通過聚乙二醇的介導將致誘變核堿基引入植物原生質體的改進的誘變方法

專利名稱：通過聚乙二醇的介導將致誘變核堿基引入植物原生質體的改進的誘變方法
技術領域：
本發明涉及通過將單鏈DNA寡核苷酸致誘變核堿基引入細胞而在靶細胞中的DNA特定位點上特異性和選擇性改變核苷酸序列的方法。更特別地，本發明涉及通過使用聚乙二醇(PEG)將致誘變核堿基引入植物原生質體的定向誘變的方法。本發明進一步涉及含有致誘變核堿基和PEG的試劑盒。本發明還涉及PEG用于增強定向誘變的用途。
背景技術：
有意地在活細胞的遺傳物質中產生改變的過程具有修飾所述細胞或生物體(所述細胞形成該生物體的一部分或能夠再生形成該生物體)的一個或多個遺傳編碼的生物學特征的目的。這些改變可以采取下列形式:刪除部分遺傳物質、添加外源性遺傳物質或改變遺傳物質的已有核苷酸序列。人們知道改變真核生物遺傳物質的方法已經有20多年，所述方法在植物、人和動物細胞和微生物中有廣泛的應用，用于農業、人類健康、食品質量和環境保護領域中的改進。最常見的方法由向細胞的基因組中加入外源性DNA片段組成，這將賦予所述細胞或其生物體優于或超過已有基因所編碼的性質的新性質(包括其中已有基因的表達將因此被抑制的應用)。雖然許多這樣的例子在獲得所需性質中是有效的，然而這些方法不是十分精確，因為對外源性DNA片段插入至基因組的位置沒有控制(因而對最終的表達水平沒有控制)，并且因為所需的效果必須通過優于原始的和平衡良好的基因組所編碼的天然性質表現出來。相反，引起預先確定的基因組位點中的核苷酸的添加、刪除或轉換的定向誘變的方法將允許精確地修飾已有的基因。另外，由于定向誘變的精確特性，可以預料的是以此方式獲得的新型植物系將更易于被消費者接受。
定向誘變是一種定點誘變的方法，其基于將合成的致誘變核堿基(由以其Watson-Crick堿基配對性質與DNA相似但在化學上可以不同于DNA的短串核苷酸樣部分(moietie)組成)遞送進入真核細胞核(Alexeev和Yoon NatureBiotechnol 16: 13431998 ; Rice Nature Bi o techno 1.j_￡: 321，2001; Kmi ec，J.Cl in.1nvest.112:632.2003)。一旦被引入細胞，這樣的致誘變核堿基在靶位點上與互補序列堿基配對。通過有意地在核堿基中設計錯配，該錯配可以在靶基因組序列中的相應位置上引起核苷酸轉換。該方法允許在內源性位點上轉換單個核苷酸或最多幾個核苷酸，但是可以應用于在已有位點上產生終止密碼子，從而引起其功能的破壞，或產生密碼子改變，從而產生編碼具有改變的氨基酸組成的蛋白的基因(蛋白工程)。在植物、動物和酵母細胞中已經描述了定向誘變。兩類不同的合成性致誘變核堿基已經用于這些研究:嵌合的DNA = RNA核堿基或單鏈核堿基。
嵌合的DNA: RNA核堿基(嵌合體)是自我互補的分子，其由25bp只有DNA的區域和25bp的互補序列(由5bp的DNA的核心區形成，所述DNA兩側是IObp的2’ -O-甲基化的RNA，其被認為可以幫助嵌合體在細胞中的穩定性)組成。5bp核心區在其中心包括工程化的錯配，其帶有在基因組的靶DNA序列中要改變的核苷酸。這兩個區都通過4bp的胸腺嘧啶脫氧核苷發夾連接。當引入細胞時，認為嵌合體與其靶序列形成雙D-環，在嵌合體和靶核苷酸之間形成錯配。然后該錯配由內源性細胞DNA修復蛋白通過轉換基因組核苷酸而解決。第一個使用嵌合體的定向誘變的例子來自于動物細胞(見Igoucheva等人2001GeneTherapy8, 391-399的綜述)，然后后來還用于獲得植物細胞中的定向誘變(Beetham等人 1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA並:8774-8778; Zhu 等人 1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96, 8768-8773; Zhu 等人 2000Nature Biotech.18，555-558; Kochevenko 等人 2003PlantPhvs.132:174-184:Okuzaki 等人 2004Plant Cell Rep.22:509-512) 與人細胞不同，產生定向誘變事件的植物細胞可以再生成完整的植物，并且突變可以轉移至下一代，使其成為重要食品作物的研究和商業化誘變的理想工具。