專利名稱：：用于定性和定量檢測長度為大約8-50個核苷酸的短核酸序列的新方法
技術領域：
：本發明的新分析方法和檢測試劑盒專用于定性地和定量地檢測血清、組織樣品和其他基質中的短寡聚核酸，諸如反義寡核苷酸、硫代磷酸寡核芬酸和磷酸二酯寡核芬酸。本發明優選地涉及用于檢測和定量DNA寡核普酸和修飾的DNA寡核普酸的方法。該方法具有大約50fM(對于反義硫代磷酸寡核苷酸G3139以及磷酸二酯類似物均為0.3pg/ml)的檢出限(LOD)，對應于15〖il樣品體積(人血清)中絕對量為0.75阿托摩爾的靶寡核苷酸。定量限(LOQ)為100fM，并且該方法具有大約7個對數值(100fM-0.5pM)的精確定量的寬動態范圍。這些方法的特性優于所有已知用于尤其來自生物學樣品物質的短核酸序列的定量方法。本發明相對于其他已公開的寡核苷酸定量方法的主要優勢是較高的靈敏度、高特異性、良好的辨別力、高準確度和精確度、良好的可重復性和魯棒性、很寬的動態范圍、很低的樣品要求、沒有費事的樣品清潔步驟或樣品衍生化步驟、快速和容易的樣品處理、以及高通量能力。來自尤其是生物學樣品物質(血清、全血、組織等)的DNA寡核苷酸和修飾的DNA寡核苷酸的定量檢測是所述方法的關鍵特征。該方法基于實時PCR法，后者是用于核酸定量的常用現有技術。這些方法具有新穎系和創造性，將代替常規的分析方法如質譜測定法(MS)、毛細管凝膠電泳(CGE)、高效液相色譜法(HPLC)和雜交酶聯免疫吸附測定(ELISA)。
背景技術：
：細胞、血漿和組織中短雙鏈或單鏈寡聚核酸，包括反義寡核普酸、短干擾RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)的定量檢測變得越來越重要。對于作為藥理學工具和治療劑的反義寡核苷酸已經引起了特別的興趣。過去已5經開發了不同的技術和方法用于短寡核苷酸的定量以研究其治療用途、其在生物體液中的穩定性和靶專一性。在文獻中引用并且在已公開的專利申請中公開了許多檢測短核酸的方法。本發明相對于其他寡核苷酸定量方法的主要優勢是較高的靈敏度、高特異性、高準確度和精確度、很寬的動態范圍、快速和容易的樣品處理、以及高通量能力。來自尤其是生物學樣品物質的DNA寡核苷酸和修飾的DNA寡核苷酸的定量檢測是所述方法的關鍵特征。下面說明已公開的寡核苷酸定量方法，并將其與本發明進行比較。雜交測定在核酸雜交測定中，與靶核苷酸互補的寡核苷酸序列與固相共價結合，并且進行夾心雜交測定或竟爭測定用標記的示蹤寡核苷酸測定靶序列。用于定量生物體液和組織中的石克代磷酸寡核苷酸的方法由Temsamani等人，AnalBiochem.1993.215(1),p.54-58描述，在該方法中靶反義寡核苷酸被固定在尼龍膜上，并且使用互補示蹤寡核苷酸來定量被固定的分析物。所述的方法的缺點是溶劑提取步驟很繁瑣，顯示有15%的寡核苷酸損失，以及使用放射性標記的示蹤寡核苷酸。進一步描述了使用地高辛標記的示蹤寡核苷酸的替代化學發光檢測法，以避免放射性的處理風險。兩種方法均具有相似的靈敏度250pl血清中0.2pmol寡核苷酸(LOD=0.8nM)，而我們的發明顯示檢出限為15pl血清中0.75attomol寡核苷酸(LOD=50M)，其靈敏度增加了16'000倍。此外所述方法準確定量的動態范圍是大約1.5ng-50ng(2個對數值)，而本發明的動態范圍為8,5fg-50ng(大約7個對數值)。Overhoff等人,NucleicAcidsResearch2004.32(21),p.el70描述了使用32P標記的siRNA的有義鏈來定量siRNA。在siRNA和標記探針的液體雜交后，使用RNase消化去除未結合的探針，并且通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分析樣品，然后印跡在尼龍膜上并定量。此方法的缺點是使用放射性標記的寡核苷酸，并且提取和純化步驟很繁瑣。用于分析人組織中微小RNA表達鐠的寡核苷酸微陣列法由Barad等人，GenomeResearch2004.14(12),p.2486-2494描述。該方法基于DNA芯片(由AgilentTechnologies制備)，該芯片含有具有各種設置的60-mer寡核苷酸的已知人miRNA序列。用于雜交到芯片上的物質來源于來自人類細胞的適配子連接的、大小分級的RNA。