專利名稱：一種提取胡蘿卜花粉小孢子的方法
技術領域：
本發明的目的是提供一種提取胡蘿卜花粉小孢子的方法。
背景技術：
游離小孢子培養技術是一項發展較快的細胞工程技術，在多種作物中得到應用，如小麥、甘藍、大白菜等，該技術能夠利用花粉小孢子的離體培養快速獲得純合二倍體，從而創制出用于培育品種的新種質。胡蘿卜游離小孢子培養技術已有研究(李金榮，歐承剛，莊飛云等.胡蘿卜游離小孢子培養及其發育過程研究，園藝學報，2011，38(8):1539-1546.)，并獲得胚狀體植株，但數量較少，限制了該技術在胡蘿卜生產中的廣泛應用。產生這個問題的一個主要原因是胡蘿卜花器官小，適宜培養時期的花蕾長約1_，花藥直徑小于1mm，采用報道中所述方法很難充分擠壓到花藥并釋放小孢子，因此獲得的游離小孢子數量及誘導產生的胚狀體數量較少，相應的最終獲得的胚狀體植株數也減少；并且在提取過程中，會產生大量體細胞組織雜質，影響最終的提取質量和培養效果。現有胡蘿卜花粉小孢子提取方法存在提取數量少、提取效率低等問題。目前，急需一種能夠快速、高效、高質量分離胡蘿卜花粉小孢子的提取方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種胡蘿卜花粉小孢子的新型提取方法。該方法可以快速、高效分離胡蘿卜花粉小孢子，提高單位操作中花粉小孢子的提取數量，增加培養數量，最終提聞胚狀體植株的獲得量。本發明所提供的提取胡蘿卜小孢子的方法，具體可包括如下步驟:(I)將經過消毒的胡蘿卜花序置于直徑為70 90mm (如90mm)的研缽(如陶瓷研缽)中，加入B5液體培養基，用錘頭直徑為25 30mm (如25mm)的研錘擠壓花蕾釋放小孢子，得到懸浮液；(2)用400目孔徑的濾網過濾步驟(I)所得的懸浮液，收集濾液；(3)對步驟(2)所得的濾液依次按照如下(a) - (c)的步驟進行梯度離心，獲得小孢子:(a) 150 155g (如153g)離心4 6min (如5min),棄上清，收集沉淀；(b)用所述B5液體培養基懸浮步驟(a)所得沉淀，125 130g (如129g)離心4 6min (如5min),棄上清,收集沉淀；(C)用所述B5液體培養基懸浮步驟(b)所得沉淀，105 IlOg (如106g)離心4 6min (如5min),棄上清,收集沉淀。在所述方法的步驟(I)中，所述胡蘿卜花序以小孢子處于單核晚期的胡蘿卜花序為最佳。 在所述方法的步驟(I)中，所述胡蘿卜花序與所述B5液體培養基的配比為15-20個所述胡蘿卜花序:2mL所述B5液體培養基。
在本發明的一個實施例中，步驟(I)中，加入到所述直徑為70 90mm的研缽中的所述胡蘿卜花序具體為15-20個，加入的所述B5液體培養基具體為2mL。在本發明的一個實施例中，所述方法的步驟(2)中，所述400目孔徑的濾網為雙層濾網。在實際操作中，為了減少小孢子的損失，在所述方法中，在步驟(2)所述用400目孔徑的濾網過濾步驟(I)所得的懸浮液之后，還包括如下步驟:用所述B5液體培養基沖洗所述研缽和過濾所述懸浮液后剩余的濾渣，得到沖洗液，并用所述400目孔徑的濾網對所述沖洗液進行過濾，將此處所得濾液與前面過濾所述懸浮液所得的濾液合并。在所述方法中，在步驟(I)所述擠壓花蕾釋放小孢子之后，還包括向所述研缽中加入所述B5液體培養基充分懸浮小孢子的步驟。在本發明的一個實施例中，此處所述B5液體培養基的加入量為5mL。在所述方法中，在步驟(3)之后還包括用NLN液體培養基懸浮步驟3中步驟(C)所得沉淀，調整小孢子密度(如1.5X105f/mL)以備用于培養的步驟。