專利名稱：一種產表面活性劑的烴降解菌的改良方法
技術領域：
本發明涉及一種產表面活性劑的烴降解菌的誘變改良方法，屬于環境生物工程和環境微生物技術領域。
背景技術：
石油污染問題引起了人們越來越多的關注。石油污染環境的修復有物理、化學和生物修復等三種方法。微生物修復技術是生物修復中最重要、最核心的組成部分，具有成本低、應用方法簡單、污染物氧化完全、無二次污染、可原位處理、不需大型設備等優點，日前引起重視，每年新發表公布的論文成果層出不窮。微生物修復的關鍵技術是選用高效的石油烴降解菌株。修復工作中應用的烴降解菌株的獲得目前多局限于天然分離和篩選，主要在被石油污染的水環境和土壤環境中采樣。由于野外環境復雜惡劣，用于烴污染修復的天然分離的菌株往往滿足不了要求。因此篩選和改良烴降解菌就顯得至關重要。其中方法之一是用基因工程的手段，對天然降解性質粒進行轉移來構建新功能菌株，但此種方法需要較高的技術條件，同時工程菌的在環境中的釋放和應用受到嚴格的限制；另一種方法是用物理的、化學的和生物的方法進行誘變，目前多用紫外線和Y射線進行誘變，效果有限。尋找更有效的誘變源，就成為解決問題的關鍵之一。各種電離和非電離輻射是較常用的誘變源，低能離子束是一種新型、高效的電離輻射誘變源，而紫外線則一種經典的非電離輻射誘變源。低能離子束誘變育種需要較昂貴的專用儀器設備，且維護費用較高，在一定程度上影響了其發展應用。紫外誘變操作簡單，成本低廉，效果較好，因此應用廣泛。以上兩種物理誘變劑各有優缺點，應結合應用。但將二者結合應用的報道很少。
`
平板篩選是誘變育種程序中最重要的一環，高效的平板初篩方法，對提高篩選效率、降低篩選勞動強度具有積極意義。但產表面活性劑的烴降解菌如何進行進行篩選，以獲得表面活性劑發酵產量與烴降解效率的同步提高，沒有權威報道，血平板和油平板制作技術要求高，成功率低，已有文獻均報道不詳。
發明內容
本發明提供一種產表面活性劑的烴降解菌的改良方法，具體步驟如下:(I)菌種活化:取保藏菌種的甘油管，加入含有50mL肉胨培養基的250mL搖瓶中，30°C振蕩培養1-2天，直到培養出現明顯的渾濁為止；(2)平板培養:取搖瓶培養物以10倍稀釋法稀釋成KT1-KT6,取適宜稀釋倍數的菌液涂布于肉胨平板；(3)斜面培養:平板培養后檢查菌落的一致性，確定為純培養后，接種于肉胨斜面(采用15mL試管配制)，30°C條件下培養1_2天，至斜面找出菌苔為止；(4)制作菌懸液:取新培養的斜面，加入無菌生理鹽水(0.86% )5mL，振蕩1_5分鐘，使菌苔中的菌體脫落成菌懸液；
(5)涂布菌懸液:在超凈工作臺中，取上述0.1mL菌懸液，添加于滅菌的90mm培養皿下蓋中，用涂布棒涂勻；(6)制作菌膜:在超凈工作臺中，打開培養皿上蓋，開無菌風吹5-10min，至培養皿下蓋中無水珠為止，使之形成干燥的菌膜，吹風時間過短菌膜不干，易在下一步的離子束注入過程中不易形成真空環境，影響離子束誘變效果，吹風時間也不宜過長，容易造成自然對照和真空對照菌落過少，不易統計相對存活率；(7)離子束注入:吹干形成菌膜后，合上培養皿，立刻將培養皿置離子束注入機小靶室中，取出上蓋，封閉小靶室，抽真空至一定真空度后，按事先設計好的離子種類、能量和劑量進行注入，一般選用15-20keV氮離子，設定自然對照和真空對照，菌膜形成后立刻進行下一步即為自然對照，將培養皿放入小靶室中但放于輻照的培養皿下面不開蓋即為真空對照；(8)菌膜洗脫:所 