專利名稱：一種促生抑菌解淀粉芽孢桿菌、調理劑制備方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于微生物在農業方面應用技術，主要涉及解淀粉芽孢桿菌調理劑制備方法及其應用。
背景技術：
隨著設施農業的快速發展，連作和大量使用化肥農藥，使設施土壤養分失衡，土壤酸化，土傳病害頻繁發生，嚴重制約了設施生產的可持續發展。目前，針對設施生產中土壤修復、植病防控已有多種應用微生物生產的制劑，如:CN100999667公開了一種設施菜地土壤改良劑及其制備方法與應用，強調作為土壤改良劑，菌劑中菌種的配比和固體菌劑載體的配比，菌劑單獨發酵活菌數僅為10億/ml。CN101948771A公開了防病促生植物內生解淀粉芽孢桿菌及其應用，強調在NYD培養液中可獲得菌數20 40億/ml發酵液，有2種抗菌物質，菌液稀釋50倍，處理水稻種子，對水稻惡苗病溫室防效達到84.6%以上。上述兩種制劑中，前者發酵液菌數偏低，用量和成本必然加大；后者處理種子用濃度也較高，用量和成本也不低。如果能將發酵菌液的活菌數和活性提高，減少使用量，降低生產成本，將大大節約能源和資源，利國利民。
發明內容
本發明的目的是提供一種解淀粉芽孢桿菌制備的促生抑菌調理劑，該調理劑制備所用材料成本低廉，發酵產物效價高；并且產生多種促生抑菌物質。該調理劑可以在土壤和植物體內定殖；對多種植物土傳真菌性病害具有良好的防控效果和明顯的促生長作用。該調理劑的生產使廢棄物資源化，生產工藝簡單，無“三廢”排出；減少或替代化學農藥的使用，安全無毒，屬環境友好型制劑，符合生態農業和可持續農業發展的需求。為實現上述本發明的目的，本發明的技術方案是:1.本發明為一株解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amy loliquefaciens.sp)Pb-4(T4, 4),菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址:中國，北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵政編碼:100101，保藏編號為CGMCCN0.7155，保藏日期為2013年I月18日。解淀粉芽孢桿菌的獲得過程與特征解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)獲得過程:該菌株是本發明人從太原市小店區永昌乳業奶牛養殖場的牛糞中分離獲得的。其分離過程:采集新鮮牛糞，稱取糞樣10g，放置在裝有玻璃珠的90ml無菌水中，劇烈振蕩10分鐘，靜置5分鐘。吸取牛糞稀釋液20ul，滴入馬鈴薯葡萄糖(PDA)瓊脂平板上，距離平板中央2.3cm處，3個直徑4mm無菌濾紙片上。然后在平板中央接種番茄枯萎病病原真菌。置28°C恒溫培養5d，逐日觀察記載抑菌效果。挑選抑菌明顯的濾紙周圍單菌落若干。按上述步驟，逐個驗證其抑菌效果。選抑菌效果最佳的菌株，反復純化后，保存 于液體石蠟斜面試管中。菌體形態特征:解淀粉芽孢桿菌PB_4(T4，4)為革蘭氏陽性菌，好氧生長，桿狀，長為3.0 μ m 3.3 μ m，寬為1.0 μ m 1.2 μ m，內生芽孢，有鞭毛；在肉汁瓊脂培養基上形成乳白色菌落，皺褶，邊緣不整齊。經16SrDNA同源性系列分析:在GenBank數據庫中比對結果顯示，PB-4(T4，4)菌株屬于芽孢桿菌屬；與解淀粉芽孢桿菌聚為一群，具有98%、99%的相似性，確定PB-4 (T4, 4)菌株為解淀粉芽孢桿菌。菌株生理生化反應:解淀粉芽孢桿菌PB-4CT4，4)葡萄糖發酵實驗陽性、淀粉水解實驗陽性、明膠液化實驗陽性、V.P反應陽性、接觸酶反應陽性、甲基紅反應陽性、硝酸鹽還原實驗陽性、朽1檬酸鹽利用陽性；可在pH值為6.0 9.0生長,適宜生長溫度為25 39°C。PB-4 (T4, 4)培養物，經121°C高壓滅菌IOmin和100°C恒溫水浴IOmin,相對未經熱處理的培養物，仍有80%以上的抑菌活性。2.本發明提供解淀粉芽孢桿菌PB-4CT4，4)調理劑的制備方法(I)菌種活化:取液體石蠟中冷藏保存的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)，劃線接種于蛋白胨15g、酵母膏5g、葡萄糖5g、瓊脂斜面培養基(PYJ)上，28 36°C培養30 48h，連續轉管2次使菌種得到活化。備用。(2)種子液培養:將活化菌種接種于裝有IOOmlPYJ培養液的250ml三角瓶中，30 35°C，150 200r/min，恒溫培養15 20h作為種子液。備用。(3)液體調理劑的制備用豆制品廢水“黃漿水”做水相:將種子液2 5ml接入“黃漿水”液體(HYW)發酵培養基中。培養基組分:“黃漿水” 100ml，加入I 4g玉米粉、硫酸銨0.5 2g，碳酸鈣I 1.5g，硫酸亞鐵0.2 0.3g。150 200r/min，30 36°C發酵24 48h，可獲得活菌數達2 5*109cfu/ml的解淀粉芽孢桿菌PB_4(T4，4)培養物。即為液體調理劑。(3)固體調理劑的制備用各種廉價易得的農副產品做發酵料:將種子液3 IOmL接入固體發酵料中。