在所述方法中，步驟(I)中，所述胡蘿卜花序具體是按照包括如下步驟的方法進行消毒的:將待消毒的胡蘿卜花序用清水洗凈后，置于體積百分含量為75%的乙醇水溶液中浸泡30±5s (如30s)后,用為體積百分含量為10%的次氯酸鈉水溶液浸泡15±2min (如15min)，再用無菌水浸泡沖洗，得到步驟(I)中所述的經過消毒的胡蘿卜花序。在本發明的一個實施例中，所述提取胡蘿卜小孢子的方法，具體包括如下步驟:(al)將小孢子處于單核晚期的胡蘿卜花序用自來水沖洗后，用體積百分含量為75%的乙醇水溶液浸泡30s,用體積百分含量為10%的次氯酸鈉水溶液浸泡15min,再用無菌水浸泡沖洗4次，每次lmin，得 到消毒后的所述胡蘿卜花序；(a2)取15 20個消 毒后的所述胡蘿卜花序，放入直徑為90mm的陶瓷研缽中，力口2ml的B5液體培養基，用錘頭直徑為2.5cm的研錘擠壓花蕾分離小孢子，再加入5ml的所述B5液體培養基懸浮小孢子，得到懸浮液；(a3)用雙層400目孔徑的濾網過濾所述懸浮液(由于胡蘿卜小孢子直徑15 25 μ m,采用孔徑為38 μ m的400目雙濾網過濾，可以最大程度的阻擋較大組織碎片);用5ml的B5液體培養基沖洗所述研缽和過濾后的濾渣3次，用50ml離心管收集全部濾液。(a4)梯度離心:將所述濾液153g離心5min,棄上清,收集沉淀,用35ml的B5液體培養基重新懸浮沉淀，混勻；129g離心5min，棄上清，收集沉淀，用35ml的B5液體培養基重新懸浮沉淀，混勻；106g離心5min,棄上清，收集沉淀,用NLN液體培養基將沉淀懸浮,調整小孢子密度為1.5 X IO5個/ml個小孢子(通過梯度離心將質量小于小孢子的碎片沖洗掉)。在所述方法中，所述B5液體培養基具體可參照文獻“李俊明編譯.2002.植物組織培養教程.北京:中國農業大學出版社”中所述進行配制。。在所述方法中，所述NLN液體培養基具體可參照文獻“Lichter, R.1982.1nduction of haploid plants from isolated pollen of Brassica napus.Z.PflanzenPhysiol, 105:427-434.” 中所述進行配制。在本發明的一個實施例中，所述胡蘿卜具體為如下胡蘿卜中的任一種:(松滋野生X阿姆斯特丹)-36 (BC2S3)、(松滋野生X阿姆斯特丹)-39 (BC2S3)、7262BXHCMA.C.(F7)、早春紅冠(F1)、時田5寸X7262B (F2)、兩頭齊X早春紅冠(BC1S2)、早春紅冠X兩頭齊(FI)、HnOOl (自交系)、FN2_9 (自交系)、黑田5寸(自交系)和HCM A.C.(自交系)。本發明提供的提取胡蘿卜花粉小孢子的方法可以增加小孢子提取數量，提高培養效率，操作簡便易行，同時還能最大程度的減少組織碎片等雜質對小孢子離體培養的影響。
圖1為為顯微鏡觀察100X視野下花粉小孢子的數量。其中，A為本發明方法提取的小孢子。B為對照方法提取的小孢子。圖2為本發明游離小孢子培養獲得的胚狀體及其再生植株。其中，A為胚狀體；B為再生植株。
具體實施例方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中共涉及11份胡蘿卜供試材料，除Hn001、FN2_9、黑田5寸、HCMA.C.為自交系，早春紅冠為自交的Fl代外，其它的采用人工去雄的方法通過雜交或回交等得到的雜交后代或回交后代，詳見表2。共涉及如下10個胡蘿卜品種:松滋野生、阿姆斯特丹、7262B、HCM A.C.、早春紅冠、時田5寸、兩頭齊、HnOOl、FN2-9和黑田5寸。其中，阿姆斯特丹、HCM A.C.