專利名稱：噬氨副球菌lh-n40與異養硝化好氧反硝化微生物菌劑及制備方法與用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于環境微生物領域，具體涉及微生物菌種，以及由該微生物菌種組成的異養硝化好氧反硝化脫氮的微生物菌劑，以及該菌劑的制備方法與用途。
背景技術：
傳統的廢水生物脫氮技術主要是靠自養硝化菌和異養反硝化菌通過硝化和反硝化偶聯使氨氮轉變為氮氣脫除。而自養細菌自身的增殖速度慢、在混合培養的活性污泥系統中無法與異養細菌競爭、難以獲得較高的生物量、硝化效率低，導致自養微生物脫氮系統抗沖擊能力弱、硝化作用不完全；反硝化菌為異養菌，運行中往往需要補加碳源，增加了運行成本。鑒于傳統的硝化細菌和反硝化細菌的不足，異養硝化細菌、好氧反硝化細菌的發現解決了傳統生物脫氮處理啟動時間長，硝化環節條件要求苛刻，硝化和反硝化不能同步進行等缺點，具有較好的發展前景。已報道的異養硝化細菌很多又同時具有好氧反硝化的功能，這為污水脫氮引入新的概念，使得同步硝化反硝化得以實現。目前，高氨氮行業的廢水一般含有很多含有毒有害物質，如焦化廢水等。針對這一情況，獲得耐受環境毒害、去除難降解物質的高效異養硝化好氧反硝化功能菌株，構建組合成微生物菌劑，投加到廢水處理系統中或者用于特定污染水體的生物修復，使其成為反應體系中的優勢種群而發揮脫氮和去除COD作用，能夠增強對難降解污染物的降解能力，提高脫氮速率，并改善原有生物處理體系對目標污染物的去除效能。公開專利文獻CN101875909.B提供了一種高效的異養硝化好氧反硝化細菌及其培養方法和用途，該細菌是紅球菌屬Rhodococcus sp.DN2.3，保藏登記號為CCTCCM209300，能夠有效脫除水體中的氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮及其混合物，還可同時去除有機廢水中的CODCr，但菌劑生產方法過于簡單，菌種單一，環境耐受力差，不適用于大規模利用。公開專利文獻CN102277314.B提供一種種高效異養硝化細菌篩選方法、篩選的菌株及其菌劑的制備方法，該菌株為臘狀芽孢桿菌(Bacillus cereus),保藏編號為:CGMCCN0.4918，可以利用亞硝酸鹽作為唯一的氮源進行生長繁殖。并以該菌株制備水質凈化微生物制劑菌劑，可用于污水處理、水產養殖、水族箱或流動水系等水治理工程，未見其用于工業污水處理。公開專利文獻CN101899401.A提供了一種含氨廢水微生物菌劑及其制備方法，該菌劑包含硝酸菌、亞硝酸菌和反硝化菌，通過定向馴化來調節或者配比，能有效處理低C0D、高氨氮廢水，但菌劑中包含的菌株過于籠統，且對有毒有害物質耐受性較差。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種新的噬氨副球菌LH-N40。
本發明所要解決的另一個技術問題是提供了含有上述噬氨副球菌LH-N40的異養硝化好氧反硝化微生物菌劑。本發明所要解決的另一個技術問題是提供了上述菌劑的制備方法與用途。本發明公開了一種卩遼氨副球菌(Paracoccusaminovorans) LH-N40 CGMCC N0.6971。本發明所涉及的菌株為噬氨副球菌LH-N40已于2012年12月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為CGMCC N0.6971 ;保藏單位地址:北京市朝陽區大屯路中國科學院微生物研究所，電話:010-64807355。以下對本發明的菌株的分離純化進行說明。一、噬氨副球菌LH-N40的分離純化
1.土樣馴化富集:取土壤樣品，接種至硝化液體培養基中，逐步馴化富集。(硝化富集培養基組成:NH4SO4 lg/L, NaNO31 g/L, NaCl 0.3g/L, FeSO4 0.03g/L, K2HPO4 0.25g/L, MgSO40.03g/L, NaCO30.3g/L, CH3COONa 0.5g/L 蒸餾水 1L, pH 8.0)