但是，許多實驗室的深層次研究顯示使用嵌合體的定向誘變頻率相當低并且是可變的，或甚至不能檢測到(Ruiter等人2003PlantMol.Biol.53, 715-729, Van der Steege 等人(2001)Nature Biotech.叢:305-306)，并且依賴于這樣的因素:如靶標的轉錄狀態、細胞在細胞周期中的位置、靶標的序列和嵌合體的質量(其是難以合成的)。由于使用本領域中已知方法的定向誘變的頻率相對較低，所以只有當基因組靶標的單個核苷酸的改變引起顯性可選擇性表型時，這樣的事件才可以被檢查至IJ。在植物細胞中，將特異性的點突變引入乙酰乳酸合成酶(ALS，在玉米中是AHAS)基因的開放閱讀框中，所述基因催化合成支鏈氨基酸亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的共同最初步驟。在煙草中，單個核苷酸的改變足以產生密碼子轉換P194Q或W571L。在這些密碼子轉換后產生的ALS蛋白對磺酰脲類除草劑的抑制不敏感，因此提供了選擇染色體基因座上的單個核苷酸轉換的方法。由于使用用嵌合體工作的困難，人們已經尋求更可靠的可替代的寡核苷酸設計。幾個實驗室已經研究了單鏈(ss)核堿基進行定向誘變的能力。發現它們給出更加可重復的結果、合成更簡單并且還可以包括修飾的核苷酸以改進致誘變核堿基在細胞中的表現(Liu 等人 2002Nucl Acids Res30:2742-2750;review, Parekh-Olmedo 等人 2005Gene Therapyl2:639-646;Dong 等人 2006Plant Cell Rep.25:457-65;De Pi6doue 等人200701igonucIeotides 27:258-263)。在Kmiec 的多個專利申請(其中有 W00173002, W003/027265, W001/87914, W099/58702，W097/48714，W002/10364)中已經描述了定向誘變。在W001/73002中考慮到的是:使
用未修飾的核堿基獲得的基因改變的低頻率相信主要是由于其被存在于反應混合物或靶細胞中的核酸酶所降解。為了解決這一問題，提出摻入經修飾的核苷酸以賦予所產生的核堿基對抗核酸酶的抗性。這種經修飾的核苷酸的典型例子包括硫代磷酸酯鍵或2’ -O-甲基-類似物。這些修飾優選位于核堿基的末端，留出包圍定向堿基的中心未修飾的結構域。為了支持這個觀點，專利申 請W002/26967顯示某些增加核堿基細胞內壽命的經修飾的核苷酸可以增加定向誘變在體外測試系統中也在哺乳動物染色體靶標上的效率。不只是核酸酶抗性，ss致誘變核堿基結合至其互補靶DNA的親和力也具有顯著增加定向誘變頻率的潛力。含有經修飾的增加結合親和力的核苷酸的ss核堿基可以更有效地在復雜基因組中發現其互補的靶標和/或結合至其靶標更長的時間并且被調節DNA轉錄和復制的蛋白除去的可能性更低。體外定向誘變分析已經用于測試許多經修飾的核苷酸以增加誘變過程的效率。鎖定的核酸(LNA)和C5-丙炔嘧啶分別具有糖部分和堿基的修飾，可以穩定雙鏈的形成并提高雙鏈的熔解溫度。當將這些經修飾的核苷酸摻入至ss核堿基上時，其相對于使用相同序列的未經修飾的核堿基獲得的定向誘變效率增加達13倍。這一方面見本申請人名下的 W02007073166 和 W02007073170。本發明人已經開始通過優化用于向植物細胞中引入致誘變核堿基的方法而增加植物細胞中定向誘變的頻率。最廣泛使用的轉化植物細胞的方法(土壤桿菌(Agrobacterium)介導的轉化)將其誘導腫瘤(Ti)的質粒的一部分即所謂的T-DNA轉移至植物細胞中，在植物細胞中其有效地在隨機的位置上整合進入植物基因組中。T-DNA兩個末端上的旁側是與靶序列無同源性的源自Ti質粒的達22bp的“邊界”序列。考慮到用于定向誘變的ss致誘變核堿基的長 度較短，邊界序列將干擾這一過程。因此，只能使用化學或物理的方法通過直接DNA轉移而在植物細胞中實現定向誘變。在文獻中已經報道了幾個這樣的直接DNA轉移技術，其包括電穿孔、聚乙二醇(PEG)處理原生質體、基因槍轟擊(biolistic bombardment)植物愈傷材料和將DNA顯微注射至單個原生質體或組織中。