專利名稱：利用玉米胚芽鞘節誘導的愈傷組織轉化外源基因的方法
技術領域：
本發明所屬的技術領域是農業生物技術領域和作物育種領域。
背景技術：
玉米是世界五大作物之一，在我國乃至全世界的糧食生產中都占有舉足輕重的地位。在提高玉米單產的諸多因素中，新品種選育的作用約占40%。隨著分子生物學技術的長足發展，轉基因技術、分子標記輔助育種技術等生物高新技術開始在玉米新品種選育中發揮重要的作用，它們具有許多不同于傳統育種技術的獨特優勢，因此受到了國內外育種工作者的高度重視。轉基因技術是根據育種目標，利用現代生物技術手段從供體生物中分離目的基因，經DNA重組與遺傳轉化導入受體作物，經過篩選獲得穩定表達的轉基因株系，結合田間試驗與大田選擇育成轉基因新品種或新種質。轉基因育種最大的優點是針對性很強，可以根據目標性狀定向選擇合適的基因導入需要改良的作物中，以達到預期的目的。通過轉基因技術的應用，不僅可以提升傳統育種的研發效率，而且提升了育種研發的準確率、減少盲目性和重復浪費，豐富了傳統的育種手段，使作物育種的產業發展水平邁向新的臺階。目前，轉基因育種在大豆、玉米、棉花和油菜等作物中已經取得了巨大的成功，其中，轉基因玉米已經成為僅次于轉基因大豆的全球種植面積第二大的轉基因作物。在研發轉基因作物新品種時，最重要的技術環節之一就是作物遺傳轉化技術。目前玉米最常用的遺傳轉化方法主要是農桿菌介導法，所用的材料可分為幼胚和非幼胚類型，其中前者還包括直接用幼胚或幼胚誘導的胚性愈傷組織進行遺傳轉化，而后者包括直接用莖尖分生組織和利用成熟胚、葉片、莖尖等誘導的胚性愈傷組織等作為材料進行再生。幼胚和幼胚誘導的胚性愈傷組織操作相對簡單，植株再生比較容易，轉化率也較高，是玉米轉基因中最常用的受體材料。但是幼胚轉化所用的受體材料基因型限制嚴重、材料易受季節和溫室條件限制，不能夠持續不斷的高通量的進行玉米轉化，在產業化應用上具有很大的局限性。非幼胚類型的材料中，直`接用莖尖分生組織雖然轉化和再生容易，且不受基因型限制，但轉化率低，獲得的再生植株大多是嵌合體，后代需要做大量的篩選工作。而采用成熟胚、葉片、莖尖等材料較難誘導出胚性愈傷組織，再生較困難。我們基于玉米胚芽鞘節作為材料進行轉化相對于玉米幼胚的轉化而言，轉化效率略低，但是由于其不受溫室條件和生長季節的限制，操作簡便，可以實現高通量、持續不斷的遺傳轉化，因而在玉米的商業化轉基因研發中，具有相當大的應用潛力。
發明內容
本發明的目的是提供一種新的玉米轉基因方法，是利用玉米萌發種子的胚芽鞘節誘導出I型愈傷組織，并對愈傷組織進行擴繁。采用根癌農桿菌介導的方法將外源基因轉入愈傷組織中，獲得轉基因玉米。從而建立一種取材方便、規模大、轉化效率高的玉米轉基因方法。
本發明的轉化方法包括以下步驟:I)將滅菌的種子置于發芽培養基中培養，萌發獲得幼苗；2)從上述步驟I)中得到的幼苗上切取胚芽鞘節，接種于愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織；3)將上述步驟2)中得到的愈傷組織進一步繼代；4)用農桿菌介導法侵染和共培養轉化上述步驟3)中得到的愈傷組織；5)將上述步驟4)中的愈傷組織在含有除草劑的篩選培養基上篩選2-3輪，獲得抗除草劑愈傷組織；6)將上述步驟5)中得到的抗性愈傷組織置于胚狀體誘導培養基中，得到玉米愈傷組織胚狀體；7)將上述步驟6)中得到的愈傷組織胚狀體置于再生培養基中，得到再生苗；8)將上述步驟7)中得到的再生苗置于生根培養基中，獲得具有3-4條根的玉米再生植株；發芽培養基是MS +麥芽糖40g/L +酶水解酪蛋白0.lg/L +谷氨酰胺0.5g/L +2-嗎啉乙磺酸 2g/L + MgCl2.6H20 1.6g/L +抗壞血酸 0.lg/L + 6-BA 3mg/L + 毒莠定0.0lg/L ；愈傷組織誘導培養基是MS +蔗糖30g/L +維生素B10.5mg/L +酶水解酪蛋白0.5g/L + 脯氨酸 1.5g/L + 硝酸銀 5mg/L + 2, 4-D 1.5_5mg/L + 毒莠定 0-0.001mg/L ；侵染培養基是MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L +脯氨酸0.2g/L + 200 μ M乙酰丁香酮；·共培養培養基是MS +蔗糖30g/L +脯氨酸0.7g/L + 2，4-D 1.5mg/L +硝酸銀5mg/L + L-半胱氨酸300mg/L + 二硫代蘇糖醇150mg/L +酶水解酪蛋白0.5g/L + 200 μ M乙酰丁香酮；篩選培養基是MS+蔗糖30g/L+脯氨酸0.7g/L + 2，4-D 1.5mg/L +硝酸銀5mg/L +羧芐霉素 500mg/L ；胚狀體誘導培養基是MS +蔗糖30g/L +脯氨酸0.7g/L + 6-BA 2mg/L +羧芐霉素 250mg/L ；再生培養基是MS +蔗糖20g/L +肌醇0.lg/L +羧芐霉素100mg/L ；步驟2)所述的胚芽鞘節是指幼苗凸起的頂端分生組織；步驟3)所述的繼代是將步驟2)所獲得的愈傷組織在愈傷組織誘導培養基上培養增殖，得到增殖的愈傷組織；步驟4)所述的農桿菌介導法包括固體法或液體法處理農桿菌步驟；步驟8)獲得的再生植株需進行煉苗后再移栽到土壤中。本發明的主要技術效果在于:I)本發明采用的胚芽鞘節可隨時由成熟種子發芽獲取，不受季節限制，在冬季也無需像幼胚一樣在溫室或南繁獲取，因此取材方便、費用低廉；2)發明采用的胚芽鞘節誘導愈傷組織效率比成熟胚、葉片高，且單個胚芽鞘節可獲取2-3次愈傷組織，因此容易實現大規模的遺傳轉化；3)發明采用胚芽鞘節誘導的I型愈傷組織狀態要明顯好于由成熟胚、葉片獲得的愈傷組織，容易轉化成II型愈傷組織，從而分化成苗；4)發明采用遺傳轉化機理最清楚、轉化能力最強的的根癌農桿菌介導法，能有效地提高轉化效率；5)禾本科的種子在胚芽外具有胚芽鞘的特殊結構，種子萌發時其生長迅速對胚芽起先導和保護作用。因此，本發明不僅應用于玉米遺傳轉化，也可應用于具有胚芽鞘特殊結構的禾本科植物的遺傳轉化，如小麥、水稻等。
圖1為玉米萌芽的種子。圖2為切取的玉米胚芽鞘節。圖3為胚芽鞘節誘導出愈傷組織。圖4為愈傷組織的擴繁。圖5為愈傷組織共培養。圖6⑶S染色。圖7愈傷組織第一輪篩選。圖8愈傷組織第二輪篩選。圖9抗性愈傷組織的獲得。
圖10抗性胚狀體。圖11分化成苗。圖12生根煉苗。圖13 PCR 檢測。
具體實施例方式下面結合具體實施對本發明作進一步說明，但本發明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規方法。實施例一玉米種子胚芽鞘節愈傷組織的誘導1.種子滅菌處理首先將玉米種子中的雜物清理干凈、選取飽滿完整的種子，然后將其放于容器中用蒸餾水清洗3遍，期間劇烈震蕩以清理附著表面的殘余物。于超凈臺上用75%的酒精浸泡3分鐘,然后用質量濃度5.25%的次氯酸鈉浸泡20分鐘,最后用滅菌水沖洗5-6次。2.發芽培養將滅菌后的種子置于發芽培養基中，注意要將種子的胚朝上水平接種于發芽培養基中。于培養室(16h/d光照，光強80-100 μ E/m2/s，溫度26-28°C )培養7-10天。上述發芽培養基是MS +麥芽糖40g/L +酶水解酪蛋白0.lg/L +谷氨酰胺0.5g/L + MES (2-嗎啉乙磺酸)2g/L + MgCl2.6H20 1.6g/L +抗壞血酸 0.lg/L + 6-BA 3mg/L + 毒莠定 0.01g/Lo3.胚芽鞘節的切取將已長出的幼苗切下來，放入一個滅菌的空皿中，用解剖刀切下幼苗胚芽鞘節區域上下各0.5cm。將莖段縱向一分為二。
4.愈傷組織的誘導將胚芽鞘節創傷面接觸培養基，放于愈傷誘導培養基中，10-16個材料/皿，光照培養室中培養(16h/d光照，光強80-100 μ E/m2/s，溫度28°C)。愈傷誘導期間不定期進行胚芽鞘節大芽子的切除，2-4周后，將胚性愈傷組織轉至新的愈傷誘導培養基中。28°C暗培養2-4周，即可誘導出愈傷組織。上述愈傷誘導培養基是MS +蔗糖30g/L + VB1 (維生素B1) 0.5mg/L +酶水解酪蛋白 0.5g/L+脯氨酸 1.5g/L+硝酸銀 5mg/L + 2，4-D 1.5_5mg/L + 毒莠定 0-0.0Olmg/L05.觀察統計表I為三個玉米基因型胚芽鞘節的發芽率和愈傷組織誘導率。這三個玉米基因型為普通玉米品種，可商購獲取。表I玉米胚芽鞘節發芽率和愈傷組織誘導率
