人類免疫缺陷病毒1型一步法熒光定量pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了人類免疫缺陷病毒1型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，試劑盒包括RT-PCR反應液、RT-PCR酶混合物、引物探針、陰性對照、強陽性對照、弱陽性對照、校準品1號~5號。本發明可對提取好的HIV-1RNA直接進行一步法熒光定量RT-PCR反應，檢測樣本中HIV-1RNA的病毒載量，并依靠內參基因作為內對照、利用UNG酶預防污染。本發明的試劑盒一步法擴增方法簡單、程序簡短、操作簡便、預防污染，檢測結果特異性強、敏感度高、結果明晰、可信度高，可用于血清中人類免疫缺陷病毒1型（HIV-1）RNA病毒載量檢測。
【專利說明】人類免疫缺陷病毒1型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明屬生物【技術領域】，涉及一種生物檢測技術，尤其涉及一種用于人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1) RNA熒光定量檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)是一種感染人類免疫系統細胞的慢病毒(Lentivirus),屬反轉錄病毒(Retrovirus)的一種。該病毒破壞人體的免疫功能，導致免疫系統的失去抵抗力，從而導致各種疾病病原體得以在人體內生存，發展到最后，導致艾滋病(即獲得性免疫缺陷綜合征，Acquired Immunodeficiency Syndrome,AIDS)，為一種至今無有效療法的致命性傳染病。自1981年在美國首次發現和確認以來，艾滋病已奪取超過3000萬人的性命，使它成為史上最具破壞力的全球性流行病之一，截至2011年5月底世界上約有6400萬人感染艾滋病毒，每天平均有7000宗新病例。目前，南亞和東南亞成為繼撒哈拉以南非洲之后的第二重災區。中國CDC估計，截止至2011年底，我國存活HIV攜帶者及艾滋病患者約78萬人，全年新發感染者4.8萬人，死亡2.8萬人。疫情已覆蓋全國所有省、自治區、直轄市，目前我國面臨艾滋病發病和死亡的高峰期，且已由吸毒、暗娼等高危人 群開始向一般人群擴散，防艾、抗艾形勢嚴峻。
[0003]HIV感染后病毒載量的變化與疾病的進程有密切的相關性，HIV病毒載量的檢測可以預測疾病發生、發展以及預后，因此，HIV病毒載量的檢測可以監控疾病的發展過程，并為制定相應的治療方案和策略提供依據；而且病毒載量較高的孕婦造成母嬰傳播的危險性較大，可根據病毒載量確定孕婦是否需服用抗病毒藥物來減少HIV的母嬰傳播。抗HIV病毒藥物的作用主要是抑制病毒的復制，降低病毒載量。因此，病毒載量的檢測對疾病的監控、預防母嬰傳播以及觀察抗病毒藥物的療效都具有重要的意義。
[0004]根據基因差異，可將HIV分為HIV-1型和HIV-2型。一般，HIV-1病毒是絕大多數HIV感染的病原體，HIV-2病毒主要出現在非洲，尤其是在西非地區。HIV-2的傳播方式與HIV-1相同，都會發生機會性感染和AIDS，但HIV-2所致的免疫缺陷發展得較為緩慢和溫和。不同地區流行的亞型不同，同一亞型在不同地區的流行態勢也存在一定差異。目前，世界范圍內流行的主要為HIV-1型。在美國，因為HIV-2較為少見，所以HIV-2未被列為常規檢測。中國境內流行的HIV主要為M組HIV-1型(目前境內尚未見HIV-1 N組和O組的報道，HIV-2型感染病例的報道極少)，其基因型主要為B/B’、BC重組型(包括CRF 07_BC重組型和CRF 08_BC重組型)以及AE重組型(CRF 01_AE重組型)。而且，HIV-1基因型具有一定的地域差異，不同的地區流行的HIV基因型也不盡相同，如CRF 07_BC重組型流行于四川、新疆等地，而CRF 08_BC重組型則流行于廣西等地。
[0005]目前，HIV的檢測方總體可分為抗體檢測和病毒檢測兩大類。病毒檢測包括細胞培養(病毒分離)、P24抗原檢測和病毒核酸檢測。早期對HIV的診斷主要是通過血清學試驗檢測抗HIV的抗體，間接地診斷HIV感染。近幾年，分子生物學方法不斷被應用到HIV的檢測中，HIV的實驗室診斷方法取得了很大的進展，核酸檢測已經成為了 HIV實驗室診斷的發展方向。
[0006]傳統的核酸檢測方法是采用核酸雜交技術對目的核酸進行檢測，雖然采用放射性標記的探針可以提高檢測的敏感性，但仍然偏低，不能滿足臨床需要。最近幾年核酸檢測技術發展迅速，主要是采用各種擴增放大技術提高檢測的靈敏度。隨著擴增技術的成熟，可以將低拷貝的靶序列成對數級放大擴增，同時采用比放射性探針更靈敏的非放射性檢測系統(如電化學發光系統等)，明顯提高核酸檢測的靈敏度，并減少放射性物質的污染。檢測HIV-1 RNA病毒載量的方法主要有分支DNA檢測(bDNA)、逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)和核酸序列擴增檢測(NASBA)等，其中，基于TaqMan探針技術的熒光定量RT-PCR方法已發展成為成熟、常用而有效的檢測手段。
