專利名稱：高產γ-氨基丁酸的植物乳桿菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株高產Y-氨基丁酸的新菌株-植物乳桿菌(Lactobacillus
plantarum) LW106,及其在微生物發酵制備、-氨基丁酸中的應用。
背景技術：
神經生理及醫學研究證實Y-氨基丁酸是人腦中重要的活性物質，但人體Y-氨基丁酸的積累隨著年齡的增長和精神壓力變得異常困難。因此外源補充Y-氨基丁酸使其維持在正常水平對人體尤其對于失眠、抑郁、高壓、更年期、老年人群的健康十分重要，研究表明每天攝入3(T50mg天然Y-氨基丁酸就能起到十分理想的保健作用。由于用量微少，
Y-氨基丁酸還可同其它營養功能因子配伍，用于普通食品和保健食品，因此Y -氨基丁酸具有良好的市場前景。利用天然物質及采用生物技術生產的Y-氨基丁酸可視為天然Y-氨基丁酸，較化學法合成Y-氨基丁酸具有更好安全性和吸收性。因此，應用生物技術制造高含Y-氨基丁酸的配料和食品是滿足Y-氨基丁酸巨大市場需求的主要手段。乳酸菌作為一種公認為安全的微生物，可通過生物轉化高效制備Y-氨基丁酸。與動物性乳酸菌相比，植物乳酸菌具有更強的耐酸和耐膽鹽能力，因此更有利于Y-氨基丁酸生物合成。目前已分離篩選短乳桿菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等產Y -氨基丁酸的植物乳酸菌。植物乳桿菌是一種重要的植物乳酸菌，其發酵過程中能產出特有的乳酸桿菌素，具有天然防腐作用，其產出的酸性物質能降解重金屬，其3葡萄糖苷酶具有較高的活性，具有減毒作用，此外植物乳桿菌還具有合成共軛亞油酸的能力，2009年植物乳桿菌被批準為新資源食品。因此植物乳桿菌是一種優良Y-氨基丁酸生產菌種。目前已分離得到多株產Y-氨基丁酸的植物乳桿菌。中國農業大學梁巖等篩選到一株產Y-氨基丁酸的植物乳桿菌S35,產量為4.52g/L,范杰等篩選到一株產Y -氨基丁酸的植物乳桿菌，產量為4.98g/L ;浙江師范大學蔣冬花分離到一株植物乳桿菌，Y -氨基丁酸產量為約4g/L ;浙江工業大學丁興等分離到一株植物乳桿菌，Y -氨基丁酸產量為0.527g/L，但其研究成果中產GABA能力都不高，也很少能應用于工業化生產。因此，從乳酸菌中篩選高產GABA的功能性植物乳酸菌對GABA產業的發展和人類健康均具有重要的意義。
發明內容
針對目前選育的產Y-氨基丁酸植物乳酸菌產Y-氨基丁酸能力不強等問題，本發明提供一株利用固體雙層平板快速高通量篩選法從自然發酵泡菜中篩選獲得的高產
Y-氨基丁酸的乳酸菌菌株-植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Lff106及其應用。本發明采用的技術方案是:一株高產Y -氨基丁酸的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)LWl06,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，郵編100101，保藏編號為:CGMCCN0.5655，保藏日期為:2011年12月26日，分類命名為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)。該菌株MRS固體培養基上菌落為乳白色，小，呈圓形，中央凸起，表面光滑；顯微鏡下細胞呈短桿狀，有時成對或成鏈狀排列；革蘭氏染色陽性，兼性厭氧；該菌株接觸酶、氧化酶、葡萄糖產氣、精氨酸產氨、明膠液化、淀粉水解、硝酸還原、V.P.反應均為陰性，API試劑鑒定該菌株與植物乳桿菌的同源性為99.7% ;該菌株16SrRNA序列與植物乳桿菌的同源性達到99%。以上形態學、生理生化及16SrRNA序列鑒定該菌株為植物乳桿菌。
本發明還涉及所述的植物乳桿菌LW106在微生物發酵制備Y -氨基丁酸中的應用。具體的，所述應用為:將植物乳桿菌LW106接種至含谷氨酸鈉的適用于植物乳桿菌的發酵培養基，進行發酵培養，發酵結束后于發酵液中獲得Y-氨基丁酸。通常在發酵培養前，保藏的菌株還需經活化培養和種子擴大培養。優選的，所述微生物發酵在pH5.(T5.5、28 32 °C下進行。具體的，利用所述植物乳桿菌LW106進行微生物發酵制備Y -氨基丁酸的過程可如下:①挑取適量試管穿刺菌種接入MRS液體培養基，28^320C，活化培養18 24h ；②在含f 5g/L谷氨酸鈉的MRS液體培養基(一級種子培養基)中，按19T5% (v/v)的接種量接種經活化的培養液，于28 32°C下靜置培養18 24h作為一級種子液；③在含2(T25g/L谷氨酸鈉的發酵培養基(二級種子培養基)中，按19T5% (v/v)的接種量接種一級種子培養液，于28 32°C下靜置培養36 48h作為二級種子液；④在含4(T50g/L谷氨酸鈉的發酵培養基中，按1% 5% (v/v)的接種量接種二級種子培養液，于28 32°C，靜置培養48 120h，培養過程中使用65%磷酸調節pH，控制發酵pH在5 5.5。所述發酵培養基配方如下(不包括添加的谷氨酸鈉):每升培養基中含小麥5 10g，麥麩15 20g，大豆粉5 10g，番茄汁5 10mL，靈芝發酵殘液l(T50mL，酵母粉5 10g，氯化鈣