本領域未給出轉移ss核堿基以進行定向誘變的優選方法，特別是DNA轉移至植物或植物原生質體的優選方法的啟示。為了盡可能高地獲得植物中定向誘變的效率，在研究過程中本發明人鑒定了四個要優化的因素。第一，優選以高轉化效率引入致誘變核堿基，即，引入盡可能多的許多植物細胞中。第二，優選地，處理對于大多數細胞不是致死的，保證盡可能多被轉化的細胞也可以在轉化過程后存活(存活效率)。第三，優選地，轉化方法對于經轉化的植物細胞隨后分裂形成微愈傷組織是無害的(再生/植板效率)。最后優選地是可能不需要應用選擇而鑒定源自定向誘變事件的單個再生植物(鑒定效率)。大多數將DNA轉化至單個植物細胞的方法使用原生質體，所述原生質體源自葉(葉肉原生質體)或源自細胞懸浮液(見Sheen, J.(2001)Plant Phys.127:1466-1475的綜述)。原生質體可以用于瞬時表達研究，在這種情況下可以在轉化后不久評估基因的表達或蛋白定位，或者當原生質體生長在培養基上以促進愈傷組織形成和器官發生時，原生質體可以用于產生穩定轉化的植物。以前已經報道過使用電穿孔轉化植物原生質體(Fromm等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA迎:5824-5828;Nishiguchi 等人(1986)Plant Cell Rep.5:57-60;Ou-Lee等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA83:6815-6819:Hauptmann 等人(I987)PlantCell R印.β:265-270; Jones 等人(1989)Plant Mol.Biol.13:503-511 )0 通常，給予最高轉化效率的場強(V/cm)引起〈50%的原生質體存活(Jones等人(1989)Plant Mol.Biol.l3:503-511)o在煙草電穿孔研究中我們發現樣品中只有約10%的總煙草原生質體被表達GFP的質粒轉化,在擬南芥屬(Arabidopsis)原生質體的電穿孔后也觀察到這一相對的低轉化效率(Miao等人(2007)NatureProtocolsl^:2348-2353)。通常，對于每個植物物種必須經驗性地確定最佳的電穿孔條件，且這些條件還根據電穿孔儀器的類型和用于原生質體分離的方法和緩沖液而變化。雖然電穿孔已經被成功地應用于許多植物物種，其仍然是有著幾個嚴重局限性(特別是在重現性方面)的困難技術(如http://Renetics.mRh.harvard, edu/sheenweb/fag, html中討論的)。因此,為了增加定向誘變的TNE的總效率，電穿孔是不太合意的。使用基因槍遞送的直接基因轉移在產生轉基因作物植物中已經是非常成功的，并常規地用于轉基因的穩定整合。細胞懸浮液被轉移至用于誘導愈傷組織的固體培養基中，通過高壓氣體源驅動的金顆粒轟擊該材料。已經報道該轉化頻率低，約0.01%的總細胞被轉化。由于低轉化效率，難以評價經轉化細胞的存活。相反，由于經處理的材料強烈分裂，所以轟擊后的再生效率有可能是高的。但是，因為TNE將發生在單個愈傷組織的單個細胞中，所以，如果不選擇的話這樣的事件將會容易地丟失，或者，再生的植物將是定向誘變事件的嵌合體。因此，對于在非選擇性位點上進行定向誘變，轟擊是不現實的。相反，使用原生質體找回定向誘變事件是可能的，因為每個微愈傷組織源自單個原生質體。在ALS上通過嵌合體誘導的單個核苷酸轉換已經證明定向誘變可以在煙草、玉米和水稻細胞中被檢測到。轟擊已經被用于煙草(Beetham等人1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96:8774-8778;Kochevenko 等人 2003Plant Phvs.132:174-184).玉米(Zhu 等人 1999Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96, 8768-8773)和水稻(Okuzaki 等人 2004Plant CellRep.22:509-512)o Beetham等人(1999)報道與背景突變率相比(假定是10_7至10_8)，直接轉移嵌合體后的除草劑抗性的頻率增加20倍。Kochevenko等人也使用電穿孔以在煙草葉肉原生質體中進行定向誘變實驗。與Beetham等人獲得的頻率相比，本發明人能夠以
