專利名稱：提高金霉素產量的方法及其重組表達載體和基因工程菌的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及通過FADH2依賴型氯化酶基因和FAD還原酶基因聯合應用提高金霉素產量的方法，還涉及含FADH2依賴型氯化酶基因和FAD還原酶基因的重組載體和基因工程菌。
背景技術：
自上個世紀70年代，隨著分子克隆技術的出現，以及對細胞生物學的深入研究，使基因工程技術成為遺傳改造的常規手段。基因工程技術的應用在一定范圍內克服了傳統育種技術的隨機性和盲目性，在改良工業菌種方面獲得了巨大的成功。例如:在井R霉素生物合成過程中，通過強啟動子超量表達m)P-葡萄糖焦磷酸酶的方式增加糖基供體UDP-葡萄糖的供給，能夠有效的提高井R霉素的產量，并且能夠顯著地減少前體有效氧胺的大量積累(Zhou X et al Over-expression of UDP-glucose pyrophosphorylase increasesvalidamycin A but decreases validoxylamine A production in Streptomyceshygroscopicus var.jinggangensis 5008.MetabolicEngineering,2011,13 (6):768-76)。金霉素(Chlortetracycline,aureomycin,氯四環素)作為第一個發現的四環素類抗生素，產生菌株為金色鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens),但是金色鏈霉菌在發酵過程中不僅產生金霉素，還能夠產生一定比例的四環素(約8%)。為了提高金霉素產量，通過遺傳育種和優化發酵條件的方法，但是通過遺傳育種獲得的提高金霉素產量的能力有限。而金霉素與四環素的區別是前者比后者在C7位多一個氯原子，金霉素生物合成過程中，基因簇中的FADH2依賴的氯化酶催化完成氯代反應(圖1)。因此，氯代反應是否為金霉素生物合成的瓶頸步驟，是利用基因工程手段提高金霉素產量亟待解決的技術問題，為進一步提高金霉素的產量具有重要意義。
發明內容
有鑒于此，本發明的目的在于提供一種FADH2依賴型氯化酶基因和FAD還原酶基因的聯合應用，打破金霉素合成途徑中的限速步驟，獲得高產金霉素的基因工程菌株。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案:
FADH2依賴型氯化酶基因ctcP和FAD還原酶基因ctcQ在金色鏈霉菌(泣aureofaciens)中提高金霉素產量的應用,所述FADH2依賴型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ ID N0.3中第11-1687位所示，所述FAD還原酶基因CiM的核酸序列如SEQ ID N0.6中第11-586位所示。本發明的可以應用于含金霉素合成途徑的任意菌株中，優選為金色鏈霉菌(S trep tomyces aureofacien s^ F3,保藏號為 CCTCC NO: M 2013080。金色鏈霉菌{Streptomyces aureofaciens)F3為金河生物科技股份有限公司經過長期馴化和不斷篩選獲得適于工業生產的菌株，與常規的金色鏈霉菌菌株相比活性更高，產金霉素能力更強。
本發明的目的之二在于提供含FADH2依賴型氯化酶基因ctcP和FAD還原酶基因ctcQ的基因工程菌，提供高產金霉素的菌株。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案:
含有所述FADH2依賴型氯化酶基因CiM和FAD還原酶基因ctcQ的基因工程菌。優選的,所述工程菌為金色鏈霉菌mreofaciens')。更優選的,所述工程菌為金色鏈霉菌保藏號為CCTCC NO: M 2013080。本發明的目的之三在于提供含FADH2依賴型氯化酶基因ctcP和FAD還原酶基因CicP的重組表達載體，技術方案為:
含有所述FADH2依賴型氯化酶基因CiM和FAD還原酶基因ctcQ的重組表達載體。本發明的目的之四載體提供重組表達載體的制備方法，技術方案為:
所述重組表達載體的制備方法，由以下步驟制備:
a.用帶酶切位點的引物克隆FADH2依賴型氯化 酶基因cic八然后連接至pIB139載體強啟動子/下游，得到質粒PJTU4303 ；
b.用帶酶切位點的引物克隆FAD還原酶基因cic認然后連接至pIB139載體強啟動子Pernm下游，得質粒PJTU4304，
c.將步驟b所得質粒PJTU4304進行酶切，切下含強啟動子和FAD還原酶基因ctcQ的片段，然后連入線性化的質粒PJTU4303中，得到含FADH2依賴型氯化酶基因ctcP和FAD還原酶基因ctcQ的重組載體。優選的，所述步驟a中，所述帶酶切位點的引物如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所
/Jn ο優選的，所述步驟b中，所述帶酶切位點的引物如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所
/Jn ο優選的，所述步驟c是重組質粒PJTU4304用HindIII酶切，回收含強啟動子PermE*和FAD還原酶基因ctcQ片段并將回收片段用Klenow I酶補平；同時用EcoRV線形化PJTU4303質粒，將補平的含強啟動子和FAD還原酶基因ctcQ片段連接入線性化的pJTU4303質粒中，得重組表達載體。本發明的有益效果在于:本發明通過聯合應用FADH2依賴型氯化酶基因CiM和FAD還原酶基因ctcQ,過表達FADH2依賴型氯化酶和FAD還原酶，打破金霉素合成途徑中的瓶頸步驟，將FADH2依賴型氯化酶基因CiM和FAD還原酶基因海建重組表達載體，然后轉化入金色鏈霉菌中，提高金霉素的產量，與原始菌株相比金霉素產量提高了 18.89%，并且提高了金霉素組分的比例(金霉素/四環素提高了 1-2%);利用本發明的方法構建高產金霉素的菌株，制備方法簡單，突破了遺傳育種的瓶頸，為提高金霉素產量提供了新的思路。
為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖進行說明:
圖1為金霉素和四環素的化學結構。圖2為PJTU4303質粒和pJTU4304質粒構建構流程圖。
圖3為整合型質粒PJTU4305構建流程圖。圖4為金色鏈霉菌PCR檢測；F3泳道為工業菌株陰性對照，pIB泳道為空質粒PIB139空質粒對照；泳道1-12為基因工程菌。圖5為金色鏈霉菌F3及金色鏈霉菌ZT03發酵產物HPLC檢測結果(A:發酵液的提取液色譜檢測圖:金色鏈霉菌F3與金色鏈霉菌ZT03中金霉素含量檢測結果)。菌種保藏
本發明中金色鏈霉菌iStreptomyces aureofaci ens )F3是金河生物科技股份有限公司從金色鏈霉菌中經過長期馴化和不斷篩選獲得的適于工業生產的菌株，該菌株與常規金色鏈霉菌相比活性更高，產金霉素能力更強，金霉素產量達20g/L。將分離獲得的金色鏈霉菌{Streptomyces送中國典型培養物保藏中心保藏,保藏編號為CCTCC NO:
M 2013080，地址位于中國武漢武漢大學，保藏日期為2013年3月13日，分類命名為金色鏈霉菌(S trep tomyces aureofaci ens ) F3。
具體實施例方式下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例1
構建含FADH2依賴型氯化酶基因ctcP和FAD還原酶基因ctcQ的重組表達質粒，具體為整合型質粒。根據FADH2依賴的氯化酶基因ctcP序列(Genebank:132939)設計擴增ctcP基因的P C R引物，并在上游引物的5 ’端引入N d e I酶切位點，下游引物的5 ’端引入No 11，具體引物如下:
上游引物 ctcPF:5’- ggaattccatatgaccgacacaaccgc-3’ (SEQ ID N0.1),下劃線序列為NdeI位點，黑體為起始密碼子；
