一種適合富含多糖類植物的干燥葉片dna提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種適合多糖類植物干燥葉片的DNA提取方法，包括干燥葉片研磨、去糖、裂解、抽提、沉淀、洗滌和檢測等步驟。其中，去糖是本發明的關鍵，在核膜沒有裂解釋放出基因組DNA之前，加入預熱的去糖緩沖液，在65℃水浴條件下懸浮葉片組織溶液，可以使多糖及其他次生代謝物質溶解于緩沖液中，再通過低速離心去除多糖等雜質，使最后沉淀得到的DNA具有較高的濃度和純度。本發明適用于所有櫻屬植物及其它富含多糖類植物的干燥成熟葉片，如果是幼嫩葉片則會增加所得DNA的濃度，在成熟葉片中一樣能夠得到較多較高質量的DNA。
【專利說明】一種適合富含多糖類植物的干燥葉片DNA提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學【技術領域】，涉及一種適合富含多糖類植物的干燥葉片DNA提取方法，尤其涉及一種適合櫻屬植物的干燥葉片的DNA提取方法。
【背景技術】
[0002]獲得高質量(高濃度、高純度、高完整性)的DNA是分子生物學實驗最關鍵的第一步，目前，已經發展了多種方法，成功地從植物葉片、愈傷組織、組培苗、果實、韌皮部等組織器官中提取出DNA。但是植物材料由于大都含有種類繁多的次生代謝物質，有些情況下，不同植物甚至是同一種類植物組織材料的來源、部位外在性質的不同以及化學成分、組織結構等內在特點的差異，在提取基因組DNA時需要選擇不同的方法或作一些特殊的處理。從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質的木本植物中提取的方法難度就相對大于大多數的禾谷類及蔬菜類植物，獲得的DNA溶液常常黏度大乃至呈膠狀，是植物DNA提取中最常見現象，主要原因是多糖、酚類在提取過程中與DNA共沉淀，形成包裹DNA的黏稠膠狀物，難以溶解或產生褐變，獲得的DNA常出現產量低、質量差、易降解，嚴重影響了 DNA質量和純度，不能被限制 性內切酶酶切，嚴重的甚至不能作為模板進行PCR擴增。所以，如何高效簡便地去除多糖、多酚等次生代謝物質，對提取純化植物DNA來說至關重要。
[0003]櫻屬植物為典型的多年生木本果樹作物，其成熟葉片中富含大量酚類物質和多糖，尤其多糖含量極為豐富，所得DNA粗提液為粘稠膠狀物，流動性極差，嚴重限制后續分子實驗的進行。目前傳統方法一般都是采取春季幼嫩未完全展開的葉片進行提取且多采用新鮮或冷凍的材料，其相對于干燥成熟葉片所含的此生代謝物質較少，所得DNA勉強可以供后續對DNA質量要求不高的實驗使用。但由于受時間和實驗進度的影響，再加上春季取樣時間極短及取樣地距離的影響，獲得幼嫩葉片難度較大，通常需在夏季取硅膠干燥的成熟葉片。對于干燥的成熟葉片采用傳統的提取方法很難的到理想的DNA。
[0004]因此，針對櫻屬及其它植物干燥成熟葉片富含多糖、多酚及其它次生代謝產物的特點，高效簡便地去除多糖、多酚等次生物質，對提取純化植物DNA來說至關重要，同時為夏秋季無法獲得幼葉等其它幼嫩材料時從事果樹基因組研究提供新的方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于克服櫻屬及其它富含多糖類植物干燥成熟葉片DNA提取難度大的問題，提供一種適合多糖類植物干燥葉片的DNA提取方法。本發明采用中國櫻桃地方品種、中國櫻桃野生植株、毛櫻桃和歐洲甜櫻桃的硅膠干燥成熟葉片為材料，提取高質量的DNA。
[0006]其技術方案為:
[0007]一種適合多糖類植物干燥葉片的DNA提取方法，包括以下步驟:
[0008]I)取變色硅膠干燥的葉片0.5-1.0g,加PVP與V。的研缽中加液氮研磨成粉；
[0009]2)將研磨好的葉片粉末轉入2.0ml離心管中，每管0.2-0.4g，加入1.5ml65°C預熱的去糖緩沖液和10 μ I β -巰基乙醇，充分混合后在65°C水浴IOmin ；
[0010]3)在常溫下5000rpm離心3min,棄上清,收集沉淀；
[0011]4)在沉淀中加入lml65 °C預熱的3 %的CTAB和10 μ I β -巰基乙醇，65 V水浴40min或Ih時，期間每隔5_10min顛倒離心管以使液體混勻，然后常溫下12500rpm離心IOmin ；
[0012]5)取上清液轉入新的2.0ml的離心管中，加入等體積的氯仿，輕搖萃取5min，直到氯仿相溶液變色，在8°C下12500rpm離心IOmin ；
[0013]6)上清液轉入新的2.0ml離心管中，重復步驟5)；
[0014]7)取上清液約600 μ I轉入新的1.5ml離心管中，加入2倍體積經_20°C預冷的無水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉,顛倒混勻_20放置30min, 1000Orpm離心15min,棄
上清，收集沉淀；
