一種柑橘果實特異性啟動子及應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種柑橘果實特異性表達啟動子及應用。

背景技術：

我國柑橘水果產量達到3300多萬噸，成為世界第一柑橘生產大國。柑橘產量基本供需平衡，市場對果實品質提出更高要求。消費要求從“好看、好吃”發展到“色、香、味、形”兼備，培育和改良優良品質的柑橘新品種是當前柑橘產業發展的新需要。

在基因功能及遺傳改良研究中，為了使外源基因在受體生物中高效穩定地表達，應用組成型強啟動子(如35S)來驅動目的基因超量表達成為研究者常用的策略之一。但組成型啟動子驅動外源基因在植物全株均高效表達，造成植物體內營養的大量消耗，往往影響了植物的生長發育，對于解析基因功能或遺傳改良均不利。

技術實現要素：

有鑒于此，本發明的第一目的在于一種柑橘果實特異性啟動子，所述柑橘果實特異性啟動子具有SEQ ID NO.1所示序列，即具有以下序列：

5'-TGTATTGAGAGCAGTTGGGGTTTTATTTGATGCGTCTTTAATCACATTAAAAACCTTTTGTTTGACGCGTCTGTGCTTATTTTGAACAGCAAAAAGGTTAAAAGATTTCATGTATAAAGCGCTTCTACTCTTGATTTTGTCAAATTTTGAGTTCAATTGGTTCTGGAGAAGGTTCAGATCTTTAGGTTGCTAAAATGTAATTGGAGGTTTGTACCTTTATCCTACTTTTGCCTTAAATAACAAGAGTGGATTTCACTCAATTTTTTGTTGCAGATAAAGGCCGGAAAGGACCCAGACATCTATAGATGCATTTATAATAGAAATAATACGGATGAGGCCCTGAGACACATCTAACTTAATTTTAATAATATGGTGAAGTTTGTGAAACTCAACTTTGTAGCAAGTCTTCATATTTAGTGTGTGTGTTTATTATGCATTTGCAGTTTGGTCTAATTTTAATTGAACCTTCTTAACTGTATTGCATATACTCAGTTGGTGATTGCACGAGGAAATTTGCAGTAGAAATCATGACTCATGGGTTGGGAAGTTTAGGGATGAATGTGCGCAACTTTAAACATGAAATGAAAAACCTTTTTTTCTTTTTCTTTTTCTTTTTCACACGCAATTTTCCAAATGCCGACATTTCTCCATGTTTCGGACCGCAGGCAAACTTTTACAATTTGACGGACTCAAGGACCAGAGAGCCCAGAATTTACCGGGCCTTTACCTCGTATTTGGTTATTGGGCTTTTTTCTGCAGAATTGGACCGAGAAATTGGGCCAGCTCAAGAAACTGTTGGCACTGCAAGGCAACTAGTCACTGGGTAGTGACTCATTCTGGTTCCAGAAATCGAACAGTGCGTGCTCCGTTGTCAGATGTAAAGATTGACAAAGTGTGTGTGGCCGGGACAATAAAGAAAAAGGCCGAAGAACCCAAATGGATCAGATTCTAACGCGGACTAGTACGAAGAAGATCGAAACAATGCTGTGCTTGTGTTGAGTCTCATAATTGGAAAGGCAAAAACAGTCCATCCAAATGATAACAATGATTTTGAAGAGGCCTTGAAAGAATTTTGTTGACTTGGCGGCGCGTTATTAAGAAATTTTCAGGCAAAGGCTATTTTCTATCTAATTTTAGTGATGTCTATCAGATTATAATAAGCAGGGCGGCTGCCTATTTTCTATTCTAATTTTACAAAATTTTGCTCCCAAAACCCAAGCCATTTTTAAGCTCACCTGATTATATCCTCTTGGCAAATTGTTCCACTACACAATTTTTGAAGGAGGCGTTTGGTTAGTTATCGATCAGAAGGTATGTACATTTAAGTGATTATCAGGAATTGCGGCAGTTTAATCTACCGGGCTAAACACATATATTTTTGAGAATTATATTACAATTTACTGATATTTTCAGGAAGCCTAAACCCATGTAACTAAAGCACAGTCGGAGCCCTAATGAGCATTGCAAAAATATTAATTGTGTCAAATAGAAATGAGATCTACCCTCACTTAATCACAATTTTTTTTAAAAAAAGTAATAGGAAGTTCGATCTAATGCATTTTTGGAAGCCGGTTAATGAAGTTTGAATTTACTCAATGTGCTTGTAATAGAAATTGGATATGTCCCAATTACTGTTATTTCTCTTGGTATTTATTTTTATTCTTAGATAATCAAAAATATAAAATTTAGGCTTTTATTATGTTATATAATTATGTAACAATCGTGGAATGAAATCCAACGATTATAAAAATATAAGATAAAAAATTATATTATTTTTACAATCGTTAAATTTTTAATTTAACGATTGTATAATTATATATGTTACATCGTTATATAACATAATAATCATCATAAATTTAATATTTTTTGTGCTTTTAAAAAGTTAACAGGAAGAAGATTGCAGGGAATTGCATTGTCGGGAAAATCATTGATGCCTTTGAAGACATATACGGTGGATAGAAGAGAGAGATGGTAAAAGCATTAAGCTAATTAAATATTACCGATAAAGAAGACACGTGGCAACAAGAGATGGCCCGCGAAGGCACCAGAGATTTCGTCTAATAGAAAGCATCCAGAATCCTCTACATAAATCATATTAGTCCTATATATAGGCCTCTCTTGTCTCATCCTTCTCCATCTTCAAATTGATTGATCAAAGCATTTCCGAAGTTGTTGAGCATTTAATTAGCGTCCCAGTTTGCCATA-3'。