[0007]TaqMan探針技術是高度特異的熒光定量PCR技術。TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團連接在探針的5’ -末端，淬滅基團在探針3’ -末端。當探針完整或與靶序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3’-端的淬滅基團接近而被淬滅，無熒光信號產生。在進行PCR反應延伸過程時，DNA聚合酶的5’ 一3’外切核酸酶活性將探針降解，使得熒光基團與淬滅基團分離，即產生熒光信號。每經歷一個PCR反應循環，就有一分子的擴增產物生成，并伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團信號不斷積累，為一個指數同步增長的過程，熒光信號的強度就代表了擴增產物的拷貝數。該技術具有特異性強、自動化程度高等特點、有效解決了 PCR污染等問題。HIV-1熒光定量檢測正是基于這種原理設計，為HIV-1早期感染診斷、大規模篩查、療效動態分析、新藥開發等提供良好的技術支持。目前，國際上HIV-1病毒載量試劑主要有以下幾種=COBASAmpliPrep / COBASTaqMan HIV-1 Test (Roche)、Abbott RealTime HIV-1 AmplificationKit (Abbott)>Versant HIV-1 RNA 3.0 (bDNA, Simens)、Roche Amplicor HIV-1 MonitorTest (Roche)、NucliSens HIV-1 QT (NASBA)和 NucliSens HIV-1 EasyQ (EasyQ)等。我國中山大學達安基因股份有限公司和凱杰生物工程(深圳)有限公司也研制出了 HIV-1核酸熒光定量診斷試劑，已獲國家生產許可。
[0008]同時為避免反應結果的假陰性，在反應體系中加入內參基因和內參探針。內參基因是含有與擴增基因中的探針序列不同慢病毒RNA序列，它帶有與HIV-1擴增基因序列引物特異結合的區域。內參基因通過HIV-1擴增基因上下游特異性引物結合并能產生相同長度(137 bp)的擴增產物，其堿基組成與HIV-1擴增基因序列一致。
[0009]同時利用UNG酶防污染的特性，在PCR擴增反應中用dUTP代替dTTP，這樣僅在擴增片段中含有dUTP ;而dUTP使污染的擴增子在擴增靶DNA前易于被UNG酶降解:這種含有dUTP的PCR產物與UNG酶一起孵育，因UDG酶可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵，可從單鏈或雙鏈DNA中消除dUTP而阻止Taq DNA聚合酶的延伸，從而失去被再擴增的能力。UNG酶在50°C以上即失去活性，這樣經過熱循環不會破壞病人HIV-1 RNA。UNG酶對不含dUTP的模板無任何影響，因此，反應體系中只有從HIV-1陽性病人樣本血清中提取的HIV-1 RNA因不被UNG酶降解而直接進行RT-PCR反應。
[0010]該技術通過對Hiv-1各基因型序列比對分析，獲得針對Hiv-1各基因型特異、通用引物及熒光探針，通過檢測各種HIV-1標準血清及臨床血清，確定該試劑盒的各種檢測指標，確定該試劑盒檢測的特異性、敏感性及檢測的最低拷貝數，為HIV-1的確診、大規模篩選、病情程度判斷、療效評價、新藥開發等提供一個方便、廉價的檢測手段。其關鍵技術為獲得針對各種HIV-1亞型及分離株的特異、敏感的通用引物及通用探針，制備高特異性、搞敏感性、重復性好的HIV-1熒光定量PCR檢測試劑盒。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的在于:提供一種精確簡便的用于人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA定量檢測的方法；另一目的在于提供一種用于該方法的試劑盒。
[0012]本發明的技術方案為:提供一種人類免疫缺陷病毒I型熒光定量檢測方法及試劑盒，采用一步法熒光定量PCR技術對人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA進行檢測。在使用上海星耀醫學科技發展有限公司柱法純化試劑(硅膠膜吸附法)對HIV-1陽性血清樣本進行核酸提取后，直接配制反應體系進行擴增，反應體系配制方便，擴增程序步驟簡便，擴增時間短，無需多次重復循環、防止產物污染。本發明方法操作簡便、敏感度高、結果明晰、可靠性高。