下游引物 ctcPR:5，-gcggccgcaagcttctacggcttgacccgcatcg-3，(SEQ ID N0.2),下劃線序列為NotI位點，黑體為終止密碼子。然后以金色鏈霉菌F3基因組DNA為模板，SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示序列為引物進行PCR擴增，PCR體系為:0.1 μ g模板DNA，引物各50 pmol，4 μ DMSO, 2μ L Mg2+，5 μ L dNTP，5 μ L緩沖液和I個單位KOD DNA聚合酶(TOYOTA)，加入無菌水至50 μ L ；PCR擴增條件為:95°C預變性5分鐘；95°C變性30秒，60°C退火30秒，68°C延伸36秒，32個循環；最后68°C后延伸5分鐘，獲得如SEQ ID N0.3所示核苷酸序列，其中11-1678位為CiM基因編碼區。然后將PCR擴增產物用NdeI和NotI雙酶切，酶切產物連入經NdeI和NotI雙酶切的帶紅霉素抗性基因的PIB139載體中，得到質粒pJTU4303，構建流程如圖2所示(pIB139質粒是含有紅霉素抗性基因強啟動子PermE*的鏈霉菌整合型質粒，發表于 Wilkinson C.J., Hughes-Tomas ZA, Martin CJ, Bohm I, Mironcnko T,Dcacon M,Wheaterofe Μ,Wirtz G,Staunton J, Leadlay PF.1ncreasing the efficiencyof heterologo us promoters in actinomycetes.J Mol Microb Biotech,2002,4 (4):417-426.)。根據FAD還原酶基因(Genebank:132939)設計引物序列，具體如下:
上游引物 ctcQF:5’-ggaattccatatgccccccgaacccctgtccc-3’ (SEQ ID N0.4),下劃線序列為NdeI位點；
下游引物 ctcQR:5，-gcggccgcaagctttcagccctcggccgccagggtc-3，(SEQ ID N0.5),下劃線序列為NotI位點。按照與上述同樣的方法擴增FAD還原酶基因ctcQ,獲得如SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，其中11-586位為基因編碼區。然后將PCR擴增產物用NdeI和NotI雙酶切，將酶切產物連入經NdeI和NotI雙酶切的帶紅霉素抗性基因的PIB139載體中，得到重組質粒PJTU4304，構建流程如圖2所示。然后將重組質粒PJTU4304用HindIII酶切，回收1.9kb的含強啟動子和 基因片段，并將回收片段用Klenow I酶補平黏性末端；同時用EcoRV線形化pJTU4303
質粒，將補平的含強啟動子和ctcQ基因片段連入線性化的PJTU4303質粒中，得到含FADH2依賴型氯化酶基因CiM和FAD還原酶基因ctcQ的整合型質粒pJTU4305(圖3)。實施例2
將構建的整合型質粒PJTU4305通過大腸桿菌與鏈霉菌雙親之間的接合轉移，轉入金色鏈霉菌F3。具體步驟包括:將構建的整合型質粒PJTU4305通過42°C熱激轉入大腸桿菌ET12567 (PUZ8002)中，挑選單克隆轉化子接種LB液體培養基，該液體培養基中添加終濃度為25 Pg/mL的氯霉素，50 Pg/mL的卡那霉素和30 Pg/mL的阿伯拉霉素(大腸桿菌ET12567(pUZ8002)發表于 Paget, M.S., Chamberlin, L., Atrih, A., Paget, Μ.S.et.al.Evidencethat the extracytoplasmic function sigma factor σ E is required for normalcell wall structure in Streptomyces coelicolor A3 (2).J.Bacteriol，1999，181:204-211.)。然后將陽性克隆子在37°C過夜培養，按體積分數為10%接種量轉入5 mL含有相同抗生素的新鮮LB液體培養基中，37°C培`養2-3小時后收集菌體，用新鮮LB培養基洗滌菌體3次備用。將鏈霉菌孢子懸于5 mL TES緩沖液中，該緩沖液濃度為0.05 mol/L,pH8.0 ;然后在50°C水浴中熱激10分鐘，冷卻至室溫后，按大腸桿菌:鏈霉菌孢子比例IO8:108等量混合涂布于SFM培養基平板上，吹干后置于30°C培養箱中培養16小時，用I mL含有50 ng萘啶酮酸、30 ng阿伯拉霉素的無菌水覆蓋平板，吹干后置于30°C培養箱中培養5-8天后挑選接合子單克隆。實施例3