優選地，本發明所述柑橘果實特異性啟動子具有SEQ ID NO.1所示序列至少90％以上同源性，且具有啟動外源基因在柑橘果實特異性表達的功能。

優選地，本發明所述柑橘果實特異性啟動子為SEQ ID NO.1所示序列修飾后的序列，且具有啟動外源基因在柑橘果實特異性表達的功能。

本發明的另一目的在于提供一種重組表達載體，所述重組表達載體包括具有SEQ ID NO.1所示序列的柑橘果實特異性啟動子。

優選地，本發明所述重組表達載體包括SEQ ID NO.1所示序列至少90％以上同源性的啟動子，或SEQ ID NO.1所示序列修飾后的啟動子，且具有啟動外源基因在柑橘果實特異性表達的功能。

本發明的再一目的為提供一種重組微生物，上述重組微生物由上述重組表達載體分別轉化微生物所獲得。

優選地，本發明所述微生物是土壤農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)。

更優選地，本發明土壤農桿菌包括具有SEQ ID NO.1所示序列至少90％以上同源性，或SEQ ID NO.1所示序列修飾后的序列的啟動子，且具有啟動外源基因在柑橘果實特異性表達的功能。

本發明還提供了上述柑橘果實特異性啟動子、重組表達載體或重組微生物在植物轉化中的應用；其中，所述在植物轉化中的應用還可以為在柑橘果實改良中的應用。

本申請發明人將甜橙Cs8g18360基因起始密碼子5'上游2.2Kb左右序列作為該基因的啟動子序列，將該啟動子命名為CFP1。經發明實施例驗證，該啟動子為果實特異性啟動子。此啟動子序列還未見到任何報道或闡述，本發明的啟動子區或其變體適于與任何目的基因融合，所形成的構建物轉入植物當中使目的基因在植物細胞中表達。

本發明所闡明的柑橘果實特異性啟動子區可以作為一個啟動子序列插在重組基因構建物中而用于植物的轉化。在這一植物基因表達構建物當中，啟動子區具有本發明所示的序列或任何與之相關的有啟動子活性的變體。它所連接的是除了以天然形式存在的此柑橘果實特異性啟動子以外的任何目的基因序列；目的基因的DNA序列可以來自同源植物、外源植物、真菌、藻類、細菌、病毒或動物基因；也可以是人工設計、合成的DNA序列。目的基因可以是單一的基因或一系列的基因。在植物細胞中目的基因適合于轉錄為功能性的RNA；還可以是mRNA，再通過核糖體翻譯成蛋白質；或可以抑制與之相關mRNA翻譯的RNA形式。兩者都能造成細胞生化成分及相關過程的變化。因此，此目的基因可以是一段編碼有功能的蛋白質或其一部分的正義序列，或一段反義序列。可以利用多種轉化手段將本發明所涉及的植物表達構建物轉入植物當中，任何適合于植物或植物細胞的轉化方法都可以使用；如用含有重組Ti質粒的農桿菌侵染，電擊法，細胞和原生質體顯微注射法，基因槍轉化法和花粉管導入法等。然后被轉化的細胞在合適條件下可以再生成完整的植株，前面所描述的嵌合基因構建物已穩定整合于其基因組之中；也可以是含有這種轉化細胞的植物組織或植株，以及由其衍生出的植株或得出的種子。