擴增后，在3'適配子上帶有T7RNA聚合酶啟動子的雙鏈cDNA被用于標記反應。然后熒光標記的cRNA與微陣列雜交，并使用微陣列掃描儀進行分析。所述的DNA微陣列法可以實現人類組織中150個已知miRNA的表達譜。使用由Luminex開發的方法(Yang等人，GenomeResearch2001.11(11),p.l888-1898)來驗證由微陣列技術測量到的表達數據。該方法使用具有對各個微小RNA特異的序列的俘獲寡核苷酸和檢測寡核苷酸。俘獲寡核苷酸與顏色編碼珠(對于各種miRNA具有唯一的顏色)共價連接，而4僉測寡核苷酸用生物素標記。生物素用于在加入抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白并讀取與各顏色編碼珠相關聯的熒光后的檢觀']。兩種方法均為檢測微小RNA或miRNA的前體而專門設計，并且不能實現來自生物學樣品物質(血清、全血、組織等)的諸如反義寡核芬酸或適體的DNA寡核芬酸的檢測和定量，而這種DNA寡核苷酸的檢測和定量正是本發明的關鍵特征。而且，所述的芯片技術使用相對定量法來實現miRNA的表達譜，并且不能實現靶RNA的絕對定量。酶聯免疫吸附測定(ELISA)、竟爭、非竟爭、夾心Deverre等人,NucleicAcidsResearch1997.25(18),p.3584-3589開發了一種用于測定鼠的15mer反義磷酸二酯寡脫氧核糖核苷酸和硫代磷酸酯類似物的血漿濃度的酶竟爭雜交測定。此測定的原理涉及生物素化示蹤寡核苷酸和靶反義寡核苷酸和與聚笨乙烯微孔表面共價連接的固相固化的有義寡核普酸的竟爭性雜交。然后在與抗生蛋白鏈菌素-乙酰膽堿酯酶結合物反應后使用比色檢測法測定示蹤寡核苷酸。此方法的定量限為900pM，其靈每丈度比本發明的方法(LOQ=100fM)低9'000倍。竟爭性雜交測定由Boutet等人，BiochemBiophysResCommun.2000.268(1),p.92-98描述，該測定通過使用兩種不同的探針和熒光轉移方法來定量生物體液中的硫代磷酸寡核苷酸和磷酸二酯寡核苷酸而不用進行提取。用于血漿中硫代磷酸寡核苷酸和磷酸二酯寡核香酸的測定的靈敏度分別為800pM和200pM。本發明對于硫代磷酸寡核苷酸和磷酸二酯寡核苷酸的定量限均為100fM,靈敏度分別增加了8'000倍和2'000倍。Yu等人,AnalyticalBiochemistry2002.304(1),p.19-25描述了一種用于人血漿中反義硫代磷酸寡脫氧核糖核普酸的定量的非竟爭性雜交-連接異源性酶聯免疫吸附測定。該測定的原理基于反義靶寡核苷酸與固化的探針寡核香酸的異源性非竟爭性結合，隨后與熒光信號探針的連接。使用熒光微量滴定板讀數儀來進行檢測和定量。該方法在人血漿中的定量限為50pM，比本發明的靈敏度(LOQ=100fM)低500倍。此外，該方法的線性范圍為0.05nM-2nM(大約2個對數值)，而本發明的線性范圍為100fM-0.5(大約7個對數值)。Wei等人，PharmRes.2006.23(6),p.1251-1264描述了一種用于生物體液(血漿和細胞基質)中硫代磷酸寡核苷酸的定量的基于雜交的酶聯免疫吸附測定法。該方法基于硫代磷酸酯靶標與生物素標記的俘獲探針雜交，隨后與地高辛標記的檢測探針連接。然后通過使用比色檢測法通過抗地高辛堿性磷酸酶結合物來檢測結合的雙聯體。此測定的定量限為50pM，且線性范圍是0.05nM-10nM(大約2個對數值)，而本發明的方法的線性范圍為100fM-0.5(大約7個對數值)，并且靈敏度高500倍(本發明的LOQ=100iM)。Efler等人，Oligonucleotides2005,15(2),p.119-131描述了使用含有鎖核酸(LNA)的寡核苷酸探針來增加比色雜交測定的靈敏度和特異性。該測定的檢測限為2.8pg/ml或40阿托摩爾的靶寡核苷酸，并且線性范圍為7.8-1000pg/ml(大約2個對數值)。本發明的方法具有高55倍的靈敏度，檢測限為0.75阿托摩爾，并且具有大約7個對數值(0.6pg/ml-3pg/ml)的較寬的線性范圍。此外，此方法的血漿樣品要求(并且大多數其他的基于ELISA的方法)為100^1，而本發明的方法的樣品要求僅為15^1。毛細管^^電泳/UV-檢測毛細管凝膠電泳(CGE)是已建立的用于定量短核酸序列的技術，并且已被用作許多臨床試驗中的主要生物分析方法。