挑取結合子單克隆，在含濃度為30 Pg/mL的阿伯拉霉素的LB固體培養基上劃單菌落，并在30°C培養箱中培養，待產孢后在無抗性的LB固體培養基上松弛，30°C培養6-7天后用20%甘油收集孢子。孢子用10_4、10'10'ΙΟ,濃度梯度稀釋涂含阿伯拉霉素的平板，30°C培養3天后挑選單菌落個數合適的平板單菌落接種10.3%YEME液體培養基，然后提取基因組DNA進行PCR驗證，驗證引物序列如下:
上游引物 M13F(-47): 5，-cgccagggttttcccagtcacgac-3，(SEQ ID N0.7)；
下游引物 M13R(_48): 5，-agcggataacaatttcacacagga-3，(SEQ ID N0.8)。檢測結果如圖4所示，即獲得陽性克隆，命名為金色鏈霉菌ZT03。將金色鏈霉菌ZT03用含體積分數為20%甘油的燕麥平板保存(燕麥平板具體配方:3.4%(w/v)，MgSO40.005%, KH2PO4 0.01%, (NH4)2HPO4 0.015%，終濃度為 30 Pg/mL 的阿伯拉霉素)。實施例4
將保存的金色鏈霉菌ZT03接種于燕麥液體培養基中(終濃度為30 Pg/mL的阿伯拉霉素)，在30°C培養5-8天后用20%甘油收集孢子，將收集的孢子按體積百分比為1%的比例接種于30 mL種子培養基中，然后再30°C搖床培養24小時后按體積百分比為5%的接種量接種100 mL發酵培養基，容器為500 mL帶彈簧的三角瓶，30°C搖床培養4_5天。本實施例中使用的種子培養基配方為(w/v):玉米淀粉4.0%，黃豆餅粉2.0%，酵母粉0.5%，蛋白胨0.5%，碳酸鈣0.4%，硫酸銨0.3%，氯化鈉0.2%，硫酸鎂0.025%，磷酸二氣鐘0.025%，聞壓滅囷。本實施例中使用的發酵培養基配方為(w/v):玉米淀粉8.0%，黃豆餅粉4.0%，酵母粉0.1%，蛋白胨1.4%，玉米漿0.8%，碳酸鈣0.7%，硫酸銨0.35%，氯化鈉0.25%，硫酸鎂0.025%，分裝之后按1.5 mL/30-35 mL體積比加入豆油，高壓滅菌。實施例5
將實施例4中的發酵液用草酸酸化使pH值至1.5-2.0,然后在5000 rpm/min條件下離心10 min，收集上清液，得提取液，于-20°C避光凍存。將制備的提取液進行HPLC檢測，色譜條件為:安捷倫公司液相色譜儀，色譜柱為〇18反向柱(5.0 Mm,4.6 mmX250 mm);流動相 A:0.02 M 草酸/0.01 M 三乙基胺(TEA,pH2.0)，流動相B:乙腈，流速為1.0 mL/min，柱溫為25-28°C，檢測波長360 nm，進樣前用體積分數為20%乙腈等濃度洗脫， 進樣前樣品用孔徑為0.45 μ 的濾膜過濾，結果如圖5A所示。由圖5A可知，金霉素和四環素保留時間分別為8.5分鐘和19.6分鐘二者能夠很好分離。將金色鏈霉菌F3和金色鏈霉菌ZT03在相同的條件下進行發酵，分離純化發酵液，然后進行HPLC檢測，檢測結果如圖5B所示。由圖5B可知，與原始金色鏈霉菌F3相比，金色鏈霉菌ZT03，金霉素產量提高了 18.89%，從原始菌株的20 g/L提高到23.78 g/L，金霉素組分的比例(金霉素/四環素)提高了 1_2%。最后說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.FADH2依賴型氯化酶基因CiM和FAD還原酶基因ci在金色鏈霉菌(aureofaciens)中提高金霉素產量的應用,所述FADH2依賴型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ ID N0.3中第11-1687位所示，所述FAD還原酶基因CiM的核酸序列如SEQ ID N0.6中第11-586位所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于:所述金色鏈霉菌為金色鏈霉菌(Streptomyces aareo/aciefls) F3,保藏號為 CCTCC NO: M 2013080。