權利要求
1.一種外源基因轉化方法，包括以下步驟: 1)將滅菌的種子置于發芽培養基中培養，萌發獲得幼苗； 2)從上述步驟I)中得到的幼苗上切取胚芽鞘節，接種于愈傷組織誘導培養基上誘導愈傷組織； 3)將上述步驟2)中得到的愈傷組織進一步繼代； 4)用農桿菌介導法侵染和共培養轉化上述步驟3)中得到的愈傷組織； 5)將上述步驟4)中的愈傷組織在含有除草劑的篩選培養基上篩選2-3輪，獲得抗除草劑愈傷組織； 6)將上述步驟5)中得到的抗性愈傷組織置于胚狀體誘導培養基中，得到玉米愈傷組織胚狀體； 7)將上述步驟6)中得到的愈傷組織胚狀體置于再生培養基中，得到再生苗； 8)將上述步驟7)中得到的再生苗置于生根培養基中，獲得具有3-4條根的玉米再生植株; 上述發芽培養基是MS +麥芽糖40g/L +酶水解酪蛋白0.lg/L +谷氨酰胺0.5g/L +2-嗎啉乙磺酸 2g/L + MgCl2.6H20 1.6g/L +抗壞血酸 0.lg/L + 6-BA 3mg/L + 毒莠定0.0lg/L ； 愈傷組織誘導培養基是MS +蔗糖30g/L +維生素B10.5mg/L +酶水解酪蛋白0.5g/L + 脯氨酸 1.5g/L + 硝酸銀 5mg/L + 2, 4-D 1.5_5mg/L + 毒莠定 0-0.001mg/L ； 侵染培養基是MS+蔗糖68.5g/L+葡萄糖36g/L+脯氨酸0.2g/L + 200 μ M乙酰丁香酮； 共培養培養基是MS +蔗糖30g/L +脯氨酸0.7g/L + 2，4_D 1.5mg/L +硝酸銀5mg/L + L-半胱氨酸300mg/L + 二硫代蘇糖醇150mg/L +酶水解酪蛋白0.5g/L + 200 μ M乙酰丁香酮； 篩選培養基是MS+蔗糖30g/L+脯氨酸0.7g/L + 2，4-D 1.5mg/L +硝酸銀5mg/L +羧芐霉素500mg/L ； 胚狀體誘導培養基是MS十蔗糖30g/L+脯氨酸0.7g/L + 6-BA 2mg/L十羧芐霉素250mg/L ； 再生培養基是MS +蔗糖20g/L +肌醇0.lg/L +羧芐霉素100mg/L。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟2)所述的胚芽鞘節是指幼苗凸起的頂端分生組織。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于:步驟3)所述的繼代是將步驟2)所獲得的愈傷組織在愈傷組織誘導培養基上培養增殖，得到增殖的愈傷組織。
4.如權利要求3所述的方法，其特征在于:步驟4)所述的農桿菌介導法包括固體法或液體法處理農桿菌步驟。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于:步驟8)獲得的再生植株需進行煉苗后再移栽到土壤中。
6.如權利要求1一 5任一所述的方法，其特征在于:所述方法用于禾本科植物的外源基因轉化。
7.如權利要求1一 5任一所述的方法 ，其特征在于:所述方法用于玉米植物的外源基因轉化。
全文摘要
本發明涉及一種利用玉米胚芽鞘節誘導的愈傷組織轉化外源基因的方法，屬于農業生物技術和作物育種領域。主要包括以下步驟(1)將滅菌的玉米種子置于發芽培養基中培養，萌發獲得幼苗；(2)從幼苗上切取胚芽鞘節誘導愈傷組織；(3)對愈傷組織進行繼代擴繁，采用根癌農桿菌介導法將外源基因轉入；(4)經過3-4輪篩選獲得抗性愈傷組織；(5)分別進行胚狀體誘導和分化獲得轉基因再生苗；(6)對再生苗進行PCR檢測驗證外源基因是否轉入。本方法受體材料不受季節限制、取材方便，再生能力強，較容易地實現玉米大規模的遺傳轉化。
文檔編號C12N15/82GK103194485SQ20131013290
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者萬向元, 吳鎖偉, 趙虎基, 方才臣, 張丹鳳, 肖中華, 劉艷艷, 徐媛媛, 王燕, 安學麗, 王超 申請人:北京金冠豐生物技術有限公司