[0013]本發明提供的試劑盒包括=RT-PCR反應液、RT-PCR酶混合物、引物探針、陰性對照、強陽性對照、弱陽性對照、校準品I號飛號。本發明提供的試劑盒所檢測的核酸需通過使用上海星耀醫學科技發展有限公司柱法純化試劑(硅膠膜吸附法)對Hiv-1陽性血清樣本進行核酸提取，對提取好的HIV-1 RNA直接進行熒光定量RT-PCR檢測，其中所述的RT-PCR反應液為 Tris-HCl (ρΗ8.3) 20 mM、KCl 100 mM、明膠 0.2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.4 mM、MgCl2 6 mM的混合液；所述的酶混合物為逆轉錄酶、DNA聚合酶和UNG酶的混合物(逆轉錄酶3 U/ul, Taq DNA聚合酶2 U/ul，UNG酶I U/ul);所述的引物探針為一對HIV-1特異性引物、一條HIV-1特異性探針和一條內參探針的混合液(引物各6.25 uM，HIV-1特異性探針2.5 uM，內參探針2.5 uM);所述的陰性對照為無HIV-1 RNA的正常人血清；所述的強陽性對照為高濃度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述弱陽性對照為低濃度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述校準品I號~5號為已知濃度梯度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清。檢測用的HIV-1基因特異性引物分上游引物和下游引物:
上游引物序列〈SEQ ID N0.3)為:5’ -GGCTGTTGGAAATGTGG-3’ ；
下游引物序列(SEQ ID N0.4)為:5，-GCTGTTGGCTCTGGTCTG-3，；
HIV-1 特異性探針序列〈SEQ ID N0.5〉為:5’ -FAM-AATTCCCCGGCCTTCCTTTG
TTG-TAMRA-3，；
內參特異性探針序列〈SEQ ID N0.6)為:5’-JOE-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTG-TAMRA-3，。
[0014]本發明提供的試劑保存于_20°C，盡量減少反復凍融。
[0015]本發明試劑盒使用方法:
每次檢測均應設立陰性對照、強陽性對照、弱陽性對照和校準品I號飛號。擴增檢測方法如下:
a、按反應樣本數(反應樣本數=待檢樣品數+對照品3個+校準品5個+l)n配制反應液:取RT-PCR反應液η X 12.5 μL、引物探針ηΧ2 μ 1、RT_PCR酶混合物ηΧΟ.5 μL于一離心管中混勻；低速離心數秒，按15 μ I/管分裝到反應管中；
b、取樣本提取物、對照品提取物、校準品提取物各10μI分別加入反應管中，低速離心數秒，取出置全自動熒光PCR儀上；
C、反應程序為:37°C反應10 min，50°C反應15 min，然后95°C保溫2 min，再按94°C10 s — 60°C 45 s，循環45次，并于60°C分別采集FAM、JOE熒光通道的信號；
d、儀器PCR程序運行完成后按儀器及軟件要求進行結果保存和數據分析。以取高于樣本噪聲線和陰性對照的熒光值作為檢測閾值；同時確定每個樣本反應管中，內參基因檢出Ct值在30-32范圍之內，避免檢測結果的假陰性；分析軟件自動結合標準曲線計算各樣品提取物的HIV-1 RNA含量C (IU/ml)。
[0016]本發明方法原理是基于TaqMan水解探針熒光PCR原理，以病毒HIV-1 RNA為模板，采用病毒基因組特異性引物探針，輔以逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶和UNG酶，經一步法熒光RT-PCR實驗，可快速、準確對人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1) RNA模板進行分析；從逆轉錄到熒光PCR，一步即可完成，可有效的防止多重操作污染。所以，本發明的檢測方法及試劑盒特異性強、敏感度高、操作簡便、結果明晰、可靠性高，可用于血清中人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA的定量檢測。
【具體實施方式】
[0017]實施例1 一種人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒。
[0018]1.人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1) RNA的提取
使用上海星耀醫學科技發展有限公司柱法純化試劑(硅膠膜吸附法)對HIV-1陽性血清樣本進行核酸提取。
[0019]2.逆轉錄及熒光定量PCR擴增(每人份25ul體系)
【權利要求】
1.一種人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:本發明通過考察人類免疫缺陷病毒I型基因組全序列，并對檢索所得Hiv-1各個基因型一致性保守序列，根據該保守序列設計出一對HIV-1特異性引物、一條HIV-1特異性熒光探針和一條內參探針，采用實時熒光定量PCR方法擴增目的基因。
2.權利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:人類免疫缺陷病毒I型(HIV-1)RNA特異性PCR擴增的基因序列和內參基因序列分別為:
(SEQ ID N0.1)
5’ -GGCTGTTGGAAATGTGGCAAGGAAGGACACCAAATGAAAGAKTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAAATCTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTTCTTCAGAACAGACCAGAGCCAACAGC-3’，