本發明還進一步提供了一個控制植物基因表達的方法。在植物基因表達構建物中柑橘果實特異性啟動子與目的基因相連接，此啟動子可以被激活而驅動目的基因的表達。為了研究此啟動子序列的功能特征，可以將此柑橘果實特異性啟動子片段與報告基因連接。常用的報告基因有CAT基因、GUS基因、熒光素酶(luciferase，LUC)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因等。GFP熒光反應不需要外加底物和輔助因子，只需紫外光或藍光激發，即可發出綠色熒光，用熒光顯微鏡甚至肉眼就可以觀察到。而且對于單細胞水平的表達也可識別。

本實施例通過克隆SEQ ID NO.1所示的啟動子序列，將該啟動子序列通過gateway克隆技術同源重組至pKGWFS7表達載體，載體結構如圖1，表達載體構建示意圖如圖2，以帶有35S啟動子的pKGWFS7重組質粒為陽性對照，農桿菌介導法分別轉化山金柑，利用體式熒光顯微鏡檢測GFP基因的表達。

附圖說明

圖1為pKGWFS7載體結構圖；

圖2為啟動子表達載體構建示意圖；

圖3為目的啟動子序列的擴增，A為CFSP1-F/CFSP1-R在紅夏橙基因組DNA中的擴增結果，B為35S-F/35S-R在pBI121質粒DNA中的擴增結果，圖中M代表1Kb DNA ladder；

圖4為利用attB1/attB2進行PCR陽性驗證的結果，A為CFP1啟動子的PCR驗證結果，B為35S啟動子的PCR驗證結果。圖中M代表1Kb DNA ladder；

圖5為gateway克隆一輪PCR擴增結果。圖中M代表1Kb DNA ladder；

圖6為gateway克隆二輪PCR擴增結果。圖中M代表1Kb DNA ladder；

圖7為LR反應PCR陽性驗證結果。圖中M代表1Kb DNA ladder；

圖8為農桿菌菌液PCR陽性驗證結果，A為pKGWFS7-5'/P1-3'在包含CFP1重組表達載體的農桿菌菌液中的擴增結果，B為pKGWFS7-5'/35S-3'在包含35S重組表達載體的農桿菌菌液中的擴增結果。圖中M代表1Kb DNA ladder；

圖9為轉基因山金柑PCR陽性鑒定結果，A為attB1/attB2在35S::GFP中的擴增結果，B為pKGWFS7-5'/P1-3'在CFP1::GFP中的擴增結果。圖中M代表1Kb DNA ladder，1-15各數字代表受檢測的獨立轉基因系，P代表質粒陽性對照，W代表未轉基因的陰性對照；

圖10為不同山金柑組織GFP表達情況。圖中S代表莖，L代表葉，O代表子房及花托，OS為子房切面圖。圖中標尺為2mm。

具體實施方式

以下通過具體實施例進一步對本發明的技術方案進行說明，應理解以下僅為本發明的示例性說明，并不用于限制本發明權利要求的保護范圍。

實施例1

1.啟動子序列克隆與表達載體構建

(1)以甜橙基因組數據庫(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)中Cs8g18360基因及5'上游序列作為參考序列，設計、合成引物。以紅夏橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]基因組DNA為模板，引物對CFSP1-F/CFSP1-R擴增包含SEQ ID NO.1所示啟動子序列的DNA片段；以pBI121質粒DNA為模板，引物對35S-F/35S-R擴增35S啟動子序列。PCR反應體系如下：25μl 2X Phanta Max Buffer，1μl dNTP Mix(10mM each)，1μl Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(1U/μl)(均購自于南京諾唯贊生物)，200ng模板DNA，正、反向引物各20μM，ddH₂O補充至終體積50μl。熱循環參數為：95℃(預變性)3min，1個循環；95℃(變性)30sec，57℃(退火，擴增35S啟動子序列使用55℃)30sec，72℃(延伸)80sec(擴增35S啟動子序列使用30sec)，32個循環；72℃(終延伸)5min，1個循環；12℃保存。