0.0001%的頻率獲得除草劑抗性的煙草愈傷組織。這顯示當用相同的植物物種和在這一情況下相同的靶核苷酸處理時，直接DNA遞送方法對定向誘變效率沒有大的影響，效率仍然維持在不理想的低水平上。但是Ruiter等人(2003Plant Mol.Biol.53, 715-729)在煙草和油菜含油種子中進行了轟擊和電穿孔實驗，不能檢測到嵌合體的任何作用。已經報道對玉米和水稻愈傷組織的轟擊的效率是被轉化的細胞的0.01% (Zhu等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA96, 8768-8773;Okuzaki 等人(2004 (Plant CellRep.22:509-512)。但是，這只在可選擇性位點是可行的。PEG介導的原生質體轉化本身從1985年已經為人所知。第一個用于原生質體轉化的方法使用了 PEG (Krens 等人(1982)Nature296:72-74;Potyrykus 等人(1985)Plant皿01.8丨01.1 印.2:117-128;恥81'肚丨11等人(1987)Plant Mol.Biol.363-373)。該技術可用于來自許多不同植物的原生質體(Rasmussen等人(1993)Plant Sc1.型:199-207)。PEG被認為在二價陽離子存在時通過將DNA沉淀在原生質體的表面上(然后DNA在其中被沉淀)而刺激轉化(Maas & Werr (1989) Plant CellRep.8:148-151 )0 PEG轉化是轉化擬南芥屬原生質體的選擇方法(http: //genetics, mgh.harvard, edu/sheenweb/faq.html) (Mathur 等人 Methods in molecular biology, vol.82，267-276),符合有效 TNE 的轉化方法所限定的四個要求。當用PEG處理煙草原生質體時，在所有被檢查的細胞中可以檢測到生物素標記的ss寡核苷酸。通過使用二乙酸熒光素活體染色評估的PEG處理后的存活率是>90%。不是所有的原生質 體都保留了分裂和形成微愈傷組織的能力。在非處理的煙草原生質體的典型分離體中，大約25%形成微愈傷組織。PEG處理確實對再生效率有輕微的影響，再生效率下降約10%，但是與其它轉化方法相比，這并不是顯著的。以上描述的現有技術中沒有一個考慮到使用PEG轉化用于定點誘變特別是TNE。本發明人已經開始改進直接DNA轉移的方法以在植物細胞中獲得有效的定向誘變。本發明人發現從本文其它地方所述的轉化技術中，PEG原生質體轉化相對于電穿孔和基因槍顯著地增加了總的定向誘變的效率。這是令人驚訝的，因為至今用于植物中定向誘變的技術似乎傾向于具有低效率的電穿孔。另外，技術中的大多數改進旨在改進致誘變核堿基，而不是將致誘變核堿基遞送至基因組靶DNA的遞送系統。為了比較，本發明人使用了 ss致誘變核堿基，其被設計為在ALS基因座上產生P194Q轉換，從而引起除草劑抗性。使用PEG介導的轉化或電穿孔將相同的ss致誘變核堿基引入煙草葉肉原生質體中，使用相同的選擇條件選擇除草劑抗性細胞。因此，本發明人發現與已知的轉化方法相比，PEG介導的植物細胞轉化是在植物細胞中進行定向誘變的最有效的方法。

發明內容
在一個方面，本發明涉及在植物細胞原生質體中定向改變雙鏈受體DNA序列的方法，其包括將雙鏈受體DNA序列與ss致誘變核堿基結合，其中雙鏈受體DNA序列含有第一DNA序列和與第一 DNA序列互補的第二 DNA序列，其中供體ss致誘變核堿基相對于要改變的雙鏈受體DNA序列，優選相對于第一 DNA序列包含至少一個錯配，其中所述方法進一步包括使用聚乙二醇(PEG)介導的轉化將ss致誘變核堿基引入細胞原生質體的步驟。使用基于PEG轉化技術將ss致誘變核堿基與待轉化植物的原生質體接觸。PEG介導的轉化技術本身是廣為人知的和必需的，可以不背離本發明的精髓而由技術人員做出對特定規程的小的修改。用于本發明的ss致誘變核堿基的長度與用于定向誘變的其它(嵌合體)ss致誘變核堿基相一致，即通常為10-60 個核苷酸，優選為20-55個核苷酸，更優選為25-50個核苷酸。在本發明的一些具體實施方式
