專利名稱：一種表面活性劑生產菌對石油降解協同作用的研究方法
技術領域：
本發明涉及石油污染技術領域，特別涉及一種表面活性劑生產菌對石油降解協同作用的研究方法。
背景技術：
石油是一種由多種烴類(正烷烴、支鏈烷烴、環烷烴、芳香烴、多環芳烴等)及少量非烴化合物(硫化物、氮化物、烷烴酸類等)和有機金屬(釩、鎳等)組成的復雜混合物，在儲存、運輸和加工過程中造成的環境污染已威脅到人類和其他生物的生存和發展。了解石油污染物在自然界的生物降解轉化規律，研究石油污染物微生物降解的原理和方法，分離篩選和培養石油降解菌，消除和減少石油在環境中的滯留，將有利于維護和創造高質量的人類生存環境。自1989年Alaska發生原油泄漏事故后，人們對石油污染修復進行了大量的研究。發現自然界中存在許多能夠以石油為碳源和能源的微生物，將石油污染物降解為環 境友好物質。石油是不溶于水的黑色粘稠物質，微生物在利用石油的過程難以與石油進行接觸，石油中的物質也很難穿過微生物細胞膜進行降解，影響了微生物降解石油污染物的效率。在解決這個問題，有幾種前人做過的工作，例如1989年Foght等使用化學表面活性劑來增大石油與水相的互溶能力，提高微生物與石油污染物的接觸面積；2001年Stehr等用化學預處理的方法來減少石油與水相的不相溶問題；2003年Freitkenhauer等通過提高溫度增加質量/擴散傳遞率。這些方法都能對環境有二次污染，而且花費昂貴，并且實際應用中收到的效果不理想。要提高微生物降解石油的有效方法包括三種第一，吸收石油中可溶解的部分；第二，產生生物表面活性劑來改變石油的溶解性；第三，底物之間的相互作用。生物表面活性劑是微生物代謝過程中分泌出的具有一定表面活性的產物，典型的生物表面活性劑包括糖脂、多糖脂、脂肽等，石油中可溶部分的吸收率受石油在水相中低溶解率的限制，生物表面活性劑使得石油和水相的接觸面積變大，因而提高了石油的降解率，生物表面活性劑的存在可以提高石油與微生物的接觸面積，降解石油的微生物生長過程往往伴隨著難溶烴類的乳化作用，乳化過程有利于微生物在石油中生長代謝。有研究表明在石油降解菌中添加生物表面活性劑可以提高石油降解的效率和降解效果，在生物修復過程中投加表面活性劑能有效的溶解那些難溶的石油類化合物和其他有機化合物，提高有機污染物質的降解率。由于生物表面活性劑生產菌在石油污染物的降解過程中會產生生物表面活性物質，有利于石油的生物降解，因此研究石油降解過程中含生物表面活性劑生產菌與石油污染物降解菌的菌群結構變化有利于闡明石油污染物降解過程的菌群反應機理與多菌種混合降解的模式，考察石油污染物降解過程中不同菌種的降解行為，闡明表面活性劑生產菌與石油污染物降解菌之間相互作用方式，將對石油污染物的生物修復產生重要的理論指導意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種表面活性劑生產菌與石油污染物降解菌共同降解石油污染物的協同作用。本發明的另一個目的是提供對這種協同降解石油污染物作用的考察方法。本發明的目的還有提供一種表面活性劑生產菌與石油污染物降解菌共同降解石油污染物的協同作用的無機鹽培養基的配方。本發明的技術方案如下一種表面活性劑生產菌對石油降解協同作用的研究方法，按以下步驟進行混合菌群石油污染物降解過程中的協同作用的研究
(一)配置用于進行降解實驗的無機鹽培養基，將IOOmL的無機鹽培養基分裝在250mL的三角瓶中，密封后在121 °C的高溫蒸汽滅菌鍋中下滅菌20分鐘，置于室溫中冷卻待用；(二)銅綠假單胞菌GMT1. 074具有在甘油為唯一碳源的無機鹽培養基中產生生物表面活性劑的能力。銅綠假單胞菌GIMT1. 074和醋酸鈣不動桿菌061021B分別按初始0D_為O. 01的接種量進行接種，進行3組平行試驗；(三)在接種后的搖瓶中添加O.5mL的石油，置于25_35°C，200rpm的搖床中進行培養;(四)每隔8小時從搖瓶中取出ImL的樣品，稀釋10'10'1(Γ8倍后，均勻涂布在LB瓊脂培養基中，在35°C的恒溫培養箱中倒置培養2-3天；(五)根據銅綠假單胞菌GMT1.074和醋酸鈣不動桿菌061021B在平板中的不同表型，使用平板計數法得到相應時刻下每種菌的數量關系，考察銅綠假單胞菌GIMT1. 074和醋酸鈣不動桿菌061021B在石油降解過程中的協同作用。步驟(一)中所用到的無機鹽培養基的配方是硝酸鈉O. 