(2)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，分別切取2.3Kb、0.85Kb左右大小的目的條帶，使用Gel Extraction Kit(Omega，USA)回收目的條帶DNA。圖3為啟動子序列擴增結果。

(3)使用Cloning Kit(購自于北京全式金生物)將回收產物與Cloning Vector進行連接，熱激轉化至大腸桿菌Trans5α。

(4)挑取單克隆細胞擴繁，PCR驗證陽性，結果如圖4所示。陽性克隆菌液送武漢擎科創新生物科技有限公司測序，測序序列與甜橙基因組參考序列比對，序列正確的菌液提取質粒，置于-20℃保存。

(5)利用引物對attB1+P1-F/attB2+P1-R，attB1+35S-F/attB2+35S-R，以上述測序正確的質粒為模板進行gateway克隆一輪PCR擴增，擴增結果如圖5所示。

(6)利用引物對attB1/attB2，以上述PCR產物為模板分別進行gateway克隆二輪PCR擴增,擴增結果如圖6所示。1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，分別切取0.9Kb、2.3Kb左右大小的目的條帶，使用Gel Extraction Kit(Omega，USA)回收目的條帶DNA。

(7)上述回收產物與中間載體pDONR207進行BP反應并轉化大腸桿菌Trans5α。BP反應使用Invitrogen公司的BPII酶進行催化，反應體系如下：V(回收產物)＝質粒大小*16.5/質粒濃度(ng/μl)，V(pDONR207)＝5.5*16.5/質粒濃度(ng/μl)，V(ddH₂O)＝2-(X+Y)，V(BP Clonase)＝0.5μl，25℃水浴12-16h。

(8)挑取單克隆細胞擴繁，PCR驗證陽性，陽性克隆菌液送武漢擎科創新生物科技有限公司測序，測序序列與甜橙基因組參考序列比對，序列正確的菌液提取質粒。測序正確的質粒與終載體pKGWFS7進行LR反應并轉化大腸桿菌Trans5α。LR反應使用Invitrogen公司的LRII酶進行催化，反應體系如下：V(質粒)＝質粒大小*16.5/質粒濃度(ng/μl)，V(pKGWFS7)＝質粒大小*16.5/質粒濃度(ng/μl)，V(ddH₂O)＝2-(X+Y)，V(LR Clonase)＝0.5μl，25℃水浴12-16h。

(9)挑取單克隆細胞擴繁，利用引物對pKGWFS7-5'/35S-3'，pKGWFS7-5'/P1-3'，分別進行PCR陽性驗證，結果如圖7所示。陽性克隆菌液送武漢擎科創新生物科技有限公司測序，測序序列與甜橙基因組參考序列比對，序列正確的菌液提取質粒，置于-20℃保存。

其中，本實施例中引物對(依次為SEQ ID NO.2～NO.14)如下：

[1]引物對

2.農桿菌介導法轉化山金柑(Fortunella hindsii Swingle)：

(1)柑橘外植體準備。

將山金柑種子用自來水清洗干凈，于1M NaOH中浸泡10min去除果膠，然后流水沖洗干凈；在超凈臺上將種子置于有效氯濃度為3％的次氯酸鈉溶液中浸泡15min(期間搖動2-3次)，進行種子表面滅菌，無菌蒸餾水洗滌3-5次。在超凈臺上，用無菌手術刀和鑷子將種子外表皮剝除，接種于MT播種培養基中。暗培養1周后轉至光培養2個月左右。切取0.8-1.5cm長的上胚軸用于遺傳轉化，采取斜切的方式，使上胚軸生理學上下端的切口處于同一面。