2.稀釋液準備:取馴化污泥培養液lml，加入盛有9ml無菌水的滅菌試管中，混勻即得10—1濃度的污泥懸液。靜置30s,用Iml無菌吸管吸取KT1的污泥懸液Iml放入9ml無菌水管中，吹吸混勻，即為10_2稀釋液，依次從10_2連續稀釋至10_5，即得一系列的10倍稀釋液。3.培養皿準備:取滅菌培養皿,在皿蓋上加注樣品號、培養基代號、接種稀釋度、分離日期等。將滅菌后的硝化培養基倒入皿中約12 15ml，使凝成平板。(硝化固體培養基組成同硝化液體培養基，另加入2%的瓊脂)。4.初篩與培養:初篩接種采用涂布法，即用無菌吸管吸取不同倍數稀釋液
0.1ml，滴于已制好的平板 上，然后用無菌刮鏟涂勻。接種完畢，將皿分類重疊，倒置于30°C培養箱中培養2 4d。5.復篩:取出培養好的平板，選出生長好、有代表性的單菌落，用接種環挑取，接種到同樣成分的硝化液體培養基中30°C震蕩培養，生長后，用接種環挑取一環培養液在硝化固體培養基上劃線純化，30°C培養箱中培養。待有菌落長出后，挑取單菌落劃線，純化，重復2 3次，篩選得到純菌株。6.將該純菌株送到生物工程(上海)有限公司進行16s rDNA測序，經鑒定為噬氨苜Ij 球菌{Paracoccus amino vor an s )。本發明還公開了一種異養硝化好氧反硝化微生物菌劑，其特點是:該微生物菌劑含有卩遼氛副球菌(/Iaracoccw1S aminovorans^) LH-N40 CGMCC N0.6971。本發明菌劑中，菌株是在菌劑中起脫氮和去除COD作用的菌株，菌劑中還可以含有常規的微生物助劑，比如穩定劑和/或保護劑等助劑。本發明微生物菌劑中，菌株的含量根據其所處理的廢水需要進行選定，一般地，以質量分數計量，每種菌株的含量均不低于0.1%，優選不低于1%，最優選不低于5%。本發明還公開了一種如以上方案所述的異養硝化好氧反硝化微生物菌劑的制備方法，其特點是，其步驟如下:
(1)將微生物菌劑中所述的菌株接種到固體培養基進行活化；
(2)活化后轉接到相應液體培養基進行搖瓶培養，離心收集菌體，制備高濃度種子液；搖瓶培養條件為，pH:6.0 10.0，溫度:10°C 35°C，轉速:100 170rpm，培養時間:1 2 d ;高濃度種子液中有效活菌數量彡5 X IO9 cfu/mL ；(3)將上述高濃度種子液到接種到相應的一級種子罐進行放大培養I 7d，培養條件為:溫度 10°C 35°C ；ρΗ 6.0 10.0 ；DO 0.5 4.0mg/L，通氣量(λ 4 (λ 6m3/h，攪拌速度110 150rpm,濃縮收集菌體,制備一級種子液；再將一級種子液轉接到相應二級種子罐進行放大培養I 14d，濃縮收集菌體，制備二級種子液；再將二級種子液轉接到相應三級種子罐進行放大培養I 21d，濃縮收集菌體，得到三級種子液；二級種子液和三級種子液的培養條件為:pH 6.0 10.0，溫度10 35°C，DO 0.5 4.0mg/L，通氣量0.4 0.6m3/h，攪拌速度110 150rpm ;向三級種子液中添加微生物助劑，按照各菌株所需的比例混合即獲得微生物菌劑；所述的微生物助劑是穩定劑和/或保護劑；
步驟(I)和(2)中所述的固體培養基和液體培養基組成為:牛肉膏3 5g/L，蛋白胨6 12g/L，氯化鈉3 6g/L，蒸餾水1L，固體培養基中再加入1.5 2.5%瓊脂；步驟(3)所述的一級種子液所用的培養基組成為:(NH4)2SO4 0.5 5g/L，葡萄糖0.5 lg/L，MgSO40.01 0.02g/L, K2HPO4 0.1 0.3g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸餾水 IL ;二級種子液和三級種子液所用的培養基組成為:尿素0.5 5g/L，葡萄糖I 3g/L，K2HPO4 0.1