發酵料組分:豆皮粉:30 33°C g，麩皮25 30g，谷殼5 10g，豆餅粉5 10g，玉米粉12 20 g，含水量20 30% ；30 36°C靜止培養50 72h，可獲得活菌數彡4*109cfu/g.干基培養物。即為固體調理劑。3.本發明提供解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)調理劑的應用效果(I)浸種解淀粉芽孢桿菌PB_4(T4，4)液體調理劑，浸泡番茄種子試驗表明，10，000倍液可使種子發芽率達92.2%，比清水對照高7個百分點，且芽長、健壯。(2)盆栽解淀粉芽孢桿菌PB_4(T4，4)液體調理劑T4_l (100倍液)，用于番茄連作枯萎病嚴重的病土。栽培60天時調查，調理劑Τ4-1和化學農藥(D)的防控效果分別是85.72%和83.33% ;在生產實踐中，調理劑Τ4-1 (100倍液)，即可明顯控制番茄枯萎病發病，可以替代化學農藥；若苗期再灌根一次，防控率會更高。(3)穴施灌根解淀粉芽孢桿菌ΡΒ-4(Τ4，4)調理劑，當番茄苗高20 25cm移栽定植時，每穴施入PB-4 (T4, 4) 10倍稀釋劑2g ;定植后45天，用PB-4 (T4, 4)調理劑500倍液20ml灌根。使大棚番茄枯萎病發病株率控制在8%以下。(4)噴施當番茄生長高達180cm以上晚疫病嚴重發生時，每株噴施PB_4 (T4，4)液體調理劑100倍液15ml，3天噴一次，連續噴施3次，番茄晚疫病的防控率高達97%，比化學農藥代森錳鋅+葉面肥防治率為80%高出17個百分點。從植株生長和構成產量的相關因素看，調理劑有明顯的促生長效果。本發明的實質性特點和顯著效果是:
1、本發明促生抑菌防病解淀粉芽孢桿菌PB-4 (T4, 4)，是從牛糞中分離獲得的革蘭氏陽性菌。具有在種植番茄的土壤和番茄根、莖部定殖的能力，是一株極具有開發應用價值的生防菌株。2、本發明解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)，同時產生抗菌蛋白、酶和抗菌素3類促生、抑菌物質，具有促生防病、抑菌譜廣等多重功效；3、本發明解淀粉芽孢桿菌PB_4(T4，4)調理劑，用豆制品廢水和農副產品下腳料生產，原料易得，成本低廉，無“三廢排出”，可批量生產和推廣應用；4、本發明解淀粉芽孢桿菌PB_4(T4，4)調理劑，可用于番茄育苗基質中，移栽時穴施、苗期灌根，番茄枯萎病防效達到92%以上；對溫室番茄晚疫病的防控率也高達97.8%；對黃瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌等多種植物病原真菌具有較高抑菌防病效果；可減少或替代化學農藥，有利于保護農田生態環境，適合于我國無公害農產品生產的要求。
具體實施方式
: 一、本實施方式中解淀粉芽孢桿菌PB_4(T4，4)菌株特征1.本發明為一株解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amy loliquefaciens.sp)Pb-4(T4, 4)，菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址:中國，北京市朝陽區北辰西路I號院3號，郵政編碼:100101，保藏編號為CGMCC N0.7155，保藏日期為2013年I月18日。2.解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)是從太原市小店區永昌乳業奶牛養殖場的牛糞中分離獲得的。解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)為革蘭氏陽性菌，好氧生長，桿狀，長為3.0 μ m 3.3μπ ，寬為LOyn! 1.2μπ ，內生芽孢，有鞭毛；在肉汁瓊脂培養基上形成乳白色菌落，皺褶，邊緣不整齊。經16SrDNA同源性系列分析:在GenBank數據庫中比對結果顯示，PB-4 (T4, 4)菌株屬于芽孢桿菌屬；與解淀粉芽孢桿菌聚為一群，具有98%、99%的相似性，確定PB-4 (T4, 4)菌株為解淀粉芽孢桿菌。解淀粉芽孢桿菌PB_4(T4，4)葡萄糖發酵實驗陽性、淀粉水解實驗陽性、明膠液化實驗陽性、V.P反應陽性、接觸酶反應陽性、甲基紅反應陽性、硝酸鹽還原實驗陽性、檸檬酸鹽利用陽性；可在pH值為6.0 9.0生長，適宜生長溫度為25 39°C。PB_4(T4，4)培養物，經121°C高壓滅菌IOmin和100°C恒溫水浴IOmin,相對未經熱處理的培養物，仍有80%以上的抑菌活性。二、本實施方式中解淀粉芽孢桿菌PB_4(T4，4)調理劑的制備方法1.菌種活化取液體石蠟中冷藏保存的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)，劃線接種于蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、瓊脂斜面培養基(PYJ)上，28 35°C培養30 48h，連續轉管2次使菌種得到活化。2.種子液制備將活化的菌種，接種于裝有IOOmlPYJ培養液的250ml三角瓶中，30 35°C，150 200r/min，恒溫培養15 20h作為種子液。3.液體調理劑制備采用太原市知名企業“六味齋”豆制品加工廠的廢水一黃漿水，做液體調理劑發酵的水相,其主要的化學性質見表I表I太原市“六味齋”豆制品廠黃漿水測定結果