(2)土壤農桿菌的制備。

步驟2中提取并測序正確的終載體質粒加入200ul農桿菌EHA105感受態中，冰浴30min，液氮速凍5min，再37℃水浴5min，冰浴2min，加入800ulLB液體培養基，28℃，200rpm，培養4-5h。2000-3000rpm離心菌液2min，棄上清，取下層200ul菌液涂含50mg/L壯觀霉素和25mg/L利福平的LB平板。28℃培養48h，挑單克隆細胞擴繁，利用引物對pKGWFS7-5'/35S-3'，pKGWFS7-5'/P1-3'分別進行PCR擴增檢測。圖8為PCR陽性驗證結果。

(3)農桿菌侵染液的制備。驗證為陽性的農桿菌于固體LB培養基(含有50mg/L壯觀霉素和25mg/L利福平)上涂平板，28℃培養2d。用無菌手術刀刮取菌體于懸浮培養基中，180rpm，28℃，振蕩培養1.5-2h備用，用紫外分光光度計檢測菌液濃度，調整OD₆₀₀在0.8-1.2。

(4)侵染與共培養。將切好的外植體浸泡在制備好的農桿菌菌液中，靜置侵染20min后棄菌液，用無菌吸水紙吸干外植體表面菌液，切口朝上置于共培培養基上，21℃暗培養3d。

(5)共培養后的山金柑上胚軸置于含400mg/L頭孢霉素的無菌蒸餾水中清洗5min，之后無菌蒸餾水清洗3-5次，無菌吸水紙吸干外植體表面水分，置于生芽培養基上光照培養，培養溫度26±2℃，光照強度1500-2000Lx，每日光照16h。每個月繼代一次。

(6)待山金柑上胚軸切口處再生抗性芽長出三至四片葉時，將其接種至生根培養基誘導生根。待根長達到2-3CM時，將再生抗性苗從培養基中取出，洗凈殘留的培養基，移栽至盛有滅菌腐殖質基質的有孔塑料杯中培養1周，注意保溫保濕。之后移栽至小盆中，視其生長情況移栽至大盆中培養。

[2]培養基配方:

[3]基本培養基：MT(Murashige and Tucker，1969)

[4]播種培養基：MT+蔗糖25g/L+瓊脂8g/L

[5]懸浮培養基：MT+麥芽提取物0.5g/L+L-谷氨酰胺1.5g/L

[6]共培培養基：MT+AS 20mg/L

[7]生芽培養基：MT+BA 0.5mg/L+KT 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+瓊脂8.0g/L+卡那霉素50mg/L+頭孢霉素400mg/L

[8]生根培養基：1/2MT+NAA 0.5mg/L+IBA 0.1mg/L+活性炭0.5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂8.0g/L+卡那霉素25mg/L+頭孢霉素400mg/L

上述培養基pH調至5.8-6.0。

3.轉基因山金柑陽性檢測：

(1)采用改良的CTAB法提取移栽至大盆的抗性植株基因組DNA。

(2)利用引物對attB1/attB2、pKGWFS7-5'/P1-3'分別擴增分析獲得的抗性植株基因組DNA。PCR反應體系如下：5μl TaqMix，正反向引物各0.2μl(10μM)，DNA 1μl(50-150ng/μl)，ddH₂O補充至終體積10μl。熱循環參數為：95℃(預變性)5min，1個循環；95℃(變性)30sec，55℃(退火)30sec，72℃(延伸)1min，32個循環；72℃，8min，1個循環；12℃保存。

(3)1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，陽性鑒定結果如圖9所示，35S有10個陽性轉基因系，CFP1有2個陽性轉基因系。

其中，引物對如下：

[9]引物對(SEQ ID NO.10～14)

4.山金柑不同組織GFP基因表達情況檢測：鑒定為陽性的轉基因山金柑，采集葉、莖和子房檢測GFP基因表達情況。所用儀器為體式熒光顯微鏡(Leica MZFLIII)，濾光片為GFP。經鑒定，如圖10所示，轉基因未成功的陰性對照(CK)各組織均無綠色熒光，35S::GFP各組織均有綠色熒光，而CFP1::GFP中，莖、葉均無綠色熒光，但子房出現綠色熒光。我們知道，子房發育成果實，說明該啟動子具有果實特異性。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 華中農業大學