有的培養皿蓋上上蓋，取出培養皿，用1.5mL生理鹽水用移液槍和涂布棒配合使用分兩次洗脫菌膜，轉移至1.5mL無菌離心管中；(9)平板培養:上述菌懸液搖勻后，梯度稀釋到IO6倍后視實際情況取適宜倍數涂布于肉胨平板上，肉胨培養基成份為(/L):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，純凈水或自來水1L，調pH至7.0左右，配制平板時要加1.5%的瓊脂粉，30°C倒置培養2天后統計菌落數，將各劑量處理均與真空對照相比，求得相對存活率，將真空對照與自然對照的相同稀釋倍數的菌落數相比，即得真空對照的存活率；(10)血平板篩選:將各處理肉胨平板上的菌落隨機挑取至90mm血平板上，每個平板點種6-7個菌落，30°C培養2天后測定各菌落的溶血圈直徑，統計突變率，突變效率分為正突變率(溶血圈直徑比出發菌株增加> 10% )和負突變率(溶血圈直徑比出發菌株降低> 10% )，以存活率20-30%、正突變率較高而負突變率較低的劑量較為適宜，作為后續輻照的劑量，配制血平板的方法如下:肉胨培養基中加入1.5%的瓊脂粉滅菌后取出冷卻至50°C左右時，加入5-7%的脫纖維無菌羊血，迅速分配至培養皿中，每個培養皿中加入約15mL培養基，冷卻后即得血平板，血平板不耐貯存，一般隨用隨配；根據以上存活率和突變率確定最優離子注入參數；(11)油平板評價和篩選:挑取溶血圈最大的菌落30個，肉胨培養基培養8-10小時后，用牙簽鈍頭蘸取少量菌液，點種至油平板，每個油平板點種4-5個菌落，30°C倒置培養3天后測定各菌株噬油斑直徑油平板配制方法如下:將原油溶于石油醚(濃度10%)中，濾紙剪成直徑85mm，置90mm培養皿中，加2mL10%石油溶液，待石油醚揮發后，121°C蒸汽高壓滅菌20min，取出60°C烘干備用，礦質鹽培養基(MSM)中加入1.5%的瓊脂粉，滅菌后傾倒平板，平板尚未凝固時將濾紙緊貼在平板上后即成油平板，MSM按以下方法配制:MgS04，
0.2g，KH2P04，1.0g ； (NH4)2SO4,1.0g ；CaCl2,0.02g ；K2HP04,1.0g ；FeCl3,0.05g ;蒸餾水 lL，pH值最后調整為7.0-7.2，選出噬油斑最大的突變株10株左右；(12)搖瓶復篩:初篩的菌株分別接肉胨培養基后，同時接產表活培養基和烴降解培養基，每個菌株設置3個獨立重復，進行搖瓶復篩，具體操作步驟如下:產表面活性劑培養基成份為(g/L):NaN032.5，Κ2ΗΡ044.0, ΚΗ2Ρ044.0, CaCl2.2Η200.1，MgSO40.2，NaCll.0,KC11.0，酵母粉1.0，甘油30，pH值最后調整為6.5，加入3_5%的碳源(如廢棄植物油)，滅菌后，加入I %的種子液，300C、ISOrpm轉速條件下培養3d后測定發酵液稀釋100倍后表面張力和發酵液排油圈大小，測定表面張力采用界/表面張力儀，排油圈測定大小的方法是:在90mm培養皿小蓋中，加入15mL去離子水，滴加200mL0#柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取樣器加入IOuL的發酵液10倍去離子水稀釋液，如果排油圈直徑超過培養皿小蓋的直徑，則將發酵液稀釋10倍后再加入；烴降解 培養基為上述(11)中的MSM加1%的原油，按5%的量接種后30°C、120rpm轉速條件下搖床培養7d，觀察原油乳化和降解情況，測定殘余烴的量和發酵液離心后的上清液的表面張力，并分別記錄，測定殘余烴的量采用重量法，具體方法是:漏斗中加入脫脂棉過濾得濾液，測定表面張力采用表面張力儀進行，脫脂棉上與粘在搖瓶壁上的殘余原油采用石油醚(30-60°C沸程)清洗回收到尖底燒瓶中，加熱(60°C )條件下采用旋轉蒸發儀蒸干石油醚，根據尖底燒瓶前后的質量差求得殘余原油的質量，與稱重之前的原油質量對t匕，并結合空白對照的質量變化，求得微生物對搖瓶中原油的降解率；根據產表面活性劑培養基的表面張力、排油圈、烴降解培養基濾油的表面張力、石油烴降解率進行綜合評定，初步篩選出最優的菌株I株；如有必要，則重復上述步驟，進行多輪離子束誘變篩選；(13)制作菌懸液:取上述突變株接種肉胨培養基搖瓶，30°C培養8小時后，12000rpm離心5分鐘后，去上清，菌體再用生理鹽水重新懸浮；(14)紫外誘變:將菌懸液分配至無菌60mm培養皿中，每個培養皿放5mL,按預定的參數進行紫外輻照，根據菌株對紫外線的敏感程度決定輻照時間，可以進行預備實驗，即在固定紫外燈功率和輻照距離后，進行一系列時間的紫外線輻照后，在肉胨平板上涂布計數，計算存活率，取存活率在10%左右的輻照時間為優化后的輻照時間，紫外燈功率為15-20瓦，輻照距離為30厘米；(15)血平板篩選:基本同上述第(10)步，將各處理肉胨平板上的菌落隨機挑取至90mm血平板上，每個平板點種6-7個菌落，30°C培養2天后測定各菌落的溶血圈直徑；(16)油平板篩選:取溶血圈較大的菌落30個左右，肉胨培養基培養8-10小時后，用牙簽鈍頭蘸取少量菌液，點種至油平板，每個油平板點種4-5個菌落，30°C培養3天后測定曬油斑大小，篩選出最優的菌株10株左右，(17)搖瓶復篩:同上述第(12)步，篩選出最優的菌株3-5株；(18)穩定性評價:取篩選出的優良突變株連續培養5代以上，每代均搖瓶培養，測定相關指標，傳代方法是:斜面培養、保存一第一代種子搖瓶培養一同時進行兩種培養基的搖瓶發酵一斜面培養保存一第二代種子搖瓶培養……最終獲得穩定性較好、綜合性狀優良的突變株1-2個，作為最終的優良突變菌株。由于采用上述技術方案，本發明所具有的優點和積極效果是:步驟較為簡便、可靠，操作性強，成功率高，易于推廣應用，誘變改良效果好。
具體實施例方式本發明提供了一種產表面活性劑的烴降解菌的綜合誘變改良方法。取出發菌株做成菌膜后，進行離子束注入，通過預備實驗獲得最佳參數，進行一至多輪離子束誘變處理，通過血平板與油平板復合篩選，初步篩選出優良菌株，作為紫外線誘變的出發菌株，同樣通過血平板與油平板復合篩選，并結合產表面活性劑培養基和烴降解培養基搖瓶篩選，進行綜合評價，獲得突變菌株10株左右，再連續傳代培養5代以上，考察各代表現，最終獲得穩定的突變株1-2株。
具體實施例對銅綠假單胞菌Z41進行低能離子束和紫外線誘變，以期獲得較高表面活性劑產量和較高降解效率的突變株。先用20keV能量的氮離子以0-120X2.5X 1013ions/cm2的劑量進行注入，發現有明顯的馬鞍型存活曲線存在。通過存活率和血平板突變率的考查，認為60X2.5X1013ions/cm2 是較優的劑量，在拐點的存活率達19 %，通過血平板和油平板篩選以及搖瓶評價，獲得突變株L18。對L18進行以20W紫外燈進行誘變，處理時間分別為5s，15s，30s, 40s和60s，之后通過復合篩選獲得優良突變株V23，原油周降解率達52.1 %，比出發菌株提高29.6 %，發酵液中鼠李糖脂產量達19.6g/L，比出發菌株提高28.9 %。
權利要求
1.一種產表面活性劑的烴降解菌的誘變改良方法，其特征是: 具體步驟如下: (1)菌種活化:取保藏菌種的甘油管，加入含有50mL肉胨培養基的250mL搖瓶中，30°C振蕩培養1-2天，直到培養出現明顯的渾濁為止； (2)平板培養:取搖瓶培養物以10倍稀釋法稀釋成KT1-KT6,取適宜稀釋倍數的菌液涂布于肉胨平板； (3)斜面培養:平板培養后檢查菌落的一致性，確定為純培養后，接種于肉胨斜面(采用15mL試管配制)，30°C條件下培養1_2天，至斜面找出菌苔為止； (4)制作菌懸液:取新培養的斜面，加入無菌生理鹽水(0.86% )5mL，振蕩1_5分鐘，使菌苔