CGE能從縮鏈代謝物(chain-shortenedmetabolite)中以良好的分離度分離母體化合物。在CGE分離后，最常使用在260nm處的UV-檢測，該檢測在血漿中的LOD值為70ng/ml。這種靈敏度足以檢測藥物代謝動力學行為，但不足以表4正血漿中寡核苷酸的末端消除相。本發明的方法滿足此種要求，具有高IOO'OOO倍的0.3pg/ml的血漿靈敏度。此外本發明不需要過多的提取方法以及繁瑣的樣品提純步驟或柱上衍生化步驟(on-columnderivatizationstep)以4是高靈敏度，如Sh肌g等人,ActaPharmcolSin.2004.25(6),p.801-806和Yu等人，DrugDiscovery&Development2004.7(2),p.195-203所述。質譜測定法另一種已建立的用于定量短核酸序列的技術是質譜測定法(MS)。說明了用于定量例如，反義寡核苷酸及其代謝物的不同方法。液相色譜前MS(Liquidchormatogr鄰hypriorMS)和串聯MS/MS法有助于定量血漿樣品中的寡核苷酸，但對于反義寡核苷酸檢測仍然需要固相提取步驟。Yu等人，DrugDiscovery&Development2004.7(2),p.195-203描述了一種用于血漿樣品的MS法，對于該方法，動態范圍為1-2000ng/ml，且柱上的LOD為100pg，相當于血漿中5ng/ml。與MS法相比，本發明具有高IO'OOO倍的靈敏度(LOD=0.0045pg，相當于血漿樣品中0.3pg/ml)以及為大約7個對數值(100fM-0.5[iM)的更大的準確定量的動態范圍。Dai等人，J.Chromatotogr.B.2005.825(2),p.201-213描述了一種用于人和大鼠血漿中硫代磷酸酯反義寡核苷酸的HPLC-MS/MS定量法，該方法的LOQ為17.6nM。本發明的LOQ為100對應于增加了IOO'OOO倍的靈敏度。Gilar等人，Oligonucleotides2003.13(4),p.229-243描述了一種串聯發光色譜-UV檢觀'j-MS法，該方法的估計LOQ為<1皮摩爾的柱上注射的寡核苷酸。本發明方法的LOQ為1.5阿托摩爾，其靈敏度高>5個數量級。可選的核酸定量方法進一步說明的核酸定量方法不能用于定量分析血漿和其他生物樣品9電活性雜交探針Jenkins等人,AnalChem.78(7),p.2314-2318描述了一種用于寡核苷酸定量的可選技術，該技術使用一次性使用電極的金表面上的混合單層電活性雜交探針。靶序列與二茂絡鐵標記的發夾探針的雜交減小了循環氧化還原電流，大概是從電極置換標記的緣故。證明定量限下降到幾乎為100fM，但此技術并未顯示能用于分析血漿樣品中的寡核苦酸，并且到目前為止不能用作標準定量生物分析方法。連接測定由Dilleetal在JournalofClinicalMicrobiology,1993,31(3),p.720-731中描述的連接測定顯示通過聚合酶鏈式反應擴增沙眼衣原體(a"mj^/aZrac/zowato)DNA，與通過連接酶鏈式反應(LCR)的擴增相比較。兩種擴增步驟均能夠一致地擴增與三種沙眼衣原體原生小體相當的數量的DNA。所有15種沙眼衣原體血清型均通過LCR被擴增至可檢測水平，并且通過LCR沒有從16種臨床標本中有可能發現的生物體或vMv鸚鵡熱衣原體(C//cw7少(i/a;w故acO禾口肺炎衣原體(C/z/"w少(i;.a/wew/wo"/fi^)中才廣i曾至iJDNA。脫氧核酶測定雙脫氧核酶連接酶由Tabor等人，NucleicAcidsResearch2006.34(8),p.21.66-2177設計制造，其中半脫氧核酶可被橋接寡核苷酸活化以執行連接反應。設計的脫氧核酶可通過雜交"讀"一條序列，然后通過連接作用"寫"一條單獨的序列來重新編碼核酸信息，然后該單獨序列可用作PCR擴增的模板。此技術并未顯示能用于定量分析血漿樣品中的寡核苷酸，并且到目前為止不能用作標準定量生物分析方法。DNA結合染色Gray等人，AntisenseNucleicAcidDrugDev.1997.7(3)p.133-140描述了單鏈DNA結合焚光基團OHGreen的應用，該熒光基團能定量牛、鼠和人血漿樣品種的寡核苷酸和類似物。據報道該方法的線性范圍為15-500nM。根據本發明的方法具有高150'000倍的靈敏度和大約7個對數值(100fM-0.5pM)的較寬的動態范圍。