、早春紅冠、時田5寸、兩頭齊和黑田5寸記載在“李金榮，歐承剛，莊飛云，趙志偉，胡鴻，毛笈華.胡蘿卜游離小孢子培養及其發育過程研究.園藝學報,2011,38(8): 1539 - 1546.” 一文中；7262B記載在“莊飛云，裴紅霞，歐承剛，胡鴻，趙志偉，李金榮.胡蘿卜小孢子胚狀體和愈傷組織的誘導.園藝學報，2010,37(10):1613 -1620” 一文中；松滋野生 從國家蔬菜種質資源中期庫獲得、HnOOl從北京華耐農業發展有限公司獲得，FN2-9從美國農業部蔬菜研究中心(VCRU，ARS-USDA)獲得；公眾可從中國農業科學院蔬菜花卉研究所獲得各個材料。B5液體培養基:參照文獻“李俊明編譯.2002.植物組織培養教程.北京:中國農業大學出版社”中所述進行配制。NLN 液體培養基:參照文獻“Lichter, R.1982.1nduction of haploid plantsfrom isolated pollen of Brassica napus.Z.Pflanzen Physiol, 105:427-434.，，中所述進行配制。。實施例1、提取胡蘿卜花粉小孢子的方法本實施中共涉及11份胡蘿卜供試材料，除HnOOl、FN2-9、黑田5寸和HCM A.C.為自交系外，早春紅冠為Fl代，其它的采用人工去雄的方法通過雜交或回交等得到的雜交后代或回交后代，詳見表2。本發明提取胡蘿卜花粉小孢子的方法(實驗組)以李金榮等在“李金榮，歐承剛，莊飛云等.胡蘿卜游離小孢子培養及其發育過程研究，園藝學報，2011，38(8):1539-1546.”一文中公開的胡蘿卜花粉小孢子的提取方法作為對照(對照組)。本發明提取胡蘿卜花粉小孢子的方法(實驗組)，具體如下:一、胡蘿卜花序的消毒在胡蘿卜花序展開時，取小孢子處于單核晚期的胡蘿卜花序，用清水洗凈。在超凈工作臺上用75% (體積分數)酒精水溶液浸泡30s后，用10% (體積百分含量)次氯酸鈉水溶液浸泡15min，再用無菌水浸泡沖洗4次，每次lmin，得到消毒后的花序，待用。二、胡蘿卜小孢子的游離取15 20個步驟一得到的消毒后的胡蘿卜花序放入直徑為90mm的陶瓷研缽中，加2ml B5液體培養基，用錘頭直徑2.5cm的研錘充分擠壓花蕾，釋放小孢子。三、胡蘿卜小孢子的收集向研缽中加入5ml B5液體培養基將小孢子懸浮，用雙層400目孔徑濾網靜置過濾，再用5ml B5液體培養基沖洗研缽和上述過濾后的濾渣3次，過濾，用50ml離心管收集全部濾液。1200rpm (相當于153g)轉速離心5min,棄上清；加30ml B5液體培養基沖洗沉淀，混勻，IlOOrpm (相當于129g)轉速離心5min,棄上清；加30ml B5液體培養基沖洗沉淀，混勻，IOOOrpm (相當于106g)轉速離心5min，棄上清；加NLN液體培養基，調整小孢子密度
1.5 X IO5個/ml用于培養。圖1為本發明提取方法和對照方法，在上述離心后加入相等的少量NLN液體培養基后小孢子懸浮液的100倍下的顯微鏡圖。從圖中可以看出，本發明提取方法所提取的小孢子數量多于對照方法，且雜質少，凈度較高。另外，當用NLN液體培養基將兩方法提取的小孢子同調整為1.5X IO5個/ml的培養密度下，本發明方法(實驗組)獲得懸浮液的平均體積顯著高于對照方法(表I)。以上結果表明，本發明所提供的方法與對照方法相比，胡蘿卜花粉小孢子的提取效率大大提高了。表I不同基因型胡蘿卜獲得相同密度小孢子懸浮液的體積(單位:ml)
權利要求
