提供的定性檢測HLA-B*1502基因的PCR-SSP方法，具體步驟為:
(1)提取受試者血液或組織的基因組DNA ；
(2 )以步驟(1)提取的受試者的基因組DNA為模板，在含檢測HLA-B*1502單特異弓I物及dUTP和UDG酶的PCR反應體系中進行PCR擴增；B1502_SSP_F2和B1502-SSP-R5 ;內參引物為 B1502-1CTRL-F 和 B1502_iCTRL_R ；
(3)擴增結束后，將擴增后的樣品在2%瓊脂糖凝膠孔中進行電泳分離。若有一條特異條帶和一條內參對照條帶則說明樣品為HLA-B*1502陽性，若只含有內參對照條帶那么所測樣品為HLA-B*1502陰性。若無條帶則說明DNA質量不合格，需要重新提取DNA進行檢測；
最后(可使用ABI3730測序儀)測序，驗證結果。上述檢測方法步驟(2)中的12 μ 1反應體系為:11 μ 1試劑盒試劑，1 μ 1受試者樣品 DNA l-10ng)。上述檢測方法步驟的PCR反應條件為 先37。C恒溫孵育3min，再熱啟動95° C10min，l個循環；然 后變性95° C 20sec，延伸68° C 50sec，共40個循環；最后72° C5min。上述檢測方法步驟(3)電泳條件為:電泳時間為20_30min，電泳電場強度不高于5V/cm。本發明還提供用于HLA_B*1502基因快速檢測的試劑盒。本試劑盒具體包含4管試劑，第一管為PCR Mix，包括2XPCR Mix，特異引物B1502-SSP-F2 和 B1502-SSP-R5, B1502_iCTRL_F 和 B1502_iCTRL_R， dUTP 和 UDG 酶，共120 μ 1 ;第二管為雙蒸水100 μ I ;第三管為HLA-B*1502陽性對照樣品12 μ 1 ;第四管為HLA-B^l502陰性對照樣品12 μ I。本發明具有如下優點:
1.本法可以快速地在3小時內完成對待測樣本基因型的檢測，單特異引物和內參引物降低了成本，方便操作，適用性廣，對儀器要求低，適于廣泛的臨床檢測應用。2.本檢測方法針對HLA_B*1502第2和第3外顯子區域設計引物，特異性強，可以區分除了在亞洲地區頻率極低的HLA-B*15:13，15:139,15:112和15:144外的其他HLA-B基因型，靈敏度和特異度高達100%和99.46%，相比pharmigene公司的PG1502試劑盒有所提高。同時有效地減少假陽性使病人得到安全合理的治療。3.本檢測方法靈敏度高，僅需I至10納克DNA即可達到100%的檢測靈敏度。4.本檢測方法對部分降解的DNA也能進行有效的擴增。5.本檢測方法增加了 UDG酶防PCR污染體系，可以有效控制污染造成的假陽性問題。
圖1為HLA_B*1502第2、第3外顯子及中間內含子區段(虛線標出)，其中框出的
1、2、3、4、5、6區域標識出了序列比對得到的HLA-B*1502六個特異區段，其中核心特異堿基
位點是:特異區1:Gm，A132 T133 C136, C140 ;特異區 2 =A186, C188, C199 ;特異區 3 =G229, A238, C240,丁241，G244，G246 ;牛寸升區 4: T280 C281 j A282J T283J C284J G289J G290, A295, T296 ;牛寸升區 5:T336，G339, C346 ；特異區6:C465, T466, C467, C486, T4870其中本方法引物覆蓋第2號和第5號特異區段的核心區域，能夠擴增第2號和第5號特異區段之間的序列。圖2為用特異引物擴增HLA-B基因的電泳凝膠成像圖。其中三條分別為1.空白對照；2.HLA-B^l502陰性樣本；3為HLA_B*1502陽性樣本。第二個樣本(條帶3)中有兩條帶，一條HLA-B*1502特異條帶(430bp), —條內參對照條帶(219bp),而在第一個樣本(條帶2)中沒有特異條帶。圖3用特異引物擴增HLA-B基因的電泳凝膠成像圖部分樣本實驗結果示意圖，更清楚地展示實驗結果。表I為部分代表性HLA-B基因型與HLA_B*1502序列比對結果。表2為針對HLA_B*1502第2、3外顯子的6個特異區域設計的6個引物。表3為6個引物任取2個得到15組引物對，與HLA-B基因型進行序列比對得到的可能假陽性基因型。表4為本法引物名稱和序列。表5為199個樣本實驗結果，分別是本法檢測和測序方法檢測。
具體實施方式