基于PCR的測定Raymond等人，RNA2005.11(11)p.1737-1744描述了微小RNA和短干擾RNA的基于PCR的定量分析法。該方法依賴于通過逆轉錄將RNA經引物延伸轉變為DNA,然后進行定量實時PCR。PCR反向引物中的LNA堿基增加了測定的性能。該測定允許在飛摩爾范圍內的測量，并且具有6-7個數量級的高動態范圍，其能與本發明的方法相比。此方法被設計用于定量短RNA分子，并且不能定量血漿樣品中的反義硫代磷酸寡核苷酸。其他用于微小RNA和短千擾RNA的定量分析的基于PCR的方法概述在WO2005/098029A2(EXIQONA/S[DK];JacobsenNana[DK]等人,20.10.2005)中。所述的方法使用與本發明完全不同的酶促反應步驟。一種方法基于引物延伸以及隨后使用特別需要RNA作為模板的逆轉錄酶的逆轉錄。然后反應產物與引物和實時PCR系統的檢測探針混合，并且^f皮用作PCR才莫板。該方法說明了單獨的RNA靶序列的檢測，但沒有說明通過使用逆轉錄酶酶促反應步驟來定量分析DNA靶序列或修飾的DNA寡核芬酸。本發明的方法優選地使用DNA聚合酶檢測并定量來自生物樣品的DNA序列，而不需要逆轉錄酶。所述的第二種方法基于連接兩個標記探針的連接反應，所述探針與靶核酸序列鄰近地雜交。然后連接酶產物與引物和實時PCR系統的檢測探針混合，并用作PCR模板。對于靶序列的可靠定量分析，此設置將需要去除未反應的標記探針，因為它們與具有互補序列的PCR引物雜交，會啟動第二次不需要的PCR反應(引物的延伸/標記探針雜交)。由此引起的PCR中各成分(引物、聚合酶、核苷酸)的竟爭導致很低的線性度、PCR效率和檢測限，阻礙了可靠的定量分析。由線性回歸分析計算的已報道的目標滴定曲線的斜率為-4.31，對應于71%的PCR效率，而我們的方法具有-3.67的斜率和至少87%的PCR效率(實施例1，表1)。此方法的LOD在pM范圍內，而本發明的LOD在fM范圍內，靈敏度高1000倍。未反應的標記探針的去除需要大量的純化步驟，由于回收率低這些步驟可進一步降低該方法的靈敏度。給定實施例中沒有一個顯示成功地將所述方法用于從尤其是生物樣品物質(血清、全血、組織等)中檢測核酸序列。在概述的實施例中，使用合成RNA寡核苷酸或高度純化的RNA作20為靶標，但沒有說明檢測復雜生物基質中的靶寡核苷酸，本發明為此被專門地i殳計。用于檢測小RNA序列的基于PCR的方法描述在US2006/003337Al(BrandisJohn[US]等人，05.01.2006)中。該方法基于兩個靶探針的RNA-模板連接，兩個靶探針與靶RNA序列鄰接地雜交。可應用使用靶4果針之一上的生物素親和標記任選地純化連接產物。通過實時PCR完成連4妄產物的片全測和定量。所述的方法專門地i殳計用于才全測RNA序列，而本發明優選地定量DNA靶序列和修飾的DNA寡核苷酸，而不使用連接測定和大量的清潔步驟。此外，該方法顯示有無模板對照(NTC)的高背景信號，減小了該方法的靈敏度。給定實施例中沒有一個顯示成功地將該方法用于從尤其是生物樣品物質(血清、全血、組織等)中定量DNA序列，而此是本發明的關鍵特征。在WO2006/012468A2(0S1EYETECHINC[US];ShimaDavidT.[US]等人，02.02.2006)中，說明了一種通過雙雜交檢測寡核苷酸的方法。此方法能定量檢測修飾的寡核苷酸包括反義寡核苷酸、適體、核酶和短干擾RNA(siRNA)。該方法基于連接反應，該連接反應將與靶適體序列鄰接地雜交的俘獲探針和檢測探針連接在一起。親和標記或磁珠與能夠純化連接反應產物的俘獲探針連接。然后使用實時PCR法定量連接產物。由于PCR系統靶向在檢測探針上，因此需要大量的清潔步驟來完全去除未連接的檢測探針，并且以便避免高背景信號。顯示的試驗數據證實了所述方法的此種缺陷。LOD在pM范圍內，而本發明的LOD在fM范圍(更每文感1000倍)內，而沒有大量的清潔步驟。WO2006/069584A(EXIQONA/S[DK];PlasterkRonald[NL]等人,06.07.2006)說明了用于檢測和定量微小RNA、其耙mRNA以及小干擾RNA和其他非編碼RNA的新寡核苷酸組合物和探針序列。