中，本發明中使用的ss致誘變核堿基可以被修飾，例如通過申請人的W02007073166和W02007073170所述的LNA和/或丙炔修飾。因此，在某些具體實施方式
中，ss致誘變核堿基含有位于距離定向錯配的位置的至少一個LNA，優選為位于距離錯配至少一個核苷酸的兩個LNA。另外，這些LNA與ss致誘變核堿基的5’和/或3’末端距離至少3、4或5個核苷酸。在一些具體實施方式
中，ss致誘變核堿基可以含有一個或更多丙炔置換，基本上如W02007073166和W02007073170中所述。在一些具體實施方式
中，可以將供體ss致誘變核堿基偶聯至蛋白如核定位信號上。在這一具體實施方式
中，將本發明中使用的寡核苷酸通過常規(連接子)技術偶聯至核定位信號上，例如已知的SV40大T抗原的(NLS)肽、GATA轉錄因子11、DNA修復解螺旋酶XBP1、光介導的蛋白DET1、ERF轉錄因子、PR-相關的轉錄激活子PTI6和核卷曲蛋白(nuclear coiled protein),基本上如同一申請人的申請PCT/NL2007/000279所述。寡核苷酸核定位信號偶聯物可以用于本文所述的基于PEG的轉化方法。本發明的方法產生的改變是刪除、置換或插入至少一個核苷酸。優選地，改變是置換。可以在一個寡核苷酸中改變更多的核苷酸，但是可以預料到效率將下降，因此改變一個核苷酸是優選的。靶DNA (或雙鏈受體DNA)可以來自任何來源，但是優選靶DNA來自植物。優選靶DNA來自基因組DNA、線性DNA、人工染色體、核染色體DNA、細胞器染色體DNA、游離型DNA。根據本發明的方法可以用于改變細胞、通過恢復至野生型而改正突變、誘導突變、通過打亂編碼區而使酶失活、通過改變編碼區而修飾酶的生物活性、通過打亂編碼區而修飾蛋白。在一個方面，本發明涉及PEG介導的轉化在增加植物原生質體中定向誘變效率中的用途。不被理論所束縛，認為使用PEG介導的轉化將DNA沉淀在原生質體的細胞膜上。經沉淀的DNA被細胞膜封裝并以隔離的形式引入原生質體中。在正常細胞周期的過程中，原生質體在通過去除細胞壁而形成之后，直接開始其正常細胞壁的再生過程。細胞分裂通常開始較晚(從幾個小時至幾天)。定向核苷酸交換通常在細胞分裂過程中通過細胞的修復機制發生。在將供體DNA引入原生質體和細胞分裂開始之間的時間內，供體DNA傾向于受到細胞防御機制如核酸外切酶的攻擊，有可能退化，因此變得對于TNE無效。通過使用PEG介導的轉化技術，供體DNA通過內吞作用而被封裝，并且以這一方式至少暫時地隔離于核酸外切酶的退化作用。當DNA從其封裝的形式中釋放出來時，其具有增加的機會存在于細胞分裂的時刻或大約在這一時刻前后，在這一期間DNA (即ss致誘變核堿基)能夠找到受體細胞DNA中的其互補物并以通常的定向誘變機制交換核苷酸。
具體實施例方式實施例:使用PEG介導的轉化或電穿孔的定向i秀變頻率的比較

原生質體的分離在25° C 和 60-70%RH，在 16/8h20001ux 光周期下，煙草(Nicotiana tabacum)Cv Petit Havana系SRl的體外芽培養物保持在高玻璃瓶中的含有0.8%Difco瓊脂的MS20培養基中。MS20培養基是基本Murashige和Skoog氏培養基(Murashige, T.和Skoog, F., Physiologia Plantarum, 15:473-497, 1962),其含有 2%(w/v)鹿糖，不添加激素和0.8%Difco瓊脂。收集完全展開的3-6周齡的芽培養物的葉。將葉切成Imm厚的條，然后將其轉移至含有45ml MDE基本培養基的大(100mm x 100mm)皮氏培養皿中進行預質壁分離處理30分鐘。MDE基本培養基含有0.25g KCl, 1.0g MgSO4.7H20, 0.136g KH2PO4, 2.5g聚乙烯吡咯酮(MW10，000)，6mg萘乙酸和2mg6_芐氨基嘌呤，總體積為900ml。將溶液的重量克分子滲透壓濃度(osmolality)用山梨糖醇調整至600m0sm.kg_\pH為5.7。然后加入5mL的酶儲存液SRl。