5_2g/L、磷酸二氫鉀O. 5-1. 5g/L、磷酸二氫鉀 O. 5-1. 5g/L、硫酸銨 2_4g/L、NaC13_7g/L，硫酸鎂 O. 5_2g/L ;微量元素10mL/L，運用精密電子pH調節電極進行測量，使用2mol/L的鹽酸或2mol/L的NaOH溶液調節pH到6. 5-7. 5。所用到的其中的微量元素的配方是每升培養液中含有O. 2g Na2MoO4 · 2H20，0. 5gZnSO4 ·7Η20，0· 3g CuSO4 ·5Η20，2· Og FeSO4 ·7Η20，I. Og CaCl 2,5. Og NaSO4,0. 4g MnSO4 ·4Η20和 O. 5g H3BO3。步驟(二)中考察銅綠假單胞菌GMT1. 074生產生物表面活性劑的方法此株銅綠假單胞菌GMT1. 074能在以甘油為唯一碳源的無機鹽培養基中發酵并產生表面活性劑；具體的說是在步驟(二)中所述的無機鹽培養基中加入2g/L的甘油后，放置于30°C，200rpm的搖床中進行培養發酵，發現在培養過程中會產生很多泡沫，經過排油圈實驗發現產生IOcm以上的排油圈；進一步對表面活性物質進行提取后，得到了糖脂類的生物表面活性劑的粗提物；證明了銅綠假單胞菌GMT1. 074產生生物表面活性劑的能力。步驟(四)中所述的平板計數法的具體操作如下用無機鹽培養基稀釋不同時刻取出的培養液至原始濃度的10_6、10_7和10_8倍，取10微升的稀釋液均勻涂布在LB營養培養基中，放置于35°C的恒溫培養箱中培養3天，對每種菌的數量進行計數，得到每組實驗的菌體濃度和菌群組成變化。
本發明的表面活性劑生產菌一銅綠假單胞菌GMT1. 074，具有耐受石油污染物的能力，而且能在甘油為唯一碳源的無機鹽培養基中產生表面活性劑，研究發現，在石油污染物中，銅綠假單胞菌GIMT1. 074僅能耐受卻不能降解石油污染物，銅綠假單胞菌在以石油為底物的無機鹽培養基中培養3天后，生物量維持在0D_為O. 01不變。本發明的一種石油降解菌一醋酸鈣不動桿菌061021B，具有降解石油污染物的能力，對5%體積比的原油在10天內，降解率達到74. 32%。以最終10天的原油降解實驗發現，相對比與單獨醋酸鈣不動桿菌061021B的74. 32%的降解率，混合菌的10天降解率為87. 29%，石油污染物的降解率經過兩株菌的協同作用后提高了 12. 83%。
圖I是在石油降解過程中，醋酸鈣不動桿菌061021B和銅綠假單胞菌GMT1. 074 協同降解石油污染物與醋酸鈣不動桿菌061021B單獨降解石油污染物的菌體生物量的比較。圖2是在原油降解過程中，醋酸鈣不動桿菌061021B和銅綠假單胞菌GMT1. 074協同降解與醋酸鈣不動桿菌061021B單獨降解的原油降解率之間的比較。
具體實施例方式通過下面結合具體實例將有助于進一步理解本發明，但本發明的保護范圍并不限制于此一種表面活性劑生產菌與石油污染物降解菌共同降解石油污染物的協同作用，具體的說是銅綠假單胞菌GMT1. 074與醋酸鈣不動桿菌061021B共存的條件下，前期生產表面活性劑的銅綠假單胞菌GMT1. 074的生長受到抑制，菌體難以生長，不產生生物表面活性劑，而石油污染物降解菌醋酸鈣不動桿菌061021B能夠利用石油大量生長，石油污染物被降解；在中期，醋酸鈣不動桿菌061021B繼續利用石油污染物生長，而銅綠假單胞菌GMT1. 074利用石油污染物降解的中間產物大量生長，并開始產生生物表面活性劑，降低培養液的表面張力；在后期，銅綠假單胞菌GMT1. 074繼續生長，表面張力持續降低，培養液中的石油污染物幾乎被完全降解，這時石油降解菌醋酸鈣不動桿菌061021B的生長周期進入衰亡期，菌體開始解體；最終，降解體系中的石油污染物被充分降解，銅綠假單胞菌GMT1. 074含量豐富，表面張力降至最低，而石油降解菌醋酸鈣不動桿菌061021B的存活細胞數目逐漸減少，最終基本消失。一種表面活性劑生產菌與石油污染物降解菌協同降解石油污染物的研究方法，具體的說是將表面活性劑生產菌銅綠假單胞菌GMT1. 074與石油降解菌醋酸鈣不動桿菌061021B接種至250mL的三角瓶中，其中含有IOOmL無機鹽培養基，初始接種的含量為0D_為O. 1，并添加濃度為O. 5%的柴油作為唯一碳源。在30°C，200rpm的恒溫搖床中進行培養，每隔8小時觀察培養液的顏色變化，并取出ImL培養液，分別稀釋10_6、10_7和10_8倍，取出10微升的稀釋液，用涂布棒均勻涂布于LB固體平板培養基中。放置于35°C的恒溫培養箱中倒置培養3天后，觀察計數平板中兩種細菌的菌落數量，得到活菌的數目，計算得到菌體含量變化規律。實施例I