權利要求
1.一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens sp.) Pb_4(T4, 4),菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；地址:中國，北京，郵政編碼:100101，保藏編號為CGMCC N0.7155，保藏日期為2013年I月18日。
2.如權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)，其特征在于:用于植物的促生抑菌防病。
3.如權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)的液體調理劑制備方法，其特征在于: (1)取液體石蠟中冷藏保存的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)，劃線接種于蛋白胨、酵母膏、葡萄糖、瓊脂斜面培養基上，28 36°C培養30 48h，連續轉管2次使菌種得到活化； (2)將活化菌種接種于裝有IOOmlPYJ培養液的250ml三角瓶中，30 36°C，150 200r/min，恒溫培養15 20h作為種子液； (3)將種子液接種于以“黃漿水”為液體，加玉米粉和微量元素發酵培養基中，150 200r/min, 30 36°C發酵24 72h，能夠獲得活菌數達2 5*109cfu/ml的解淀粉芽孢桿菌PB-4 (T4，4)液體培養物，該液體培養物為液體調理劑；其中:取“黃漿水”100ml，其余的組分按重量為:玉米粉I 4g,微量元素1.7 3.8g ; (4)接種量2 5ml。
4.如權利要求1所述的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4, 4)的固體調理劑制備方法，其特征在于: (1)將種子液接于農副產品下腳料的固體發酵料中，30 36°C靜止培養50 72h，獲得活菌數> 4*109cfu/g的干基培養物，其干基培養物為固體調理劑；其中:各種原料的組分按重量為: 豆皮粉:30 33g，麩皮25 30g，谷殼5 10g，豆餅粉5 10g，玉米粉12 20g ； (2)接種量3 10%，含水量20 30%；30 36°C靜止培養50 72h，可獲得活菌數彡4*109cfu/g.干基培養物，即為固體調理劑。
5.如權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)，所述的用于植物的促生抑菌防病，其特征在于:浸種，解淀粉芽孢桿菌PB-4 (T4，4)液體調理劑，10，000倍液，適用于種子的發芽促生。
6.如權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)，所述的用于植物的促生抑菌防病，其特征在于:盆栽，解淀粉芽孢桿菌PB-4液體調理劑，100倍液；適用于番茄連作枯萎病嚴重的病土的抑菌防病。
7.如權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)，所述的用于植物的促生抑菌防病，其特征在于:穴施灌根，解淀粉芽孢桿菌PB-4 (T4, 4)調理劑，當番茄苗高20 25cm移栽定植時，每穴施入解淀粉芽孢桿菌PB-4 (T4, 4)10倍稀釋劑2g ;定植后45天，用解淀粉芽孢桿菌PB-4 (T4, 4)調理劑500倍液20ml灌根，適用于番茄枯萎病發病控制。
8.如權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌PB-4(T4，4)，所述的用于植物的促生抑菌防病，其特征在于:噴施，當番茄生長高達180cm以上晚疫病嚴重發生時，每株噴施解淀粉芽孢桿菌PB-4 (T4, 4)液體調理劑100倍液15ml，3天噴一次，連續噴施3次，適用于番茄晚疫病的防控。
全文摘要
本發明涉及一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens sp.)Pb-4(T4,4)、調理劑制備方法及應用。菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.7155，保藏日期為2013年1月18日；該菌株對番茄等作物有明顯促生抑菌防病作用；該菌能在土壤和植株體內定殖。該調理劑制作方法是用豆制品廢水等液體培養，大豆莢皮粉等固體發酵，培養物活菌高達4ⅹ109cfu/ml和5ⅹ109cfu/g，且含抗菌蛋白、酶和抗菌素3類促生抑菌物質。本發明使豆制品廢水的廢棄物資源化，成本低，適宜工廠化生產；減少或替代化學農藥，安全無毒，符合生態農業和可持續農業發展的需求。
文檔編號C12R1/07GK103074287SQ201310032838
公開日2013年5月1日 申請日期2013年1月28日 優先權日2013年1月28日
發明者龐金梅, 焦曉燕, 武愛蓮, 梁改梅 申請人:山西省農業科學院農業環境與資源研究所