0.r0.3g，維生素B60.3^0.5g，余量為自來水，pH為6 8 ;培養基的配制方法為:先將小麥粉、麥麩與大豆粉混合，加入1/3^1/2的水后添加一定量的液化酶，85°C保溫f2h，冷卻至室溫后加入其他成分和水，調節pH為6.5飛.8，121°C滅菌2(T30min即可。所述靈芝發酵殘液為靈芝經液體發酵、去除菌絲體后的發酵液，發酵液胞外多糖含量約為0.3^0.5g/L。具體制備方法可如下:(I)菌種活化:挑取靈芝菌種接種于PDA斜面培養基，于28 3(TC恒溫培養6 8d，置4°C冰箱備用；PDA斜面培養基組成:馬鈴薯10(T200g/L，葡萄糖l(T50g/L，瓊脂l(T20g/L, pH自然；(2)種子擴大培養:活化的斜面菌絲體接入液體種子培養基，在28 30°C、15(T200r/min下振蕩培養4d，得種子液；液體種子培養基組成:馬鈴薯10(T00g/L，葡萄糖l(T50g/L，酵母粉 I 5g/L，磷酸二氫鉀 I 5g/L，MgSO4 7H201 5g/L，pH 自然；(3)發酵培養:將培養好的種子培養液按3 10%的體積比接種到液體發酵培養基，在28 391:，150 2001'/1^11下振蕩培養6 8(1，得發酵液；液體發酵培養基組成:葡萄糖20 50g/L，酵母粉 I 5g/L，蛋白胨 0.5 2g/L，磷酸二氫鉀 0.5 2g/L，MgSO4 7H200.1 2g/L，pH自然。
上述所得發酵液離心或過濾去除菌絲體，即得所述靈芝發酵殘液。本發明的有益效果主要體現在:本發明提供了一株高產Y-氨基丁酸的新菌株，經發酵培養可以獲得Y -氨基丁酸含量為2(T25g/L的發酵液，總固形物含量達到噴霧干燥的要求，經噴霧干燥，產品Y-氨基丁酸的質量分數在20%以上。本發明植物乳桿菌LW106來自于傳統發酵食品，利用植物乳桿菌LW106生產制備的Y -氨基丁酸不存在安全隱患，達到食品安全級別。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:實施例1:從四川泡菜中篩選植物乳桿菌LW106菌株
(一)培養基快速高通量初篩高產Y-氨基丁酸的乳酸菌的固體雙層培養基:下層培養基配方為:CaC0320g/L，葡萄糖30g/L，酵母抽取物(粉末)5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氫二鉀2g/L，檸檬酸二氨2g/L，醋酸鈉5g/L，硫酸鎂 7H200.5g/L，硫酸錳 7H200.2g/L，吐溫800.lg/L，瓊脂糖f 15g/L，余量為水；上層培養基配方為:谷氨酸鈉50g/L，吐溫805g/L，磷酸吡哆醛
0.5g/L，苯酚0.15g/L，次氯酸鈉溶液(有效氯0.25g/L)，瓊脂糖l(Tl5g/L，余量為水；復篩MRS液體培養基:谷氨酸鈉5(Tl00g/L，葡萄糖30g/L，酵母抽取物(粉末)5g/L，蛋白胨10g/L,磷酸氫二鉀2g/L，檸檬酸二氨2g/L，醋酸鈉5g/L，MgSO4 7H200.5g/L，MnSO4 7H200.2g/L，吐溫 800.lg/L，余量為水。
(二)方法 取泡菜汁0.5 5mL，進行梯度稀釋分別取1(T4、1(T5濃度IOOy L涂布于初篩培養基，28 32°C培養36 48h。挑選周圍藍綠色水解圈大的單菌落、分離純化，將分離菌株接入質量分數為59^10%谷氨酸鈉的復篩培養基，28 32°C培養36 48h，取發酵液利用氨基酸自動分析儀分析確認Y-氨基丁酸產量。最后，對高產Y-氨基丁酸的分離菌株進行形態學、生理生化及16s RNA鑒定，篩選乳酸菌并分類。篩選獲得的植物乳桿菌(L.plantarum)Lff106,菌落乳白色,小,呈圓形，中央凸起，表面光滑；顯微鏡下細胞呈短桿狀，有時成對或成鏈狀排列；無鞭毛，不運動，無孢子；革蘭氏染色陽性，兼性厭氧；API鑒定該菌株與植物乳桿菌的同源性為99.7% ；16S rRNA序列與植物乳桿菌的同源性達到99%。實施例2:植物乳桿菌(L.plantarum) Lff106用于Y -氨基丁酸高效制備的方法(—)菌株保藏編號為:CGMCCN0.5655 的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum) Lff106 ；(二)培養基配方活化培養基(MRS液體培養基):葡萄糖30g/L，酵母抽取物(粉末)5g/L，蛋白胨IOg/L，磷酸氫二鉀 2g/L，檸檬酸二氨 2g/L，醋酸鈉 5g/L，MgSO4 7H200.5g/L，MnSO4 7H200.2g/L，吐溫800.lg/L，瓊脂糖l(Tl5g/L，自然pH，余量為自來水；一級種子培養基:谷氨酸鈉質量分數為3g/L的MRS液體培養基，MRS液體培養基配方同上；二級種子培養基:谷氨酸鈉質量分數為25g/L的發酵培養基，每IL發酵培養基配方:每升培養基中含小麥8g,麥麩18g,大豆粉8g,番爺汁8mL,靈芝發酵殘液30mL,酵母粉8g，氯化鈣0.2g，維生素B60.5g，余量為自來水，pH為6 8。