中的菌體脫落成菌懸液； (5)涂布菌懸液:在超凈工作臺中，取上述0.1mL菌懸液，添加于滅菌的90mm培養皿下蓋中，用涂布棒涂勻； (6)制作菌膜:在超凈工作臺中，打開培養皿上蓋，開無菌風吹5-10min，至培養皿下蓋中無水珠為止，使之形成干燥的菌膜，吹風時間過短菌膜不干，易在下一步的離子束注入過程中不易形成真空環境，影響離子束誘變效果，吹風時間也不宜過長，容易造成自然對照和真空對照菌落過少，不易統計相對存活率； (7)離子束注入:吹干形成菌膜后，合上培養皿，立刻將培養皿置離子束注入機小靶室中，取出上蓋，封閉小靶室，抽真空至一定真空度后，按事先設計好的離子種類、能量和劑量進行注入，一般選用15-20keV氮離子，設定自然對照和真空對照，菌膜形成后立刻進行下一步即為自然對照，將培養皿放入小靶室中但放于輻照的培養皿下面不開蓋即為真空對昭.(8)菌膜洗脫:所有的培 養皿蓋上上蓋，取出培養皿，用1.5mL生理鹽水用移液槍和涂布棒配合使用分兩次洗脫菌膜，轉移至1.5mL無菌離心管中； (9)平板培養:上述菌懸液搖勻后，梯度稀釋到106倍后視實際情況取適宜倍數涂布于肉胨平板上，肉胨培養基成份為(/L):蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，純凈水或自來水1L，調pH至7.0左右，配制平板時要加1.5%的瓊脂粉，30°C倒置培養2天后統計菌落數，將各劑量處理均與真空對照相比，求得相對存活率，將真空對照與自然對照的相同稀釋倍數的菌落數相比，即得真空對照的存活率； (10)血平板篩選:將各處理肉胨平板上的菌落隨機挑取至90mm血平板上，每個平板點種6-7個菌落，30°C培養2天后測定各菌落的溶血圈直徑，統計突變率，突變效率分為正突變率(溶血圈直徑比出發菌株增加> 10% )和負突變率(溶血圈直徑比出發菌株降低> 10% )，以存活率20-30%、正突變率較高而負突變率較低的劑量較為適宜，作為后續輻照的劑量，配制血平板的方法如下:肉胨培養基中加入1.5%的瓊脂粉滅菌后取出冷卻至50°C左右時，加入5-7%的脫纖維無菌羊血，迅速分配至培養皿中，每個培養皿中加入約15mL培養基，冷卻后即得血平板，血平板不耐貯存，一般隨用隨配；根據以上存活率和突變率確定最優離子注入參數； (11)油平板評價和篩選:挑取溶血圈最大的菌落30個，肉胨培養基培養8-10小時后，用牙簽鈍頭蘸取少量菌液，點種至油平板，每個油平板點種4-5個菌落，30°C倒置培養3天后測定各菌株噬油斑直徑油平板配制方法如下:將原油溶于石油醚(濃度10% )中，濾紙剪成直徑85mm，置90mm培養皿中，加2mL10%石油溶液，待石油醚揮發后，121°C蒸汽高壓滅菌20min，取出60°C烘干備用，礦質鹽培養基(MSM)中加入1.5 %的瓊脂粉，滅菌后傾倒平板，平板尚未凝固時將濾紙緊貼在平板上后即成油平板，MSM按以下方法配制:MgSQ，0.2g，KH2P04，1.0g ； (NH4)2SO4,1.0g ；CaCl2,0.02g ；K2HPO4,1.0g ；FeCl3,0.05g ;蒸餾水 1L，pH 值最后調整為7.0-7.2，選出噬油斑最大的突變株10株左右； (12)搖瓶復篩:初篩的菌株分別接肉胨培養基后，同時接產表活培養基和烴降解培養基，每個菌株設置3個獨立重復，進行搖瓶復篩，具體操作步驟如下:產表面活性劑培養基成份為(g/L):NaN032.5，Κ2ΗΡ044.0，ΚΗ2Ρ044.0，CaCl2.2Η200.LMgSO40.2，NaCll.0, KC11.0,酵母粉1.0，甘油30，pH值最后調整為6.5，加入3-5%的碳源(如廢棄植物油)，滅菌后，力口入1%的種子液，30°C、180rpm轉速條件下培養3d后測定發酵液稀釋100倍后表面張力和發酵液排油圈大小，測定表面張力采用界/表面張力儀，排油圈測定大小的方法是:在90mm培養皿小蓋中，加入15mL去離子水，滴加200mL0#柴油，形成油膜后，再在油膜中心用微量取樣器加入IOuL的發酵液10倍去離子水稀釋液，如果排油圈直徑超過培養皿小蓋的直徑，則將發酵液稀釋10倍后再加入； 