專利名稱：通過糖多孢紅霉菌sace_7301基因途徑提高紅霉素產量的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及一種提高發酵生產紅霉素產量的方法，尤其涉及一種通過增加糖多孢紅霉菌染色體上正向調控基因SACE_7301提高紅霉素產量的方法。
背景技術：
放線菌次級代謝產物具有廣泛的用途，如抗生素、抗癌劑、免疫調節劑、驅蟲劑、昆蟲防治劑。目前發現的23000種生物活性次級代謝產物中，有10000多種是放線菌產生的。然而，這些次級代謝物原始產量非常低，需要通過篩選才能獲得工業生產高產菌株。過去工業生產菌株主要通過隨機物理或化學誘變方法獲得。傳統的隨機誘變技術不但耗時，而且無法指導對育種進行理性設計。本發明目的就是通過基因工程途徑定向改變基因來獲得紅霉素高產菌株，用于紅霉素或中間產物生產。糖多孢紅霉菌是1952年從土壤中分離出的革蘭氏陽性絲狀放線菌，其次級代謝產物紅霉素A是重要的廣譜大環內酯類抗生素，目前紅霉素系列化學衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、羅紅霉素、泰利霉素等)被廣泛用來治療感染性疾病。由于紅霉素及其衍生物每年的世界銷售量達數百億美元，吸引了許多科學家來研究如何提高其產量。2007年，Oliynyk等報道了糖多孢紅霉菌NRRL23338的基因組序列，但糖多孢紅霉菌調控基因研究很少，到目前為止只有bldD(SACE_2077)和SACE_7040的調控基因研究報道，及我們申報的發明專利(申請號 201210099708.8)。原核生物的轉錄調控子可以分為LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、Lac1、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR> NtrC (EBP)、OmpR> DeoR、Cold shock、GntR 和 Crp 等 16 個家族，其中TetR家族成員在DNA結合域方面具有螺旋_轉角-螺旋(HTH)的結構特征。TetR家族在細菌中普遍存在，大約有2000多個成員，但到目前為止人們只發現100多個成員的特征。糖多孢紅霉菌染色體上有 101個TetR家族基因，其中有些基因可能參與紅霉素生物合成。
發明內容
本發明目的就是通過增加糖多孢紅霉菌中正向調控基因SACE_7301拷貝，提高紅
霉素產量。本發明是通過以下技術方案實現的:—種構建紅霉素高產菌株的技術方法，所述的方法為:通過基因工程途徑使糖多孢紅霉菌SACE_7301基因拷貝數增加或提高SACE_7301基因表達量，獲得糖多孢紅霉菌紅霉素高產工程菌株，用所述的菌株發酵生產紅霉素。以SACE_7301為出發點構建紅霉素高產菌株的技術方法，其特征在于以糖多孢紅霉菌SACE_7301基因或其表達產物為出發點，尋找到與紅霉素生物合成相關的新基因或蛋白，通過對尋找到的所有相關基因進行失活、增加拷貝、提高表達量等辦法構建糖多孢紅霉菌紅霉素高產菌株，用于發酵生產紅霉素或中間產物。本發明的優點是:
本發明研究中篩選到了紅霉素生物合成正向調控子SACE_7301，通過基因工程途徑增加糖多孢紅霉菌染色體上SACE_7301基因拷貝，能夠獲得紅霉素高產菌株，為工業生產提高紅霉素發酵產量提供技術支持。糖多孢紅霉菌A226中敲除SACE_7301基因時紅霉素產量降低了 34.5%，而在ASACE_7301基因突變株中回補SACE_7301基因，紅霉素產量部分恢復，表明SACE_7301是一個參與紅霉素生物合成的正向調控子。當在糖多孢紅霉菌A226中增加SACE_7301基因拷貝時，紅霉素產量較出發菌株提高9.5%，說明在糖多孢紅霉菌中提高SACE_7301基因拷貝，可以構建紅霉素高產菌株。同時，紅霉素生物合成基因調控是一個網絡，通過基因工程途徑改變SACE_7301基因或產物的上下游調控因子，也可構建紅霉素高產菌株，用于提高發酵紅霉素產量。