利用混合菌群降解石油污染物的培養方法在配方為硝酸鈉O. 5g/L、磷酸二氫鉀O. 5g/L、磷酸二氫鉀O. 5g/L、硫酸銨2g/L、NaC13g/L，硫酸鎂O. 5g/L，微量元素10mL/L，調節pH到6. 5后的無機鹽培養基中，添加5mL的原油后和初始0D_為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B，置于30°C，200rpm的恒溫培養箱中進行石油污染物的降解實驗，降解10天后，使用正己烷萃取培養基中未被降解的原油，采用比重法比較降解前后石油重量的變化，實驗結果發現對原油的降解率為61. 27%。實施例2利用混合菌群降解石油污染物的培養方法在配方為硝酸鈉lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、硫酸銨3g/L、NaC15g/L，硫酸鎂lg/L，微量元素10mL/L，調節pH到7. O后的無機鹽培養基中，添加5mL的原油后和初始0D_為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B，置于30°C，200rpm的恒溫培養箱中進行石 油污染物的降解實驗，降解10天后，使用正己烷萃取培養基中未被降解的原油，采用比重法比較降解前后石油重量的變化，實驗結果發現對原油的降解率為74. 32%。實施例3利用混合菌群降解石油污染物的培養方法在配方為硝酸鈉I. 5g/L、磷酸二氫鉀I. 5g/L、磷酸二氫鉀I. 5g/L、硫酸銨5g/L、NaC17g/L，硫酸鎂I. 5g/L，微量元素10mL/L，調節pH到7. 5后的無機鹽培養基中，添加5mL的原油后和初始0D_為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B，置于30°C，200rpm的恒溫培養箱中進行石油污染物的降解實驗，降解10天后，使用正己烷萃取培養基中未被降解的原油，采用比重法比較降解前后石油重量的變化，實驗結果發現對原油的降解率為54. 91%。實施例4利用混合菌群降解石油污染物的培養方法在配方為硝酸鈉O. 5g/L、磷酸二氫鉀O. 5g/L、磷酸二氫鉀O. 5g/L、硫酸銨2g/L、NaC13g/L，硫酸鎂O. 5g/L，微量元素10mL/L，調節pH到6. 5后的無機鹽培養基中，添加5mL的原油后和初始OD6tltl為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B和初始OD6tltl為O. 01的銅綠假單胞菌GMT1. 074，置于30°C，200rpm的恒溫培養箱中進行石油污染物的降解實驗，降解10天后，使用正己烷萃取培養基中未被降解的原油，采用比重法比較降解前后石油重量的變化，實驗結果發現對原油的降解率為70. 41%。實施例5利用混合菌群降解石油污染物的培養方法在配方為硝酸鈉lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、硫酸銨3g/L、NaC15g/L，硫酸鎂lg/L，微量元素10mL/L，調節pH到7. O后的無機鹽培養基中，添加5mL的原油后和初始OD6tltl為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B和初始0D_為O. 01的銅綠假單胞菌GIMT1. 074置于30°C，200rpm的恒溫培養箱中進行石油污染物的降解實驗，降解10天后，使用正己烷萃取培養基中未被降解的原油，采用比重法比較降解前后石油重量的變化，實驗結果發現對原油的降解率為87. 29%。實施例6利用混合菌群降解石油污染物的培養方法在配方為硝酸鈉I. 5g/L、磷酸二氫鉀I. 5g/L、磷酸二氫鉀I. 5g/L、硫酸銨5g/L、NaC17g/L，硫酸鎂I. 5g/L，微量元素10mL/L，調節pH到7. 