0.3g/L, MgSO4 0.01 0.02g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸餾水 1L。以上所述的制備方法的步驟(3)中:所述的穩定劑和保護劑可以為現有技術中常制菌劑常規使用的穩定劑和保護劑，穩定劑優選自甘油、乙醇的一種或其混合物；保護劑優選自活性炭粉末、硅藻土的一種或其混合物。步驟(3)中所述的濃縮方法優選為自然沉降、離心或者過濾。本發明所述的微生物菌劑或者本發明制備方法制得的微生物菌劑可以在處理含氮化工廢水中應用。本發明的微生物菌劑可以制備成液態菌劑，或者制備成干粉狀的菌劑。與現有技術相比，本發 明的有益效果如下:
1.本發明的微生物菌劑不僅能解決傳統反應器中總氮難脫除的問題，而且能夠在同一反應器中有效脫除水體中的氨氮和總氮；該微生物菌劑對廢水中的酚類、胺類、雜環類、氰類、多環芳烴類等有毒物質具有耐受性或降解能力；該微生物菌劑有利于異養硝化好氧反硝化脫氮的微生物菌劑的規模化生產應用；可以直接應用于含氮有機化工廢水的生物處理系統中；可以作為生物強化劑投加到廢水處理系統或者在各種填料上掛膜后處理廢水；能夠有效脫除廢水中的C0D，效果穩定，耐環境毒物沖擊；在各種含氮有機化工廢水處理中有著非常廣闊的應用前景。2.本發明的微生物菌劑制備方法制得的微生物菌劑活菌數高，生產周期短、工藝簡便。
具體實施例方式下面結合具體實例對本發明進行說明，以下實施方式僅用于說明本發明，而不用于限制本發明所要求保護的范圍。實施例1，一種卩遼氨副球菌aminovorans )LH-N40 CGMCC N0.6971。實施例2, —種異養硝化好氧反硝化微生物菌劑,該微生物菌劑包括曬氨副球菌(.Paracoccus amino vorans )LH-N40 CGMCC N0.6971。菌株的含量可以為適宜。菌劑中，各菌株是在菌劑中起脫氮和去除COD作用的菌株，菌劑中可以為單獨的菌株，還可以含有常規的微生物助劑，比如穩定劑和/或保護劑等助劑。所述的菌株及其微生物菌劑均可以應用于處理含氮化工廢水。實施例3，實施例2所述所述的異養硝化好氧反硝化微生物菌劑中，以質量分數計量，菌株的含量均不低于0.1%。實施例4，實施例2所述所述的異養硝化好氧反硝化微生物菌劑中，以質量分數計量，菌株的含量均不低于5%。實施例5，一種如實施例2-4中任何一項所述的異養硝化好氧反硝化微生物菌劑的制備方法，其步驟如下:
(1)將微生物菌劑中所述的菌株接種到固體培養基進行活化；
(2)活化后轉接到相應液體培養基進行搖瓶培養，離心收集菌體，制備高濃度種子液；搖瓶培養條件為，pH:6.0 10.0，溫度:10°C 35°C，轉速:100 170rpm，培養時間:1 2 d ;高濃度種子液中有效活菌數量彡5 X IO9 cfu/mL ；
(3)將上述高濃度種子液到接種到相應的一級種子罐進行放大培養I 7d，培養條件為:溫度 10°C 35°C ；ρΗ 6.0 10.0 ；D0 0.5 4.0mg/L，通氣量 0.4 0.6m3/h，攪拌速度110 150rpm,濃縮收集菌體,制備一級種子液；再將一級種子液轉接到相應二級種子罐進行放大培養I 14d，濃縮收集菌體，制備二級種子液；再將二級種子液轉接到相應三級種子罐進行放大培養I 21d，濃縮收集菌體 ，得到三級種子液；二級種子液和三級種子液的培養條件為:pH 6.0 10.0，溫度10 35°C，DO 0.5 4.0mg/L，通氣量0.4 0.6m3/h，攪拌速度110 150rpm ;向三級種子液中添加微生物助劑，按照各菌株所需的比例混合即獲得微生物菌劑；所述的微生物助劑是穩定劑和/或保護劑；
步驟(I)和(2)中所述的固體培養基和液體培養基組成為:牛肉膏3 5g/L，蛋白胨6 12g/L，氯化鈉3 6g/L，蒸餾水1L，固體培養基中再加入1.5 2.5%瓊脂；步驟(3)所述的一級種子液所用的培養基組成為:(NH4)2SO4 0.5 5g/L，葡萄糖0.5 lg/L，MgSO4