1.一種提取胡蘿卜花粉小孢子的方法，包括如下步驟: (1)將經過消毒的胡蘿卜花序置于直徑為70 90mm的研缽中，加入B5液體培養基，用錘頭直徑為25 30mm的研錘擠壓花蕾釋放小孢子，得到懸浮液； (2)用400目孔徑的濾網過濾步驟(I)所得的懸浮液，收集濾液； (3)對步驟(2)所得的濾液依次按照如下(a)-(c)的步驟進行梯度離心，獲得小孢子: (a)150 155g離心4 6min,棄上清,收集沉淀； (b)用所述B5液體培養基懸浮步驟(a)所得沉淀，125 130g離心4 6min,棄上清，收集沉淀； (c)用所述B5液體培養基懸浮步驟(b)所得沉淀，105 IlOg離心4 6min,棄上清，收集沉淀。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述胡蘿卜花序為小孢子處于單核晚期的胡蘿卜花序。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述胡蘿卜花序與所述B5液體培養基的配比為15-20個所述胡蘿卜花序:2mL所述B5液體培養基。
4.根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步驟(2)中，所述400目孔徑的濾網為雙層濾網。
5.根據權利要求1-4 中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，在步驟(2)所述用400目孔徑的濾網過濾步驟(I)所得的懸浮液之后，還包括如下步驟:用所述B5液體培養基沖洗所述研缽以及過濾所述懸浮液后剩余濾渣，得到沖洗液，并用所述400目孔徑的濾網對所述沖洗液進行過濾。
6.根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，在步驟(I)所述擠壓花蕾釋放小孢子之后，還包括向所述研缽中加入所述B5液體培養基的步驟。
7.根據權利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于:所述方法中，步驟(3)之后還包括用NLN液體培養基懸浮步驟(c)所得沉淀，調整小孢子密度的步驟。
8.根據權利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于:步驟(I)中，所述胡蘿卜花序是按照包括如下步驟的方法進行消毒的:將待消毒的胡蘿卜花序置于體積百分含量為75%的乙醇水溶液中浸泡30±5s后,用體積百分含量為10%的次氯酸鈉水溶液浸泡15±2min,再用無菌水浸泡沖洗，得到權利要求1步驟(I)中所述的經過消毒的胡蘿卜花序。
全文摘要
本發明公開了一種提取胡蘿卜花粉小孢子的方法。該方法包括如下步驟1)將經過消毒的胡蘿卜花序置于直徑為70～90mm的研缽中，加入B5液體培養基，用錘頭直徑為25～30mm的研錘擠壓花蕾釋放小孢子，得到懸浮液；2)用400目孔徑的濾網過濾步驟1)所得懸浮液，收集濾液；3)對步驟2)所得濾液依次按照如下a)-c)的步驟進行梯度離心，獲得小孢子a)150～155g離心4～6min，棄上清，收集沉淀；b)用所述B5液體培養基懸浮步驟a)所得沉淀，125～130g離心4～6min，棄上清，收集沉淀；c)用所述B5液體培養基懸浮步驟b)所得沉淀，105～110g離心4～6min，棄上清，收集沉淀。本發明方法可增加小孢子提取數量，提高培養效率，操作簡便，同時還能最大程度減少組織碎片等雜質對小孢子離體培養的影響。
文檔編號C12N5/04GK103194422SQ201310133308
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者歐承剛, 莊飛云 申請人:中國農業科學院蔬菜花卉研究所