每IOOml酶儲存液由750mg纖維素酶Onozuka R10, 50011^崩解酶((11'丨861386)和250mg離析酶(macerozyme)RlO組成,經Whatman紙過濾并過濾除菌。在黑暗中25。C進行消化過夜。經消化的葉通過50 μ m尼龍濾網過濾進入無菌燒杯中。等體積的冷KCl洗滌培養基用于洗滌濾網并與原生質體懸浮液合并。KCl洗滌培養基由每升2.0g CaCl2.2H20和使重量克分子滲透壓濃度為540m0sm.kg—1的足夠量的KCl組成。將懸浮液轉移至IOml管中，在85x g4° C沉淀原生質體10分鐘。棄去懸浮液，將原生質體沉淀小心地重懸于5mL冷的MLm洗滌培養基中，其是一半正常濃度的MS培養基(Murashige, T.和Skoog, F.，PhysiologiaPlantarum, 15:473-497, 1962)的主要營養素、每升2.2g CaCl2.2H20和使重量克分子滲透壓濃度為54011108111.1 -1的量的甘露醇。將2管的內含物合并，在85xg4° C離心10分鐘。棄去上清液，將原生質體沉淀小心地重懸于5mL冷的MLs洗滌培養基(其是蔗糖代替甘露醇的MLm培養基)中。
將2管的內含物合并，小心取出加在蔗糖溶液上的ImL KCl洗滌培養基，不擾動下層相。在85xg4° C離心原生質體10分鐘。小心收集在蔗糖和KCL溶液之間含有活的原生質體的中間相。加入等體積的KCl洗滌培養基并小心地混合。用血細胞計數器測定原生質體的密度。PEG 轉化在5° C85xg離心原生質體懸浮液10分鐘。棄去上清液，將原生質體沉淀重懸于KCl洗滌培養基至終濃度106.mL'在IOmL的管中，將250 μ L原生質體懸浮液，1.6nmole的ss致誘變核堿基和250 μ I PEG溶液輕柔地但充分地混合。20分鐘后，在室溫孵育，逐滴加入5mL冷的0.275M Ca(N03)2。在4° C85xg離心原生質體懸浮液10分鐘。棄去懸浮液，將原生質體沉淀小心地重懸于1.25mL Ttl培養基，其補充了 SOyg.mL—1頭孢噻廂和50μ g.mL—1萬古霉素。ss致誘變核堿基的培養基含有(每升，pH5.7)950mg KNO3, 825mg NH4NO3, 220mgCaCl2.2H20, 185mg MgSO4.7H20, 85mg KH2PO4, 27.85mgFeSO4.7H20, 37.25mg Na2EDTA.2H20,根據 Heller 氏培養基(Heller, R.，Ann Sci Nat BotBiol Vegl1: 1223, 1953)的微量營養素，根據 Morel 和 Wetmore 氏培養基(Morel, G.和 R.H.ffetmore, Amer.J.Bot.38:138 - 40, 1951)的維生素，2%(w/v)鹿糖，3mg 蔡乙酸，lmg6-芐氨基嘌呤和使重量克分子滲透壓濃度為540m0sm.kg—1的量的甘露醇。將懸浮液轉移至35mm的皮氏培養皿中。加入等體積的Ttl瓊脂糖培養基并輕柔混合。將樣品在25。C黑暗中孵育并按照如下所述進一步培養。電穿孔在5° C85xg離心原生質體10分鐘。棄去上清液，將沉淀重懸于冰冷的電穿孔緩沖液(由IOmM HEPES, 80mM NaCl, 0.04mM CaCl2, 0.4M甘露醇組成，pH5.7，用甘露醇調節至54011108111.1 -1，終濃度為10 !/1)中。在整個過程中原生質體保持在冰上。向0.4cm寬的電穿孔杯中加入4.5nmole的ss致誘變核堿基和700 μ L原生質體懸浮液。根據下列參數使用裝有PC和CE模塊的Biorad GenePulser XCell電穿孔系統向細胞懸浮液遞送單指數式衰竭脈沖:場強500V.cm-1電容950 μ F在這些條件下，樣品的電阻約是30ohm，得到的時間常數約是30ms。這些參數被選作電穿孔后24小時在煙草原生質體中給出最高水平的GFP瞬時表達的參數。脈沖發生后，使原生質體在室溫的杯中恢復30分鐘。然后使原生質體在ImL Ttl培養基中恢復并轉移至IOmL的管中。用另外5mL Ttl培養基洗滌該杯，然后與原生質體懸浮液合并。在充分地但輕柔地混合后，加入50 μ g.ml/1頭孢噻廂和50 μ g.ml/1萬古霉素,將1.25mL的原生質體懸浮液轉移至35mm皮氏培養皿上。