該文件列舉了提供對其靶序列特異的探針的探針集合或文庫，這些靶序列是脊推動物微小RNA、斑馬魚miRNA、黑腹果蠅miRNA、秀麗隱桿線蟲miRNA、擬南芥miRNA、人miRNA、以及鼠miRNA。這些纟笨針或探針集合可廣泛i也用于RNA靶序列的定量分析或表達譜，但不能用于諸如來自尤其是生物樣品物質(血清、全血、組織等)的治療性DNA寡聚物、反義寡聚物或硫代^l酸寡聚物的DNA序列的定量分析，而此是本發明的關鍵特征。莖國環RT-PCR:Chen等人，NucleicAcidsResearch2005.33(20)p.1-9描述了通過莖-環RT-PCR實時定量微小RNA和其他小RNA。為了觸發RNA逆轉錄為cDNA中，該方法使用能形成莖-環結構的RT引物，并且顯示比線性方法更好的特異性和靈敏度。然后使用實時PCR測定完成cDNA的定量，其顯示7個數量級的動態范圍，與本發明相當。此基于PCR的方法設計用于定量純化的小RNA分子，并且不能用于定量血漿樣品中的反義硫代磷酸寡核苦酸，而這正是本發明的關鍵特征。等溫擴增Tan等人，AnalCliem.2005.77(24)p.7984-7992描述了檢測短DNA序列的等溫核酸擴增反應。該方法結合了基于DNA官能化金納米球的聚集的可視化比色讀數器。該反應由引發寡核苷酸(triggeroligonucletide)引發，該引發寡核苷酸被指數擴增，并轉化為能夠橋接兩組DNA官能化膠體金的通用型才艮告寡核普酸(universalreporteroligonucleotide)。該方法允i午在10分鐘內檢測100fM引發寡核香酸，但此技術并未顯示能用于分析例如血漿樣品中的硫代磷酸寡核苷酸，并且到目前為止不能用作標準定量生物分析方法。
發明內容本發明公開了一種定性和定量檢測樣品中的短目的核酸序列，優選DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核苷酸的方法，該方法包括將樣品與俘獲探針接觸；該俘獲探針包括與部分目的序列互補以便能夠與其雜交的部分，以及與目的序列不互補的部分；使用俘獲探針作為;f莫板，用核酸聚合酶使目的序列延伸；使用目的序列作為模板，用核酸聚合酶使俘獲探針延伸；以及^:用核酸擴增反應定性和定量地直4妄或間接;f全測已延伸的目的序列和已延伸的俘獲探針，以便指示目的序列的存在和含量；其特征在于用于核酸擴增的引物包括與目的序列的延伸片段和俘獲探針的延伸片段互補的部分，從而防止在缺少目的序列時的核酸擴增。該方法的檢出限為50fM(0.3pg/ml),對應于0.75阿托摩爾的靶分子，且動態范圍為大約7個對泰:值。圖la-lb顯示了本發明的方法的示意圖，包括(a)用于靶/探針延伸的核酸聚合酶反應以及(b)用于定量分析靶分子的實時PCR測定。在優選的實施方式中，本發明還解決了上述的所有迫切需要解決的技術問題。這可通過含有互補的靶特異區的寡核苷酸探針的雜交來完成，使得在目的靶序列的存在下，探針與互補的靶序列雜交。在第一個方面，本發明提供了用于定性和定量檢測短目的核酸靶序列的方法中的俘獲探針，其包括與部分目的序列互補以便能夠與其雜交的部分，以及與目的序列不互補的部分，靶序列的兩個未成對端和雜交的俘獲探針用作使用核酸聚合酶延伸的模板。靶鏈，優選DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核苷酸可包括目的序列中的核酸和/或核酸類似物(DNA、LNA、PNA、PTO、MGB、2'-MOE)，諸如反義寡核苷酸、高度碎化DNA(使得該方法可用于檢測和定量處理樣品中的種特異性序列)、或任意的其他長度為大約8-50個核苷酸的短核酸序列。俘獲探針與目的序列的雜交形成互補序列的核酸雙鏈體，具有非互補序列的兩個未成對端。俘獲探針優選地包括DNA、LNA(鎖核酸)或PNA(肽核酸)，但可包括RNA、MGB(小溝結合物，minorgroovebinder)、PTO(硫代磷酸寡核苷酸)、2'-MOE(2'-甲氧乙基)寡核苷酸、其他核酸類似物或其任意組合。LNA是一種合成核酸類似物，其摻入了"內橋接"核苷類似物。LNA的合成及其特性已由許多作者闡明Nielsenetal,(1997J.Chem.Soc.PerkinTrans.1,3423);Koshkinetal,(1998TetrahedronLetters39,4381);Singh&Wengel(1998Chem.Commun.1247);和Singhetal,(1998Chem.Commun.455)。