5后的無機鹽培養基中，添加5mL的原油后和初始OD6tltl為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B和初始OD6tltl為O. 01的銅綠假單胞菌GMT1. 074置于30°C，200rpm的恒溫培養箱中進行石油污染物的降解實驗，降解10天后，使用正己烷萃取培養基中未被降解的原油，采用比重法比較降解前后石油重量的變化，實驗結果發現對原油的降解率為66. 24%。實施例7混合菌降解石油污染物協同作用的研究在配方為硝酸鈉lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、硫酸銨3g/L、NaC15g/L，硫酸鎂lg/L，微量元素10mL/L，調節pH到7. O后的無機鹽培養基中，添加O. 5mL的石油后和初始OD6tltl為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B和初始0D_為O. 01的銅綠假單胞菌GIMT1. 074。在25°C，200rpm的搖床中進行培養，在第8小時取出ImL的樣品，稀釋到1(Γ6倍后，均勻涂布在LB瓊脂培養基中，培養2天。平板計數法得到銅綠假單胞菌GIMT1. 074 為7. 41 X IO6個/毫升，醋酸鈣不動桿菌061021Β為30. 96 X IO6個/毫升。實施例8混合菌降解石油污染物協同作用的研究在配方為硝酸鈉lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、硫酸銨3g/L、NaC15g/L，硫酸鎂lg/L，微量元素10mL/L，調節pH到7. O后的無機鹽培養基中，添加O. 5mL的石油后和初始OD6tltl為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B和初始0D_為O. 01的銅綠假單胞菌GIMT1. 074。在30°C，200rpm的搖床中進行培養，在第24小時取出ImL的樣品，稀釋到IO7倍后，均勻涂布在LB瓊脂培養基中，培養3天。平板計數法得到銅綠假單胞菌GIMT1. 074為36. 81 X IO6個/毫升，醋酸鈣不動桿菌061021B為208. 91 X IO6個/毫升。實施例9混合菌降解石油污染物協同作用的研究在配方為硝酸鈉lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、硫酸銨3g/L、NaC15g/L，硫酸鎂lg/L，微量元素10mL/L，調節pH到7. O后的無機鹽培養基中，添加O. 5mL的石油后和初始OD6tltl為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B和初始0D_為O. 01的銅綠假單胞菌GIMT1. 074。在35°C，200rpm的搖床中進行培養，在第80小時取出ImL的樣品，稀釋到10〃倍后，均勻涂布在LB瓊脂培養基中，培養3天。平板計數法得到銅綠假單胞菌GIMT1. 074為300. 14X 106個/毫升，醋酸鈣不動桿菌061021B為381. 02X IO6個/毫升。實施例10混合菌降解石油污染物協同作用的研究在配方為硝酸鈉lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、磷酸二氫鉀lg/L、硫酸銨3g/L、NaC15g/L，硫酸鎂lg/L，微量元素10mL/L，調節pH到7. O后的無機鹽培養基中，添加O. 5mL的石油后和初始OD6tltl為O. 01的醋酸鈣不動桿菌061021B和初始0D_為O. 01的銅綠假單胞菌GIMT1. 074。在35°C，200rpm的搖床中進行培養，在第120小時取出ImL的樣品，稀釋到IO7倍后，均勻涂布在LB瓊脂培養基中，培養3天。平板計數法得到銅綠假單胞菌GIMT1. 074為536. 25 X IO6個/毫升，醋酸鈣不動桿菌061021B為45. 875 X IO6個/毫升。
權利要求