烴降解培養基為上述(11)中的MSM加I %的原油，按5%的量接種后30°C、120rpm轉速條件下搖床培養7d，觀察原油乳化和降解情況，測定殘余烴的量和發酵液離心后的上清液的表面張力，并分別記錄，測定殘余烴的量采用重量法，具體方法是:漏斗中加入脫脂棉過濾得濾液，測定表面張力采用表面張力儀進行，脫脂棉上與粘在搖瓶壁上的殘余原油采用石油醚(30-60°C沸程)清洗回收到尖底燒瓶中，加熱(60°C )條件下采用旋轉蒸發儀蒸干石油醚，根據尖底燒瓶前后的質量差求得殘余原油的質量，與稱重之前的原油質量對比，并結合空白對照的質量變化，求得微生物對搖瓶中原油的降解率； 根據產表面活性劑培養基的表面張力、排油圈、烴降解培養基濾油的表面張力、石油烴降解率進行綜合評定，初步篩選出最優的菌株I株； 如有必要，則重復上述步驟，進行多輪離子束誘變篩選； (13)制作菌懸液:取上述突變株接種肉胨培養基搖瓶，30°C培養8小時后，12000rpm離心5分鐘后，去上清，菌體再用生理鹽水重新懸浮； (14)紫外誘變:將菌懸液分配至無菌60mm培養皿中，每個培養皿放5mL，按預定的參數進行紫外輻照，根據菌株對紫外線的敏感程度決定輻照時間，可以進行預備實驗，即在固定紫外燈功率和輻照距離后，進行一系列時間的紫外線輻照后，在肉胨平板上涂布計數，計算存活率，取存活率在10%左右的輻照時間為優化后的輻照時間，紫外燈功率為15-20瓦，輻照距離為30厘米；(15)血平板篩選:基本同上述第(10)步，將各處理肉胨平板上的菌落隨機挑取至90mm血平板上，每個平板點種6-7個菌落，30°C培養2天后測定各菌落的溶血圈直徑； (16)油平板篩選:取溶血圈較大的菌落30個左右，肉胨培養基培養8-10小時后，用牙簽鈍頭蘸取少量菌液，點種至油平板，每個油平板點種4-5個菌落，30°C培養3天后測定噬油斑大小，篩選出最優的菌株10株左右， (17)搖瓶復篩:同上述第(12)步，篩選出最優的菌株3-5株； (18)穩定性評價:取篩選出的優良突變株連續培養5代以上，每代均搖瓶培養，測定相關指標，傳代方法是:斜面培養、保存一第一代種子搖瓶培養一同時進行兩種培養基的搖瓶發酵一斜面培養保存一第二代種子搖瓶培養……最終獲得穩定性較好、綜合性狀優良的突變株1-2個，作為 最終的優良突變菌株，或作為下一輪誘變改良的出發菌株。
全文摘要
本發明涉及一種產表面活性劑的烴降解菌的誘變改良方法，屬于環境生物工程和環境微生物技術領域。取出發菌株做成菌膜后，進行離子束注入，通過預備實驗獲得最佳參數，進行一至多輪離子束誘變處理，通過血平板與油平板復合篩選，初步篩選出優良菌株，作為紫外線誘變的出發菌株，同樣通過血平板與油平板復合篩選，并結合產表面活性劑培養基和烴降解培養基搖瓶篩選，進行綜合評價，獲得突變菌株10株左右，再連續傳代培養5代以上，考察各代表現，最終獲得穩定的突變株1-2株。由于采用上述技術方案，本發明所具有的優點和積極效果是步驟較為簡便、可靠，操作性強，成功率高，易于推廣應用，誘變改良效果好。
文檔編號C12N13/00GK103146677SQ20131004355
公開日2013年6月12日 申請日期2013年1月27日 優先權日2013年1月27日
發明者張祥勝, 范紅香, 許德軍 申請人:鹽城師范學院