實施例1.參照生產廠家的說明書提取受試者的全血、唾液或其他組織的基因組DNA。2.主要試劑:HLA-B*1502臨床試劑盒試劑。主要成分包括2XPCR Mix (Roche),dUTP, UDG 酶(Therm。Scientific)。3.反應體系及PCR程序。配置12μ IPCR反應體系:包括11 μ I試劑盒試劑，受試者樣品DNA I μ I(l-10ng)。PCR反應程序:先37° C恒溫孵育3min，再熱啟動95° C lOmin，I個循環；然后變性95° C20sec，延伸68° C 50sec，共40個循環；最后72° C 5min。4.PCR片段分離:2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電場強度不高于5V/cm，時間20_30min，凝膠成像系統成像。若有長度為430bp堿基的HLA-B*1502特異條帶和長度為219bp堿基的內參對照條帶，所測樣品為HLA-B*1502陽性，若只含有內參對照條帶，所測樣品則為HLA-B^l502 陰性，見圖 2。5.用ABI3730測序儀進行測序檢測。6.結果。通過對199個中國未知HLA_B*1502樣本進行單特異引物PCR-SSP分型，同時用ABI3730測序，得到的結果見表5。 靈敏度為100%，特異度為99.46%，其中一個假陽性為HLA-B*15:13，在中國人群中頻率極低。這一結果證實了本檢測方法的準確性及可行性。參考文獻:[1]中國癲癇診療指南(最終稿)
[2]曹志豪，駱肖群.卡馬西平誘發藥疹與HLA-B在漢族人群中的關系[J].醫學綜述，2011，17(6):923-924.[3]PeiChen, Ph.D., Jue1-Jueng Lin，M.D..Carbamazepine-1nduced Toxic Effectsand HLA-B^I502 Screening in Taiwan[J], The New England Journal of Medicine,2011， 364:1126-1133.[4]Choong-ChorChang,MRCP.Association of HLA_B*1502 allele withcarbamazepine-1nduced toxic epidermal necrolysis and Stevens - Johnsonsyndrome in the mult1-ethnic Malaysian population[J]，International Journal ofDermatology, 2011，50:221 - 224.[5]WichittraTassaneeyakulj Somsak Tiamka0.Association between HLA-B^1502and carbamazepine-1nduced severe cutaneous adverse drug reactions in a Thaipopulation[J]，Epilepsia,2010，51 (5):926 - 930.[6]PBrent Ferrell Jrj Howard L McLeod.Carbamazepine，HLA_B*1502 andrisk of Stevens - Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis: US FDArecommendations[R]，Pharmacogenomicsj2008，9(10):1543-1546.[7] S.Pozzij A.Longoj G.B.Ferrara.HLA-B locus sequence-based typing[J], Tissue Antigens, 1999，53 (3): 275-281.[8]M.Buncej G.C.Fanning.Comprehensive, serologically equivalent DNA typingfor HLA-B by PCR using sequence specfic primers (PCR-SSP)[J]，Tissue Antigens,1995,45:81-90.[9]L.Linj K.Tokunagaj H.Tanaka.Further molecular diversity in the HLA-B15group [J] ， Tissue Antigens， 1996，47:265-274.[10]http://www.pharmigene.com/genetic_tests/genetic_tests_1502.htm。
表1-1.不同HLA-B序列主要差異區域示意表(部分)
權利要求
1.一種HLA-B*1502特異位點的解析和PCR-SSP特異引物設計方法，其特征在于:通過對超過200個HLA-B等位基因的序列比對，得到HLA-B*1502的6個特異區域，它們位于HLA-B等位基因的第2和第3外顯子；然后根據這6個特異區域，設計PCR-SSP檢測的特異引物，具體操作步驟為: (1)收集IMGT/HLA數據庫的HLA-B，特別是HLA_B*15單體型的基因組、轉錄組的序列，找出HLA-B*1502的特異區域； (2)通過序列比對，得到HLA-B*1502基因第2和第3外顯子的6個特異區域:HLA-B*1502單體型的基因序列中第126至第140個堿基為第一特異區域，其序列為:CCGAGGATGGCGCCC,其中核心位點為 Gm，A132, T133, C136, C140 ;第 182 至第 199 個堿基為第二特異區域，其序列為:CCGGAACACACAGATCTC,其中核心位點為A186, C188, C199 ；第229至第246個堿基為第三特異區域，其序列為:￡CCTGCGGAAC￡IGC￡C￡，其中核心位點為G229, A238, C240, T241, G244, G246 ;第274至第296個堿基為第四特異區域，其序列為:CTCACATCATCCAGAGGATGTAT,其核心位點為 T28。