(SEQ ID N0.2)
5’ -GGCTGTTGGAAATGTGGCAAGGAAGGACACCAAATGAAAGAKTGTACTGAGAGACAGGCTAATTTTTTAGGGAAAATCTGGCCTTCCACCAATTGGTTCCTCTCTGGTGTTCTTCAGAACAGACCAGAGCCAACAGC-3’， 人類免疫缺陷病毒I型熒光定量檢測試劑盒擴增基因序列全長137 bp，屬HIV-1 gag結構基因區，為單拷貝序列；內參基因序列全長137 bp，僅與擴增基因中的探針序列有所不同。
3.如權利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，一對HIV-1特異性引物序列中的一條序列與SEQ ID N0.1中所示的序列相同，另一條序列與SEQID N0.1中所示的序列互補；HIV-1特異性探針與SEQ ID N0.1中所示的序列互補:其中，所述的一對HIV-1特異性引物，其序列可以選自SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4，
(SEQ ID N0.3〉為:5’ -GGCTGTTGGAAATGTGG-3’，
(SEQ ID N0.4)為:5，-GCTGTTGGCTCTGGTCTG-3，； 一對HIV-1特異性引物序列也可以是上述序列向前或向后延伸10~20個核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的HIV-1特異性探針，可以選自SEQ ID N0.5的序列，(SEQ ID N0.5)為:5’ -FAM-AATTCCCCGGCCTTCCTTTGTTG-TAMRA-3’， 其中探針5’ -端標記FAM熒光基團，探針3’ -端均標記淬滅基團；HIV-1基因片段特異性探針序列也可以是上述序列向前或向后延伸10~20個核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上；所述的內參探針，可以選自SEQ ID N0.6的序列，〈SEQ ID N0.6)為:5’ -JOE-CCACCAATTGGTTCCTCTCTGTG-TAMRA-3’，其中探針 5’ -端標記 JOE 熒光基團，探針3’-端均標記淬滅基團；內參基因序列也可以是上述序列向前或向后延伸10-20個核苷酸的序列，或者和上述序列同源性大于85%以上。
4.如權利要求1所述的人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:試劑盒包括以下成分=RT-PCR反應液、RT-PCR酶混合物、引物探針、陰性對照、強陽性對照、弱陽性對照、校準品I號飛號:其中，所述的RT-PCR反應液為Tris-HCl (ρΗ8.3)20 mM、KCl 100 禮、明膠0.2 mg/ml、dATP、dGTP、dCTP、dUTP 各 0.4 mM、MgC12 6 mM 的混合液；所述的酶混合物為逆轉錄酶、Taq DNA聚合酶和UNG酶的混合物(逆轉錄酶3 U/ul，TaqDNA聚合酶2 U/ul，UNG酶I U/ul);所述的引物探針為一對HIV-1特異性引物、一條HIV-1特異性探針和一條內參探針的混合液(引物各6.25 uM，HIV-1特異性探針2.5 uM，內參探針2.5 uM);所述的陰性對照為無HIV-1 RNA的正常人血清；所述的強陽性對照為高濃度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述弱陽性對照為低濃度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清；所述校準品I號飛號為已知濃度梯度的含有HIV-1基因片段的慢病毒的人血清。
5.如權利要求1中所述的人類免疫缺陷病毒I型一步法熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述的RT-PCR反應液的配制和擴增程序如下: a、一步法熒光定量RT-PCR反應液的配制: 將RT-PCR反應液 、RT-PCR酶混合物、引物探針按照12.5: 0.5: 2的比例混合，反應液體積為25 ul ； b、一步法熒光定量PCR反應程序: [1]370C10 min [2]50 0C15 min [3]95 0C2 min [4]94 0C10 s [5]60 0C45 s
[6]Go to [4] ,45 cycles
在第五步采集FAM和JOE通道熒光信號， [7]End。
【文檔編號】C12Q1/70GK103966356SQ201310029521
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2013年1月25日 優先權日:2013年1月25日
【發明者】遲大利, 吳大治, 夏懿 申請人:上海星耀醫學科技發展有限公司, 上海復星醫藥（集團）股份有限公司