當與DNA配對時，LNA顯示比常規DNA/DNA異型雙鏈更高的熱穩定性。然而，LNA可在常規核酸合成儀器上合成，而PNA則不能；當形成單鏈PNA/DNA嵌合體時，需要特殊的連接子來連接PNA和DNA。相反，LNA能夠簡單地通過常規技術與DNA分子連接。因此，在一些方面，對于在根據本發明的探針的應用，LNA優于PNA。具體地，俘獲探14針的靶特異區可包括LNA和/或其他核酸類似物，并且與目的序列不互補的區域包括DNA。在文獻中引用并且在已公開的歐洲和PCT專利申請中公開了許多核酸擴增方法。這樣的一種已知為聚合酶鏈式反應(PCR)的方法公開在美國專利第4,683,202號中，并且已在全世界被廣泛使用。PCR的發明已極大地提高了核酸檢測方法的靈敏度和特異性。PCR是一種用于擴增核酸的方法，并且涉及使用兩條核酸引物(寡核苷酸)、聚合試劑(例如，耐熱的DNA聚合酶)、靶核酸模板、三磷酸核苷，以及核酸變性、退火和引物延伸的連續循環以產生大量拷貝的具體核酸區段。使用此方法，單拷貝基因組DNA的區段可擴增超過1000萬倍，具有非常高的特異性和保真性。用于纟企測PCR產物的方法具體地描述在美國專利第4,683,195號中。這些方法需要能夠與被擴增的靶核酸雜交的寡核苷酸探針。許多試劑已—皮描述用于標記核酸以促進靶核酸的檢測。適當的標記可提供能通過熒光、放射性、比色法、X-線衍射或吸收、磁性或酶活性檢測得到的信號，并且包括，例如，熒光基團、發色基團、放射性同位素、電子致密試劑、酶、和具有特異結合伴侶的配體。美國專利第5,210，015號描述了一種替代的用于檢測擴增核酸的測定法。該方法采用核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性來從雜交的雙鏈體上切下退火的、標記的寡核苷酸，并且釋放標記的寡核苷酸片段用于檢測。該方法適合用于PCR產物的定量檢測，并且需要引物對和具有封閉的3'-OH末端的標記寡核苷酸探針以防止聚合酶導致的延伸。對于短核酸序列的檢測，PCR法的缺點在于需要用于擴增的模;板核酸序列長度的限制。最小長度由引物和應該不會重疊的探針退火序列以及兩者之間的序列的長度來決定。因此，需要具有至少50個堿基對的才莫板核酸序列，并且因此在小于50個堿基對的情況下不能使用。本發明致力于并且解決了基于PCR的方法的需求，能夠定性和定量檢測短核酸序列，優選長度大約在8-50個核香酸之間的DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核普酸(例如，反義寡核苷酸)。具體實施方式實施例實施例l:本發明的方法的線性檢測范圍為了確定使用本發明方法的準確定量的線性范圍，選擇反義^^代磷酸寡核香酸G3139(5'-3'序列TCTCCCAGCGTGCGCCAT)作為靶分子。使用自動吸液裝置(CAS1200,CorbettResearch)制備PTO的10倍系列稀釋液。稀釋液系列由IO個濃度水平組成，最高的寡聚物濃度為2pM。使用Klenow酶(大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段)進行核酸聚合酶反應。各個PTO濃度水平的15^1與5plKlenowmastermix混合。Klenow反應物的組成(終濃度)為0.5)iM俘獲探針(5'-3'序列TTTGGAGCCTGGGACGTGCTGGATACGACATGGCGCAC;粗體字母=鎖核酸石成基；Sigma-Proligo)、50dNTP混合物、lxKlenow反應緩沖液(Fermentas)、5單位Klenow酶(Fermentas)、10ng/fil人DNA和H20至20jxl的最終反應體積。反應物中G3139反義PTO的濃度為0.5-0.5fM。另外，制備沒有PTO的無模板對照。使用熱循環儀將Klenow反應物在37。C下孵育20分鐘。使用實時PCR完成Klenow反應物中靶分子的定量。5^1各1:10稀釋的Klenow反應物與15^1PCRmastermix混合。PCR反應物組成(終濃度)為0.5〖iM正向引物(5'-3'序列CCGTTCTCCCAGCGTGC)、0.5pM反向引物(5'-3'序列TTTGGAGCCTGGGACGTG)、0.2jxM探針(5'誦3'序列FAM-TGGATACGACATGGCGCA-MGB;AppliedBiosystems)、lxqPCRMasterMix(Eurogentec)和H20至20jxl的最終反應體積。