，C281, A282 , T283, C284, G289, G290, A295, T296 ;第 331至第347個堿基為第五特異區域，其序列為:GCGGGIAT￡ACCAGT￡C，其核心位點為T336，G339,C346 ;第460至第487個堿基為第六特異區域，其序列為:AGCAGCTGAGAGCCTACCTGGAGGGCCT,其核;L1、似點為 C465，T466J C467J C486J T487 ； (3)依據上述特異區域設計引物，共6個，這些引物見表2所示；從這6個引物中，隨機組合出15對引物，通過序列比對，分別找出其可能造成假陽性的HLA-B基因型，選用其中可能假陽性數目較少即特異度較高的引物組進行特異性、靈敏度的比較實驗，篩選得一對高特異性、高靈敏度特異引物:B1502-SSP-F2和B1502-SSP-R5 ； 表2針對HLA-B ~k 1502特異區域設計引物
2.—種PCR-SSP法定性檢測HLA-B*1502基因的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)提取受試者血液或組織的基因組DNA； (2)以步驟(I)提取的受試者的基因組DNA為模板，在含檢測HLA-B*1502單特異引物及dUTP和UDG酶的PCR反應體系中進行PCR擴增；特異引物為B1502-SSP-F2和B1502-SSP-R5 ;內參引物為 B1502_iCTRL_F 和 B1502_iCTRL_R ； (3)擴增結束后，將擴增后的樣品在2%瓊脂糖凝膠孔中進行電泳分離，并進行判別:若有一條特異條帶和一條內參對照條帶，則表明所測樣品為HLA-B*1502陽性；若只含有內參對照條帶，則表明所測樣品為HLA-B*1502陰性；若無條帶，則表明DNA質量不合格，需要重新提取DNA進行檢測。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟⑵中，PCR反應體系為:11μ I試劑盒試劑，I μ I受試者樣品DNA =1-1Ongo
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟⑵中，PCR反應條件為:先37°C恒溫孵育3min，再熱啟動95°C lOmin，I個循環；然后變性95°C 20sec，延伸68°C 50sec，共40個循環；最后72 5min。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，電泳時間為20-30min，電場強度不高于5V/cm。
6.一種用于PCR-SSP法定性檢測HLA-B*1502基因的試劑盒，其特征在于:包含2 XPCRMix,內參引物 B1502-1CTRL-F 和 B1502_iCTRL_R、特異引物 B1502-SSP-F2 和B1502-SSP-R5、dUTP、UDG酶、雙蒸水及HLA_B*1502基因的陽性和陰性對照樣品。
7.根據權利要求6所述的可供10人次檢測的試劑盒，其特征在于，包含4管試劑，第一管為PCR Mix，包括2XPCR Mix，特異引物B1502-SSP-F2和B1502-SSP-R5,內參引物B1502-1CTRL-F 和 B1502_iCTRL_R，dUTP 和 UDG 酶，共 120 μ I ;第二管為雙蒸水 100 μ I ;第三管為HLA-B*1502陽性對照樣品12 μ I ;第四管為HLA_B*1502陰性對照樣品12 μ I。
全文摘要
本發明屬于生物技術領域，具體為一種PCR-SSP法定性檢測HLA-B*1502基因的方法及臨床檢測試劑盒。本發明方法包括找出6個能夠有效識別HLA-B*1502等位基因型的特異區域；設計覆蓋6個特異區域的6個特異引物，從中篩選高特異性的適用于PCR-SSP的引物對；反應體系中加入dUTP和UDG酶(尿嘧啶-DNA糖基化酶)，解決PCR交叉污染的問題，從而進一步提高了檢測的可靠性。據此研發HLA-B*1502快速簡便定性檢測試劑盒。本發明具有操作簡便、花費時間短、特異性強、準確性高及成本低等優點。適用于中國或亞洲人種中癲癇患者在服用卡馬西平和苯妥英鈉之前，通過HLA-B*1502基因型檢測，實現個體化安全合理用藥。
文檔編號C12Q1/68GK103114138SQ201310029230
公開日2013年5月22日 申請日期2013年1月27日 優先權日2013年1月27日
發明者徐劍鋒, 劉旭 申請人:復旦大學