<120> 一種柑橘果實特異性啟動子及應用

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2205

<212> DNA

<213> Citrus sinensis（L.）Osbeck

<400> 1

tgtattgaga gcagttgggg ttttatttga tgcgtcttta atcacattaa aaaccttttg 60

tttgacgcgt ctgtgcttat tttgaacagc aaaaaggtta aaagatttca tgtataaagc 120

gcttctactc ttgattttgt caaattttga gttcaattgg ttctggagaa ggttcagatc 180

tttaggttgc taaaatgtaa ttggaggttt gtacctttat cctacttttg ccttaaataa 240

caagagtgga tttcactcaa ttttttgttg cagataaagg ccggaaagga cccagacatc 300

tatagatgca tttataatag aaataatacg gatgaggccc tgagacacat ctaacttaat 360

tttaataata tggtgaagtt tgtgaaactc aactttgtag caagtcttca tatttagtgt 420

gtgtgtttat tatgcatttg cagtttggtc taattttaat tgaaccttct taactgtatt 480

gcatatactc agttggtgat tgcacgagga aatttgcagt agaaatcatg actcatgggt 540

tgggaagttt agggatgaat gtgcgcaact ttaaacatga aatgaaaaac ctttttttct 600

ttttcttttt ctttttcaca cgcaattttc caaatgccga catttctcca tgtttcggac 660

cgcaggcaaa cttttacaat ttgacggact caaggaccag agagcccaga atttaccggg 720

cctttacctc gtatttggtt attgggcttt tttctgcaga attggaccga gaaattgggc 780

cagctcaaga aactgttggc actgcaaggc aactagtcac tgggtagtga ctcattctgg 840

ttccagaaat cgaacagtgc gtgctccgtt gtcagatgta aagattgaca aagtgtgtgt 900

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ttggcggcgc gttattaaga aattttcagg caaaggctat tttctatcta attttagtga 1140

tgtctatcag attataataa gcagggcggc tgcctatttt ctattctaat tttacaaaat 1200

tttgctccca aaacccaagc catttttaag ctcacctgat tatatcctct tggcaaattg 1260

ttccactaca caatttttga aggaggcgtt tggttagtta tcgatcagaa ggtatgtaca 1320

tttaagtgat tatcaggaat tgcggcagtt taatctaccg ggctaaacac atatattttt 1380

gagaattata ttacaattta ctgatatttt caggaagcct aaacccatgt aactaaagca 1440

cagtcggagc cctaatgagc attgcaaaaa tattaattgt gtcaaataga aatgagatct 1500

accctcactt aatcacaatt ttttttaaaa aaagtaatag gaagttcgat ctaatgcatt 1560

tttggaagcc ggttaatgaa gtttgaattt actcaatgtg cttgtaatag aaattggata 1620

tgtcccaatt actgttattt ctcttggtat ttatttttat tcttagataa tcaaaaatat 1680

aaaatttagg cttttattat gttatataat tatgtaacaa tcgtggaatg aaatccaacg 1740

attataaaaa tataagataa aaaattatat tatttttaca atcgttaaat ttttaattta 1800

acgattgtat aattatatat gttacatcgt tatataacat aataatcatc ataaatttaa 1860

tattttttgt gcttttaaaa agttaacagg aagaagattg cagggaattg cattgtcggg 1920

aaaatcattg atgcctttga agacatatac ggtggataga agagagagat ggtaaaagca 1980

ttaagctaat taaatattac cgataaagaa gacacgtggc aacaagagat ggcccgcgaa 2040

ggcaccagag atttcgtcta atagaaagca tccagaatcc tctacataaa tcatattagt 2100

cctatatata ggcctctctt gtctcatcct tctccatctt caaattgatt gatcaaagca 2160

tttccgaagt tgttgagcat ttaattagcg tcccagtttg ccata 2205

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtattgaga gcagttgggg tt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgttggtaag ggcagaggac 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caggtcccca gattagcc 18

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagtccccc gtgttctc 18

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaaaagcagg cttctgtatt gagagcagtt ggggtt 36

<210> 7

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agaaagctgg gtgtatggca aactgggacg ctaat 35

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aaaaagcagg cttccaggtc cccagattag cc 32

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

agaaagctgg gtgagagtcc cccgtgttct c 31

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct 29

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt 29

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ggttctgtca gttccaaacg 20

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gttcgccagt ctttacgg 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ccctaaactt cccaaccc 18