圖1為染色體同源重組技術示意圖硫鏈絲菌肽抗性基因(tsr)替換了糖多孢紅霉菌A226染色體上SACE_7301基因；圖2為SACE_7301基 因在糖多孢紅霉菌染色體上的位置及編碼氨基酸序列參見 NCBI (http:1Iwm.ncb1.nlm.nih.gov/gene term=SACE 7301 及 http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/nuccore/134096620 report=genbank&from=8107531&to=8108388)；圖3為Λ SACE_7301突變體鑒定及紅霉素產量分析(A) ASACE_7301 突變體鑒定:SACE_7301 基因(660bp)被 tsr 抗性基因(1360bp)替換后長度增加了 700bp ；M, 5000bp DNA Marker(B)糖多孢紅霉菌出發菌株A226、突變菌株ASACE_7301及回復菌株Δ SACE_7301/pZMW7301 (對照為 Λ SACE_7301/pZMW)在 TSB 培養基中 30°C發酵 6 天產物HPLC分析；圖4為SACE_7301基因過表達及紅霉素產量分析(A)A226/ pZMW7301過表達菌株PCR鑒定:PCR產物為pZMW載體上apr抗性基因(776bp) ；M, 5000bp DNA Marker(B)糖多孢紅霉菌出發菌株A226、SACE_7301過表達菌株A226/ pZMW7301 (對照為A226/pZMW)在TSB培養基中30°C發酵6天產物HPLC分析。
具體實施例方式實施例11.1菌株、質粒與生長條件試驗中使用到的菌株和質粒見表I。大腸桿菌在37° C的液體LB (Luria-Bertani)培養基或在添加1.25%瓊脂的LB平板上培養。紅霉素生產菌糖多孢紅霉菌A226及其工程菌株在30° C胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養基或在含有2.2%瓊脂的R3M平板上培養。1.2材料、DNA操作與測序PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫鏈絲菌肽、安普霉素從Sigma公司購買。TSB、酵母提取物、蛋白胨購買于Oxoid公司。甘氨酸、瓊脂粉、氯化鈉和其它生物學試劑都購于試劑公司。大腸桿菌和糖多孢紅霉菌的一般操作技術按照標準操作。引物的合成和DNA測序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。表I試驗中使用到的菌株和質粒
權利要求
1.SACE_7301基因的新功能:SACE_7301基因產物可以正向調控紅霉素生物合成。
2.—種構建紅霉素高產菌株的技術方法，其特征在于所述的方法為:通過基因工程途徑使糖多孢紅霉菌SACE_7301基因拷貝數增加或提高SACE_7301基因表達量，獲得糖多孢紅霉菌紅霉素高產工程菌株，用所述的菌株發酵生產紅霉素。
3.根據權利要求1所述的SACE_7301基因的新功能，其特征在于以糖多孢紅霉菌SACE_7301基因或其表達產物為出發點，尋找到與紅霉素生物合成相關的新基因或蛋白，通過對尋找到的所有相關基因進行失活、增加拷貝、提高表達量等辦法構建糖多孢紅霉菌紅霉素高產菌株，用于發酵生產紅霉素或中間產物。
全文摘要
本發明公開了一種通過糖多孢紅霉菌SACE_7301基因途徑提高紅霉素產量，其特征在于所述的方法為通過基因工程途徑使糖多孢紅霉菌SACE_7301基因拷貝數增加或提高SACE_7301基因表達量，獲得糖多孢紅霉菌紅霉素高產工程菌株，用所述技術獲得的菌株發酵可以提高紅霉素產量。
文檔編號C12N1/21GK103205451SQ20131008276
公開日2013年7月17日 申請日期2013年3月15日 優先權日2013年3月15日
發明者張部昌, 劉敬濤, 吳杭, 袁莉 申請人:安徽大學