在AB17900HT實時PCR熱循環儀(AppliedBiosystems)中使用下列的程序進行實時PCR:50°C下2分鐘，95°C下10分鐘，然后95。C下15秒、60°C下60秒進行50個循環。圖2顯示了使用10倍系列稀釋的作為模板的G3139反義硫代磷酸寡核普酸的核酸聚合酶反應的PCR擴增曲線。圖3顯示了實時PCR的線性回歸分析。表1列舉了實施例1的實時PCR數據。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>實施例2:血漿樣品的檢出限為了確定本發明方法的血漿中反義硫代磷酸寡核苷酸G3139的定量限，以10個步驟將PTO摻入人血漿至50pM-5flVT的終濃度。15j_il的各濃度水平與5jilKlenowmastermix混合，Klenowmastermix如實施例1中所述進行制備，但不添加人DNA(見實施例1)。另外，制備沒有PTO的血漿的無^^板對照。使用熱循環儀將Klenow反應物在37。C下孵育20分鐘。使用NucleoSpinExtractII(Macherey-Nagel)DNA純化試劑盒純化Klenow反應物。根據生產廠商的實驗方案完成提取。在100^1洗脫緩沖液中洗脫DNA。對于使用實時PCR對靶分子的定量，5^1的各洗脫物與15^1PCRmastermix(見實施例l)混合。在Rotorgene實時PCR熱循環儀(CorbettResearch)中使用下列的程序進行實時PCR:50。C下2分鐘，95°C下10分鐘，然后95。C下15秒、60°C下60秒進行50個循環。圖4顯示了使用摻入了G3139反義硫代磷酸寡核苷酸的人血漿作為模板的核酸聚合酶反應的PCR擴增曲線。表2列舉了實施例2的實時PCR數據。血漿中G3139PTO的濃度Ct值50pM24.095pM26.540,5pM28.8550fM(檢出限)30.385fiVI31.07NTC(無模板對照)31.3權利要求1.一種定性和定量檢測樣品中的短目的核酸序列，優選DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核苷酸的方法，所述方法包括(a)將所述樣品與俘獲探針接觸；其中所述俘獲探針包括與部分所述目的序列互補以便能夠與其雜交的部分，以及與所述目的序列不互補的部分；(b)使用所述俘獲探針作為模板，用核酸聚合酶使所述目的序列延伸；使用所述目的序列作為模板，用核酸聚合酶使所述俘獲探針延伸；以及(c)使用核酸擴增反應定性和定量地直接或間接檢測已延伸的目的序列和已延伸的俘獲探針，以便指示所述目的序列的存在和含量；其特征在于用于核酸擴增的引物包括與所述目的序列的延伸片段和所述俘獲探針的延伸片段互補的部分，從而防止在缺少所述目的序列時的核酸擴增。2.根據權利要求1所述的方法，其中所述目的序列的長度為大約8-50個核普酸。3.根據權利要求1所述的方法，其中所述目的序列包括DNA、PTO(硫代磷酸寡核苷酸)、2'-MOE(2'-甲氧乙基)寡核苷酸、LNA(鎖核酸)、MGB(小溝結合物)、PNA(狀核酸)、其他核酸類似物或其任意組合。4.根據權利要求l所述的方法，其中所述目的序列是單鏈分子、雙鏈分子或其任意組合。5.根據權利要求1所述的方法，其中所述俘獲探針包括DNA、PTO(硫代磷酸寡核苷酸)、r-MOE(2'-甲氧乙基)寡核苷酸、RNA、LNA(鎖核酸)、MGB(小溝結合物)、PNA(肽核酸)、其他核酸類似物或其任意組合。6.根據權利要求1所述的方法，其中所述俘獲探針的序列與所述目的序列的雜交形成所迷俘獲探針的未成對端。7.根據權利要求1所述的方法，其中所述俘獲探針的序列與所述目的序列的雜交形成所述目的序列的未成對端。8.根據權利要求1所述的方法，其中采用核酸聚合酶，使用所述俘獲探針的所述未成對端作為模板在等溫或熱反應中延伸所述目的序列。9.根據權利要求l所迷的方法，其中采用核酸聚合酶，使用所迷目的序列的所述未成對端作為模板在等溫或熱反應中延伸所述俘獲探針。10.根據權利要求1所述的方法，其中所述目的序列的延伸和所述俘獲探針的延伸導致形成適合引物退火的序列。11.根據權利要求1所述的方法，其中所述目的序列的延伸和/或所述俘獲探針的延伸導致形成具有核酶活性(連接酶-、核酸酶-或任何其他的催化活性)的核酸序列。