[0015]8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800μ 1，輕搖并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗兩次，再用無水乙醇清洗一次，置于通風處過夜吹干；
[0016]9) DNA沉淀用50 μ I TE溶解，置于_20°C冰箱保存備用；
[0017]10)取2 μ I溶解的DNA溶液，經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白質分析儀上檢測260nm、280nm處的吸收值和DNA的濃度，并根據0D260/0D280值來判斷 DNA的純度。
[0018]步驟I)中所述的去糖緩沖液為lmol/L氯化鈉；0.lmol/L Tris-HCl PH8.0 ；
0.02mol/L EDTAPH8.0 ；0.4mol/L 葡萄糖。
[0019]步驟4)中所述的 CTAB 為 1.5mol/lNaCl ；0.lmol/L Tris-Hcl PH8.0 ；0.02mol/LEDTAPH8.0 ;2% PVP。
[0020]其中上述步驟I)中所述的研磨時加PVP與V。各0.2-0.5g，材料干燥良好時可以選擇不加，研磨一定要充分、快速。
[0021]步驟2)中在向2.0ml離心管中加粉末前，可預先在離心管中加入去糖緩沖液在65°C水浴中預熱，待材料研磨成粉末后迅速加入離心管，搖勻水浴即可。
[0022]步驟3)中在常溫離心，離心轉速為3000-6000rpm，否則沉淀積到管底很難分散。
[0023]步驟4)中加入CTAB裂解液后應及時充分搖勻，盡可能的呈懸浮液，水浴過程中隔3-5min上下輕搖一次，保證裂解充分。
[0024]步驟5)中抽提時只用氯仿即可，加苯酚效果反而不好，加入氯仿后充分搖勻。
[0025]步驟6)中可根據抽提離心后兩個液相之間的蛋白質層的多少確定抽提次數，直到中間沒有蛋白質層為止。
[0026]步驟7)中沉淀所有無水乙醇最少要加2倍體積，若沉淀液顏色較深的話適量多加醋酸鈉可有效去除顏色。
[0027]步驟8)中洗滌沉淀的75%乙醇至少要800 μ 1，洗滌次數可根據情況增加，最后用無水乙醇洗滌吹干。
[0028]與現有技術相比，本發明的有益效果為:
[0029]本發明采用多糖含量很多的櫻屬植物干燥成熟葉片為材料提取DNA，采用本發明所述的提取方法流程能有效去除葉片組織中的多糖，所得到的DNA純度高，0D260/0D280 =
1.76-1.87 ；0D260/0D230 = 1.93-2.16、完整性和流動性好，可迅速溶解于水或者TE，溶解后不會析出沉淀，溶液不粘稠，0.6%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小集中于40K-60K之間。
[0030]1、本發明所述方法采用干燥的成熟葉片為提取材料，相較于以往用新鮮或冰凍的幼嫩才來來說，該方法對提取材料的要求寬松，可以在葉片生長的任何時候取材，獲得的基因組DNA能夠滿足后續實驗要求。
[0031]2、本發明方法在懸浮液裂解前，采用去糖緩沖液水浴懸浮葉片組織溶液，可以使在核膜裂解前多糖和其它此生代謝物質充分溶解于緩沖液當中，通過低速離心可以使細胞核及其它組分沉淀，而多糖和其它此生代謝物質一同被除去。相對于在沉淀時去多糖的方法更有效的防治DNA的損失。
[0032]3、采用本發明的方法可以縮短提取時間至2.5小時，實驗流程相對簡化。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0033]圖1是用傳統方法提取的櫻屬植物的總基因DNA，經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果;
[0034]圖2是用本發明的方法提取的櫻屬植物的總基因組DNA，經過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。
【具體實施方式】
[0035]下面結合附圖和 【具體實施方式】對本發明的技術方案作進一步說明。
[0036]一種適合多糖類植物干燥葉片的DNA提取方法，包括以下步驟:
[0037]I)取變色硅膠干燥的中國櫻桃、歐洲甜櫻桃(紅燈)、野生中國櫻桃以及毛櫻桃葉片各0.5-1.0g,加0.3gPVP與V。的研缽中加液氮迅速研磨成粉，若研磨不充分，則增加液氮研磨次數；
[0038]2)將研磨好的葉片粉末迅速轉入2.0ml離心管中，每個樣品3管，每管大約
0.2-0.4g 加入 1.5ml65°C預熱的去糖緩沖液(lmol/L 氯化鈉；0.lmol/L Tris-HCl PH8.0 ；
0.02mol/L EDTAPH8.0 ；0.4mol/L葡萄糖;)和10 μ I β -巰基乙醇，充分混合后在65°C水浴IOmin ；
[0039]3)在常溫下5000rpm離心3min,棄上清,收集沉淀；