加入等體積的Ttl瓊脂糖培養基，將混合物輕柔勻質化。在25°C黑暗中孵育樣品，按照如下所述進一步培養。原生質體的培養培養10天后，將瓊脂糖板切成6等份，轉移至含有補充了 20nM氯磺隆的22.5mLMAPlAO培養基的皮氏培養皿中。該培養基由下列成分組成(每升，pH5.7):950mg KNO3, 825mgNH4NO3, 220mgCaCl2.2H20, 185mg MgSO4.7H20, 85mg KH2PO4, 27.85mgFeS04.7H20, 37.25mgNa2EDTA.2H20,根據 Murashige 和 Skoog 氏培養基(Murashige, Τ.和 SkoogF., PhysiologiaPlantarum, 15:473-4971962)的十分之一原始濃度的微量營養素，根據Morel和Wetmore氏培養基(Morel, G.和 R.H.Wetmore, Amer.J.Bot.38:138 - 40, 1951)的維生素，6mg 丙酮酸鹽，蘋果酸、富馬酸和朽1檬酸每種12mg, 3% (w/v)鹿糖，6%(w/v)甘露醇，0.03mg萘乙酸和0.1mg6-芐氨基嘌呤。在25° C低光中孵育樣品6_8周。將生長的愈傷組織轉移至MAPI培養基中并使其生長另外2-3周。MAPI培養基具有與MAP1AO培養基相同的組成，但是以3% (w/v)的甘露醇代替6%的甘露醇，以及含有46.2mg.Γ1組氨酸(pH5.7)。其用
0.8%(w/v) Difco瓊脂固化。然后使用無菌鑷子將愈傷組織轉移至RP培養基中。RP培養基由下列成分組成(每升，pH5.7):273mg KNO3, 416mg Ca(NO3)2.4H20, 392mg Mg(NO3)2.6H20, 57HigMgSO4.7H20, 233mg (NH4) 2S04, 27 Img KH2PO4, 27.85mgFeS04.7H20, 37.25mg Na2EDTA.2H20,根據Murashige和Skoog氏培養基的五分之一公布濃度的微量營養素，根據Morel和Wetmore氏培養基(Morel, G.和 R.H.WetmoreAmer.J.Bot.38: 138-40，1951)的維生素 0.05%(w/v)鹿糖，1.8%(w/v)甘露醇，0.25mg玉米素和41nM氯磺隆,用0.8%(w/v) Difco瓊脂固化。2-3周后將成熟的芽轉移至生根培養基中。Ss致誘奪核堿某所有的ss致誘變核堿基由Eurogentec (Seraing, Belgium)合成，通過反相HPLC純化，重懸于無菌的milliQ水中。使用前，將ss致誘變核堿基加熱至95° C5分鐘。ss致誘變核堿基06Q262設計為:在煙草ALS基因(登錄號X07644)中密碼子位置P194上引入單個錯配(有下劃線的核苷酸)，這將引起CCA至CAA(P194Q)的轉換。06Q261ss致誘變核堿基與煙草ALS基因序列完全匹配，作為陰性對照。06Q263SS致誘變核堿基由40個核苷酸的隨機組合組成，作為陰性對照。06Q2615’TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG[SEQ ID I]06Q2625’TCAGTACCTATCATCCTACGTTGCACTTGACCTGTTATAG[SEQ ID 2]06Q2635’ATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCGATCG[SEQ ID 3]毎個處理的原牛質體存活率轉化后24小時,使用突光活體染料二乙酸突光素(fluorescein diacetate, FDA)通過酯酶活性評估PEG轉化和電穿孔后原生質體的存活率。將2 μ L的丙酮中的5mg.ml/1儲存液FDA加入ImL經轉化的原生質體中。將整個群體中發熒光的原生質體的部分用血細胞計數器計數。用裝有 GFP LP (EX480/40, DM505, BA510)過濾裝置的 Nikon Eclipse E600直立落射突光顯微鏡(epifluorescence microscope)進行觀察。由IOOW高壓萊燈提供激發。使用連接至DS-Ul控制器(連接至運行NIS Element圖像獲取/分析軟件的PC)的DS-2MBffc C⑶照相機獲取圖像。結果 使用PEG轉化和電穿孔的轉化結果的總結顯示于表I中。使用PEG轉化的原生質體存活率顯著高于電穿孔。電穿孔本身的性質比PEG轉化對于原生質體的存活更有害，弓丨起高得多的恢復/存活比例以及較高的定向誘變效率。在氯磺隆存在的情況下孵育原生質體后對定向誘變效率評分。