1.一種表面活性劑生產菌對石油降解協同作用的研究方法，其特征在于按以下步驟進行混合菌群石油污染物降解過程中的協同作用的研究 (一)配置用于進行降解實驗的無機鹽培養基，將IOOmL的無機鹽培養基分裝在250mL的三角瓶中，密封后在121°C的高溫蒸汽滅菌鍋中下滅菌20分鐘，置于室溫中冷卻待用； (二)銅綠假單胞菌GMT1.074具有在甘油為唯一碳源的無機鹽培養基中產生生物表面活性劑的能力。銅綠假單胞菌GIMT1. 074和醋酸鈣不動桿菌061021B分別按初始OD_為0.01的接種量進行接種，進行3組平行試驗； (三)在接種后的搖瓶中添加O.5mL的石油，置于25-35°C，200rpm的搖床中進行培養； (四)每隔8小時從搖瓶中取出ImL的樣品，稀釋10_6、10_7、10_8倍后，均勻涂布在LB瓊脂培養基中，在35°C的恒溫培養箱中倒置培養2-3天； (五)根據銅綠假單胞菌GMT1.074和醋酸鈣不動桿菌061021B在平板中的不同表型，使用平板計數法得到相應時刻下每種菌的數量關系，考察銅綠假單胞菌GIMT1. 074和醋酸鈣不動桿菌061021B在石油降解過程中的協同作用。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(一)中所用到的無機鹽培養基的配方是硝酸鈉O. 5-2g/L、磷酸二氫鉀O. 5-1. 5g/L、磷酸二氫鉀O. 5-1. 5g/L、硫酸銨2_4g/L、NaC13-7g/L，硫酸鎂O. 5_2g/L ;微量元素10mL/L，運用精密電子pH調節電極進行測量，使用2mol/L的鹽酸或2mol/L的NaOH溶液調節pH到6. 5-7. 5。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所用到的其中的微量元素的配方是每升培養液中含有 O. 2g Na2MoO4 · 2H20,0. 5g ZnSO4 · 7H20,0. 3g CuSO4 · 5H20, 2. Og FeSO4 · 7H20,1.Og CaCl 2,5. Og NaSO4,0. 4g MnSO4 · 4H20 和 0. 5g H3BO30
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(二)中考察銅綠假單胞菌GIMT1.074生產生物表面活性劑的方法此株銅綠假單胞菌GMT1. 074能在以甘油為唯一碳源的無機鹽培養基中發酵并產生表面活性劑，具體的說是在步驟(二)中所述的無機鹽培養基中加入2g/L的甘油后，放置于30°C，200rpm的搖床中進行培養發酵，發現在培養過程中會產生很多泡沫，經過排油圈實驗發現產生IOcm以上的排油圈；進一步對表面活性物質進行提取后，得到了糖脂類的生物表面活性劑的粗提物；證明了銅綠假單胞菌GMT1. 074產生生物表面活性劑的能力。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于步驟(四)中所述的平板計數法的具體操作如下用無機鹽培養基稀釋不同時刻取出的培養液至原始濃度的10_6、10_7和10_8倍，取10微升的稀釋液均勻涂布在LB營養培養基中,放置于35°C的恒溫培養箱中培養3天,對每種菌的數量進行計數，得到每組實驗的菌體濃度和菌群組成變化。
6.根據權利要求I所述的研究混合菌群降解石油污染物過程中協同作用，其特征在于最終10天的原油降解實驗發現，相對比與單獨醋酸鈣不動桿菌061021B的74. 32%的降解率，混合菌的10天降解率為87. 29%，石油污染物的降解率經過兩株菌的協同作用后提高了·12.83%。
全文摘要
本發明涉及一種表面活性劑生產菌對石油降解協同作用的研究方法。配置用于進行降解實驗的無機鹽培養基；銅綠假單胞菌GIMT1.074具有在甘油為唯一碳源的無機鹽培養基中產生生物表面活性劑的能力。銅綠假單胞菌GIMT1.074和醋酸鈣不動桿菌061021B分別按初始OD600為0.01的接種量進行接種，進行3組平行試驗；根據銅綠假單胞菌GIMT1.074和醋酸鈣不動桿菌061021B在平板中的不同表型，使用平板計數法得到相應時刻下每種菌的數量關系，考察銅綠假單胞菌GIMT1.074和醋酸鈣不動桿菌061021B在石油降解過程中的協同作用。石油污染物的降解率經過兩株菌的協同作用后提高了12.83%。
文檔編號C12Q1/02GK102899381SQ20121038433
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月11日 優先權日2012年10月11日
發明者賈曉強, 周征西, 聞建平 申請人:天津大學