12.根據權利要求10所述的方法，其中所述形成的用于引物退火的序列用于所述已延伸的目的序列和已延伸的俘獲探針的等溫或熱核酸擴增。13.根據權利要求12所述的方法，其中所述擴增方法用于直接地或間接地檢測所述合成的核酸序列。14.根據權利要求12所述的方法，其中用于核酸擴增的所述引物包括DNA、PTO(硫代磷酸寡核苷酸)、2'-MOE(2'-曱氧乙基)寡核苷酸、RNA、LNA(鎖核酸)、MGB(小溝結合物)或PNA(肽核酸)、其他核酸類似物或其任意組合。15.根據權利要求12所述的方法，其中使用核酸探針通過雜交檢測核酸擴增。16.根據權利要求12所述的方法，其中用于核酸擴增的所述探針包括DNA、PTO(硫代磷酸寡核苷酸)、2'-MOE(2'-甲氧乙基)寡核香酸、RNA、LNA(鎖核酸)、MGB(小溝結合物)、PNA(肽核酸)、其他核酸類似物、熒光標記或》t射標記或其^f壬意組合。17.根據權利要求12所述的方法，其中使用熒光染料檢測核酸擴增。18.根據權利要求1所述的方法，其中在固相表面俘獲由所述俘獲探針和/或所述目的序列的延伸直接或間接合成的核酸。19.一種用于定性和定量檢測短目的核酸序列，優選DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核苷酸的方法中的俘獲探針，其包括與部分所述目的序列互補以便能夠與其雜交的部分，以及與所述目的序列不互補的部分。20.根據權利要求19所述的俘獲探針在根據權利要求1所述的方法中的應用。21.用于定性和定量^r測短目的核酸序列，優選DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核苷酸的方法中的正向(上游-、5'-)引物，其包括與所述俘獲探針的延伸片段互補以便能夠與其雜交的部分。22.根據權利要求21所述的正向引物在根據權利要求l所述的方法中的應用。23.用于定性和定量檢測短目的核酸序列，優選DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核苷酸的方法中的反向(下游-、3'-)引物，其包括與所述目的序列的延伸片段互補以便能夠與其雜交的部分。24.根據權利要求23所述的反向引物在根據權利要求1所述的方法中的應用。25.用于定性和定量4全測短目的核酸序列，優選DNA寡核苷酸或4務飾的DNA寡核香酸的方法中的DNA探針，其包括與部分所述目的序列互補的部分以及與所述目的序列的延伸片段互補的部分以便能夠與其雜交。26.根據權利要求25所述的DNA探針在根據權利要求1所述的方法中的應用。27.用于定性和定量檢測樣品中短目的核酸序列，優選DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核苷酸的存在的試劑盒，所述試劑盒包括根據權利要求19所述的俘獲探針和適當的包裝材料。28.根據權利要求20、22、24和26所述的試劑盒，進一步包括用于實施權利要求1所述的方法的說明書。29.根據權利要求20、22、24和26所述的試劑盒，進一步包括下列的一種或多種核酸聚合酶；三磷酸核糖或脫氧核糖核酸(標記或未標記的)；標記試劑；檢測試劑；引物(標記或未標記的)；探針(標記或未標記的)；緩沖液。30.權利要求1所述的方法在如權利要求29所定義的短核酸序列，優選長度為大約8-50個核苷酸的DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核普酸的才全測中的應用。全文摘要本發明涉及用于從尤其是生物樣品材料中定性和定量檢測短核酸序列，優選DNA寡核苷酸或修飾的DNA寡核苷酸，諸如長度為大約8-50個核苷酸的反義寡核苷酸或片斷核酸序列的新分析方法。本發明涉及將修飾的核酸導入進能與靶序列雜交的寡核苷酸探針中，使得能夠進行短核酸序列的擴增和定量，并且增加反應的靈敏度和特異性。本發明還包括用于進行核酸擴增以檢測和定量短核酸序列的檢測試劑盒和用于制備該試劑盒的方法以及新分析方法的應用。文檔編號C12Q1/68GK101611153SQ200780045073公開日2009年12月23日申請日期2007年10月19日優先權日2006年10月21日發明者彼得·D·布洛德曼,拉爾夫·塞弗思,杜米尼克·摩爾申請人:拜奧里迪克斯公司