權利要求
1.一種在植物細胞原生質體中定向改變雙鏈受體DNA序列的方法，其包括將雙鏈受體DNA序列與供體致誘變核堿基結合，其中雙鏈受體DNA序列含有第一 DNA序列和與第一 DNA序列互補的第二 DNA序列并且其中供體致誘變核堿基相對于要改變的雙鏈受體DNA序列，優選相對于第一 DNA序列包含至少一個錯配，其中該方法進一步包括使用聚乙二醇(PEG)介導的轉化將致誘變核堿基引入細胞原生質體中的步驟。
2.根據權利要求1所述的方法，其中致誘變核堿基是單鏈致誘變核堿基。
3.根據權利要求2所述的方法，其中單鏈致誘變核堿基的長度介于10-60個核苷酸之間。
4.根據權利要求1到3所述的方法，其中致誘變核堿基含有與錯配距離至少一個核苷酸的，并且，可選地，與致誘變核堿基的5’和3’末端距離至少3、4或5個核苷酸的鎖定的核酸(LNA)置換。
5.根據權利要求4所述的方法，其中單鏈致誘變核堿基含有位于與錯配的任一側距離至少一個核苷酸的兩個LNA。
6.根據權利要求1-4所述的方法，其中致誘變核堿基含有丙炔置換。
7.根據權利要求2-6所述的方法，其中單鏈致誘變核堿基與核定位信號結合。
8.根據任意前述權利要求所述的方法，其中受體DNA來自基因組DNA、線性DNA、哺乳動物人工染色體、細菌人 工染色體、酵母人工染色體、植物人工染色體、核染色體DNA、細胞器染色體DNA或游離型DNA。
9.根據任意前述權利要求所述的方法，其用于改變細胞、通過恢復至野生型改正突變、誘導突變、通過打亂編碼區而使酶失活、通過改變編碼區而修飾酶的生物活性或通過打亂編碼區而修飾蛋白。
10.PEG介導的轉化用于增加植物原生質體中使用致誘變核堿基的定向誘變的效率相對于基于電穿孔的轉化的效率至少10倍的用途。
11.根據權利要求10所述的用途，其中致誘變核堿基是單鏈致誘變核堿基，優選地，其中單鏈致誘變核堿基的長度介于10-60個核苷酸之間。
12.根據權利要求10-11所述的用途，其中致誘變核堿基含有與定向錯配距離至少一個核苷酸的，并且，可選地，與致誘變核苷酸的5’和3’末端距離至少3、4或5個核苷酸的LNA置換。
13.根據權利要求12所述的用途，其中單鏈致誘變核堿基含有位于與錯配的任一側距離至少一個核苷酸的兩個LNA。
14.根據權利要求10-12所述的用途，其中致誘變核堿基含有丙炔置換。
15.根據任意前述權利要求所述的用途，其中受體DNA來自基因組DNA、線性DNA、哺乳動物人工染色體、細菌人工染色體、酵母人工染色體、植物人工染色體、核染色體DNA、細胞器染色體DNA或游離型DNA。
16.根據任意前述權利要求所述的用途，用于改變細胞、通過恢復至野生型改正突變、誘導突變、通過打亂編碼區而使酶失活、通過改變編碼區而修飾酶的生物活性或通過打亂編碼區而修飾蛋白。
17.利用根據權利要求1-9任一項所述的方法或利用根據權利要求10-16任一項所述的用途獲得的植物、植物細胞、植物細胞原生質體、植物愈傷組織或芽。
全文摘要
本發明涉及通過聚乙二醇的介導將致誘變核堿基引入植物原生質體的改進的誘變方法。具體而言，本發明涉及在植物細胞原生質體中定向改變雙鏈受體DNA序列的方法，其包括將雙鏈受體DNA序列與供體致誘變核堿基結合，其中雙鏈受體DNA序列含有第一DNA序列和與第一DNA序列互補的第二DNA序列，其中供體致誘變核堿基相對于要改變的雙鏈受體DNA序列，優選相對于第一DNA序列包含至少一個錯配，其中該方法進一步包括使用聚乙二醇(PEG)介導的轉化將供體致誘變核堿基引入細胞原生質體中的步驟以及使用PEG原生質體轉化以增加定向誘變率。
文檔編號C12N15/87GK103146757SQ20131004701
公開日2013年6月12日 申請日期2007年12月21日 優先權日2007年12月21日
發明者P·邦道克, M·T·J·德博特, F·呂西耶 申請人:凱津公司