0.01 0.02g/L, K2HPO4 0.1 0.3g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸餾水 IL ;二級種子液和三級種子液所用的培養基組成為:尿素0.5 5g/L，葡萄糖I 3g/L，K2HPO4 0.1
0.3g/L, MgSO4 0.01 0.02g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸餾水 1L。實施例6，實施例5所述的制備方的步驟(3)中:所述的穩定劑選自甘油、乙醇的一種或其混合物；所述的保護劑選自活性炭粉末、硅藻土的一種或其混合物。實施例7，實施例5所述的制備方的步驟(3)中所述的濃縮方法為自然沉降、離心或者過濾。實施例8，本發明微生物菌劑的異養硝化好氧反硝化性能實驗。一、配制氨氮質量濃度為240mg/L左右的模擬廢水，添加甲醇為碳源，COD質量濃度為1050mg/L左右。二、按以下方法制得的純菌株發酵液:
1.菌株活化:將純菌株接到固體培養基中，25°C恒溫培養箱中活化。2.高濃度種子液制備:用接種環取活化后菌株轉接到液體培養基中，10 350C UOO 170rpm搖瓶震蕩培養I 2d生長至對數期，在滅菌離心管中離心去上清液收集菌體，制備高濃度種子液，有效活菌數量> 5X IO9 cfu/mL。培養基組成為:牛肉膏4g/L，蛋白胨10g/L，氯化鈉5g/L，pH 7.5，固體培養基添加2%瓊脂。3.一級種子液制備:將上述高濃度種子液到接種到20L—級種子罐，在溫度10°C 35°C ；pH 6.0 10.0 ；DO 0.5 4.0mg/L，通氣量 0.4 0.6m3/h，攪拌速度 110 150rpm條件下放大培養3d,過濾濃縮收集菌體,制備一級種子液。培養基組成為=(NH4)2SO42g/L，葡萄糖 lg/L, MgSO4 0.01g/L，K2HPO4 0.2 g/L, FeSO4.7H20 0.05 g/L。4.二級種子液制備:將菌株的一級種子液以10%的接種量接種到300L 二級種子罐放大培養10d，自然沉降濃縮收集菌體，制備二級種子液。培養條件為pH 6.0 10.0，溫度10 35°C，D0 0.5 4.0mg/L，通氣量0.4 0.6m3/h，攪拌速度110 150rpm。培養基組成為:尿素 4g/L，葡萄糖 3g/L，K2HPO4 0.2g/L，MgSO4 0.02g/L, FeSO4.7H20 0.1 g/L。5.三級種子液制備:將菌株的二級種子液以10%的接種量轉接到相應5m3三級種子罐放大培養12d，自然沉降濃縮收集菌體，得三級種子液。培養條件和培養基組成同二級種子液制備條件。三.菌劑制備:通過添加微生物助劑甘油，獲得微生物菌劑。將菌劑接種6L曝氣反應器中，接種量10%，對照接種同體積的滅菌純水，30°C，150rpm振蕩培養12個小時,定時取樣測定氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮濃度的變化。結果見表1，從表I可以看出，在培養的前6個小時，菌劑培養液中有微量的硝酸鹽和亞硝酸鹽出現，8小時以后再未檢測到硝酸鹽和亞硝酸鹽積累，菌劑體系中總氮去除率均達到90.0%以上。該菌劑實現了異養硝化好氧反硝化同步脫氮。表I脫氮微生物菌劑對氨氮的去除效果
權利要求
1.一種卩遼氨副球菌(Zkracoccw1S aminovorans) LH-N40 CGMCC N0.6971。
2.—種異養硝化好氧反硝化微生物菌劑，其特征在于:該微生物菌劑含有權利要求1所述的卩遼氨副球菌aminovorans) LH-N40 CGMCC N0.6971。
3.根據權利要求2所述的異養硝化好氧反硝化微生物菌劑，其特征在于:該微生物菌劑中，以質量分數計量，菌株的含量均不低于5%。