培養基的配制方法為:先將小麥粉、麥麩與大豆粉混合，加入1/3^1/2的水后添加ImL的耐高溫a -淀粉酶(博立，酶活為20000U)，85°C保溫I 2h，冷卻至室溫后加入其他成分和水，調節pH為6.5 6.8，121°C滅菌20 30min即可。
靈芝發酵殘液制備過程如下:(I)菌種活化:挑取泰山赤靈芝I號(TL-1)菌種接種于PDA斜面培養基，于28°C恒溫培養6d，置4°C冰箱備用；PDA斜面培養基組成:馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L, pH自然;(2)種子擴大培養:活化的斜面菌絲體接入液體種子培養基，在28°C、150r/min下振蕩培養4d，得種子液；液體種子培養基組成:馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，酵母粉2g/L，磷酸二氫鉀 3g/L，MgSO4 7H201.5g/L，pH 自然;(3)發酵培養:將培養好的種子培養液按3%的體積比接種到液體發酵培養基，在28°C,150r/min下振蕩培養6d，得發酵液；液體發酵培養基組成:葡萄糖35g/L，酵母粉2g/L，蛋白胨 lg/L，磷酸二氫鉀 lg/L, MgSO4 7H200.5g/L，pH 自然。上述所得發酵液離心或過濾去除菌絲體，即得所述靈芝發酵殘液。
(三)方法從保藏的MRS固體穿刺培養基中挑取適量菌種接入MRS液體培養基，28 32°C靜置活化20h ；250mL三角瓶中裝入IOOmL —級種子培養基，取靜置培養20h的活化培養液，按5%的接種量接種后，28 32°C靜置培養20h作為一級種子液；6L具塞三角瓶中裝入5L 二級種子培養基，取一級種子液，按5%的接種量接種后，28 32°C靜置培養40h作為二級種子液；700L發酵罐中裝入500L大麥發酵培養基，按3%的接種量接種后，28 32°C靜置培養72h，培養過程中培養過程中使用65%磷酸調節pH，控制發酵pH在5.5。此制備方法可得高Y-氨基丁酸含量的發酵液，經氨基酸酸自動分析儀檢測為:21.8g/L，谷氨酸鈉轉化率為:90%。發酵液經濃縮，加入玉米淀粉噴霧干燥可得到Y-氨基丁酸含量在20% 25%的粉末產品。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的具體實施例子。顯然，本發明不限于以上實施例子，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.一株高產Y -氨基丁酸的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)LW106,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，郵編100101，保藏編號為:CGMCC N0.5655，保藏日期為:2011年12月26臼。
2.如權利要求1所述的植物乳桿菌LW106在微生物發酵制備Y-氨基丁酸中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述微生物發酵在ρΗ5.(Γ5.5、28 32°C下進 行。
全文摘要
本發明提供了一株高產γ-氨基丁酸的植物乳桿菌(L.plantarum)LW106，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，地址北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所菌種保藏中心，郵編100101，保藏編號為CGMCC NO.5655，保藏日期為2011年12月26日。本發明菌株經發酵培養可以獲得γ-氨基丁酸含量為20~25g/L的發酵液，總固形物含量達到噴霧干燥的要求，經噴霧干燥，產品γ-氨基丁酸的質量分數在20%以上。本發明植物乳桿菌LW106來自于傳統發酵食品，利用植物乳桿菌LW106生產制備的γ-氨基丁酸不存在安全隱患，達到食品安全級別。
文檔編號C12R1/25GK103146599SQ201310045139
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月1日 優先權日2013年2月1日
發明者吳學良, 陳如楚, 徐娟, 吳慶其 申請人:浙江五養堂藥業有限公司