[0040]4)在沉淀中加入 lml65°C預熱的 3% 的 CTAB(1.5mol/lNaCl ；0.1moI/LTris-HcIPH8.0 ；0.02mol/LEDTAPH8.0 ；2% PVP ；3% CTAB)和 10 μ I β -巰基乙醇，65°C水浴 lh，其間每隔5min顛倒離心管以使液體混勻,然后常溫下12500rpm離心IOnin ；
[0041]5)取上清液轉入新的2.0ml的離心管中，加入等體積的氯仿，輕搖萃取5min，直到氯仿相溶液變色，在8°C下12500rpm離心IOmin ；
[0042]6)上清液轉入新的2.0ml離心管中，重復步驟5)(可多次重復);
[0043]7)取上清液約600 μ I轉入新的1.5ml離心管中，加入2倍體積經_20°C預冷的無水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，輕輕顛倒混勻-20放置30min, 1000Orpm離心15min,棄上清,收集沉淀；
[0044]8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800 μ 1，輕搖并放置5min，輕輕倒掉乙醇，如此清洗兩次，再用無水乙醇清洗一次，置于通風處過夜吹干；
[0045]9) DNA沉淀用40 μ I TE溶解，置于_20°C冰箱保存備用。[0046]10)取2 μ I溶解的DNA溶液，經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖2所示，從左往右依次為中國櫻桃、歐洲甜櫻桃、野生中國櫻桃、毛櫻桃各3個。
[0047]11)取2 μ I溶解的DNA溶液稀釋50倍后，在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白質分析儀上檢測260nm、280nm處的吸收值和DNA的濃度，并根據0D260/0D280及0D260/0D230值來判斷DNA的純度，如表1所示。
[0048]表1
【權利要求】
1.一種適合多糖類植物干燥葉片的DNA提取方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)取變色硅膠干燥的葉片0.5-1.0gJP PVP與V。的研缽中加液氮研磨成粉； 2)將研磨好的葉片粉末轉入2.0ml離心管中，每管0.2-0.4g，加入1.5ml65°C預熱的去糖緩沖液和10 μ I β -巰基乙醇，充分混合后在65°C水浴IOmin ； 3)在常溫下5000rpm離心3min,棄上清,收集沉淀； 4)在沉淀中加入lml65°C預熱的3%的CTAB和10μ I β -巰基乙醇，65°C水浴40min或Ih時,期間每隔5-10min顛倒離心管以使液體混勻,然后常溫下12500rpm離心IOmin ； 5)取上清液轉入新的2.0ml的離心管中，加入等體積的氯仿，輕搖萃取5min，直到氯仿相溶液變色，在8°C下12500rpm離心IOmin ； 6)上清液轉入新的2.0ml離心管中，重復步驟5)； 7)取上清液約600μ I轉入新的1.5ml離心管中，加入2倍體積經_20°C預冷的無水乙醇和1/10體積的3mol/L的醋酸鈉，顛倒混勻-20放置30min, 1000Orpm離心15min,棄上清，收集沉淀； 8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800μ 1，輕搖并放置5min，倒掉乙醇，如此清洗兩次，再用無水乙醇清洗一次，置于通風處過夜吹干； 9)DNA沉淀用50 μ I TE溶解，置于_20°C冰箱保存備用； 10)取2μ I溶解的DNA溶液，經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，并在EppendorfBiophotomete型核酸蛋白質分析儀上`檢測260nm、280nm處的吸收值和DNA的濃度，并根據0D260/0D280值來判斷DNA的純度。
2.根據權利要求1所述的適合多糖類植物干燥葉片的DNA提取方法，其特證在于，步驟I)中所述的去糖緩沖液為lmol/L氯化鈉；0.lmol/L Tris-HCl PH8.0 ；0.02mol/LEDTAPH8.0 ；0.4mol/L 葡萄糖。
3.根據權利要求1所述的適合多糖類植物干燥葉片的DNA提取方法，其特征在于，步驟 4)中所述的 CTAB 為 1.5mol/lNaCl ；0.lmol/L Tris-Hcl PH8.0 ；0.02mol/L EDTAPH8.0 ；2% PVP。
4.根據權利要求1-3任一項適合多糖類植物干燥葉片的DNA提取方法，其特征在于，所述多糖類植物為櫻屬植物。
【文檔編號】C12N15/10GK103756994SQ201310091005
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2013年3月21日 優先權日:2013年3月21日
【發明者】王小蓉, 陳濤, 湯浩茹, 劉澤靜, 陳清, 張勇, 羅婭, 黃曉姣, 陳嬌 申請人:四川農業大學