4.一種如權利要求2或3所述的異養硝化好氧反硝化微生物菌劑的制備方法，其特征在于，其步驟如下: (1)將微生物菌劑中所述的菌株接種到固體培養基進行活化； (2)活化后轉接到相應液體培養基進行搖瓶培養，離心收集菌體，制備高濃度種子液；搖瓶培養條件為，pH:6.0 10.0，溫度:10°C 35°C，轉速:100 170rpm，培養時間:1 2 d ;高濃度種子液中有效活菌數量彡5 X IO9 cfu/mL ； (3)將上述高濃度種子液到接種到相應的一級種子罐進行放大培養I 7d，培養條件為:溫度 10°C 35°C ；ρΗ 6.0 10.0 ；D0 0.5 4.0mg/L，通氣量(λ 4 (λ 6m3/h，攪拌速度110 150rpm,濃縮收集菌體,制備一級種子液；再將一級種子液轉接到相應二級種子罐進行放大培養I 14d，濃縮收集菌體， 制備二級種子液；再將二級種子液轉接到相應三級種子罐進行放大培養I 21d，濃縮收集菌體，得到三級種子液；二級種子液和三級種子液的培養條件為:pH 6.0 10.0，溫度10 35°C，DO 0.5 4.0mg/L，通氣量0.4 0.6m3/h，攪拌速度110 150rpm ;向三級種子液中添加微生物助劑，按照各菌株所需的比例混合即獲得微生物菌劑；所述的微生物助劑是穩定劑和/或保護劑； 步驟(I)和(2 )中所述的固體培養基和液體培養基組成為:牛肉膏3 5g/L，蛋白胨6 12g/L，氯化鈉3 6g/L，蒸餾水1L，固體培養基中再加入1.5 2.5%瓊脂；步驟(3)所述的一級種子液所用的培養基組成為:(NH4)2SO4 0.5 5g/L，葡萄糖0.5 lg/L，MgSO40.01 0.02g/L, K2HPO4 0.1 0.3g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸餾水 IL ;二級種子液和三級種子液所用的培養基組成為:尿素0.5 5g/L，葡萄糖I 3g/L，K2HPO4 0.1 0.3g/L, MgSO4 0.01 0.02g/L, FeSO4.7H20 0.05 0.1 g/L,蒸餾水 1L。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中:所述的穩定劑選自甘油、乙醇的一種或其混合物；所述的保護劑選自活性炭粉末、硅藻土的一種或其混合物。
6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的濃縮方法為自然沉降、離心或者過濾。
7.權利要求1所述的曬氨副球菌(/Iaracoccw1S在處理含氮化工廢水中用途。
8.權利要求2或3所述的微生物菌劑或者權利要求4或5或6所述的制備方法制得的微生物菌劑在處理含氮化工廢水中用途。
全文摘要
本發明是一種噬氨副球菌(Paracoccusaminovorans)LH-N40CGMCCNo.6971。本發明還公開了一種異養硝化好氧反硝化微生物菌劑，該微生物菌劑含有噬氨副球菌LH-N40組成。本發明還公開了該微生物菌劑制備方法。本發明的微生物菌劑不僅能解決傳統反應器中總氮難脫除的問題，而且能夠在同一反應器中有效脫除水體中的氨氮和總氮，同時對廢水中的酚類、胺類、雜環類、氰類、多環芳烴類等有毒物質具有耐受性或降解能力，特別適用于含氮化工廢水，處理工藝簡單，效果穩定，耐環境毒物沖擊，在各種含氮化工廢水處理中有著非常廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/01GK103146605SQ20131006152
公開日2013年6月12日 申請日期2013年2月27日 優先權日2013年2月27日
發明者楊志林, 董自斌, 田鳳蓉, 張彬彬, 徐軍, 云干, 王開春, 劉德敏 申請人:中藍連海設計研究院