3.含有FADH2依賴型氯化酶基因CiM和FAD還原酶基因ctcQ的基因工程菌，所述FADH2依賴型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ ID N0.3中第11-1687位所示，所述FAD還原酶基因ctcQ的核酸序列如SEQ ID N0.6中第11-586位所示。
4.根據權利要求3所述的基因工程菌，其特征在于:所述工程菌為金色鏈霉菌(S trep tomyces aureofaciens)。
5.根據權利要求3所述的基因工程菌，其特征在于:所述工程菌為金色鏈霉菌(S trep tomyces aareo/aciefls) F3,保藏號為 CCTCC NO: M 2013080。
6.含有FADH2依賴型氯化酶基因ctcP和FAD還原酶基因ctcQ的重組表達載體，所述FADH2依賴型氯化酶基因ctcP的核酸序列如SEQ ID N0.3中第11-1687位所示，所述FAD還原酶基因ctcQ的核酸序列如SEQ ID N0.6中第11-586位所示。
7.權利要求6所述重組表達載體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下: a.用帶酶切位點的引物克隆FADH2依賴型氯化酶基因cic八然后連接至pIB139載體強啟動子/下游，得到質粒PJTU4303 ； b.用帶酶切位點的引物克隆FAD還原酶基因cic認然后連接至pIB139載體強啟動子PermE務下游,得質粒pJTU4304 ； c.將步驟b所得質粒PJTU4304進行酶切，切下含強啟動子和FAD還原酶基因ctcQ的片段并連入線性化的質粒PJTU4303中，得含FADH2依賴型氯化酶基因ciM和FAD還原酶基因ctcQ的重組載體。
8.根據權利要求7所述重組表達載體的制備方法，其特征在于:所述步驟a中，所述帶酶切位點的引物如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
9.根據權利要求7所述重組表達載體的制備方法，其特征在于:所述步驟b中，所述帶酶切位點的引物如SEQ ID N0.4和SEQ ID N0.5所示。
10.根據權利要求7所述重組表達載體的制備方法，其特征在于:所述步驟c是重組質粒PJTU4304用HindIII酶切，回收含強啟動子和FAD還原酶基因ctcQ片段并將回收片段用Klenow I酶補平；同時用EcoRV線形化pJTU4303質粒，將補平的含強啟動子PermE*和FAD還原酶基因ctcQ片段連接入線性化的pJTU4303質粒中，得重組表達載體。
全文摘要
本發明公開了提高金霉素產量的方法及其重組表達載體和基因工程菌，通過利用FADH2依賴型氯化酶基因ctcP和FAD還原酶基因ctcQ構建重組表達載體，將重組表達載體轉化至金色鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)中獲得高產金霉素的基因工程菌株，獲得的工程菌株通過超量表達FADH2依賴型氯化酶基因ctcP和FAD還原酶基因ctcQ打破金霉素合成途徑中氯代反應的瓶頸，從而提高金色鏈霉菌中金霉素的產量；該菌株的獲得為提高金霉素產量、降低金霉素生產成本奠定了基礎。
文檔編號C12N1/21GK103205481SQ201310112649
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月2日 優先權日2013年4月2日
發明者謝昌賢, 由德林, 朱濤, 劉運添, 王鵬飛, 李蘭枝, 鄧子新 申請人:金河生物科技股份有限公司, 上海交通大學