專利名稱：一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌及其構建方法
技術領域：
本發明涉及一種染色體重組增效蛋白基因(Enhancin)蘇云金桿菌工程菌的構建方法，尤其是一種以轉屬主粘蟲顆粒體病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因為目的基因、蘇云金桿菌(Bt)為受體菌，通過含轉座子的衍生載體pLTV-Ι將PuGV-Ps增效蛋白基因整合到蘇云金桿菌染色體上，并經過高溫轉接消除轉座單元外的抗性標記基因，從而構建穩定表達增效蛋白基因、無抗性標記基因的增效Bt工程菌的方法。
背景技術：
長期以來，農業病蟲害的危害主要依賴化學農藥防治。我國農田化學農藥有效含量年用量超過250000噸，致使農產品農藥殘留增加、害蟲危害加重、生態環境破壞。推廣應用生物農藥，不僅可以降低農藥殘留、提高農產品品質，而且更是保護環境、促進農業可持續發展的有效途徑。蘇云金桿菌(feci77w5.Bt)是研究、應用范圍最廣的生物殺蟲劑，其主要作用成分為具體代謝產生的殺蟲晶體蛋白(Insecticidal CrystalProteins, ICPs)或δ -內毒素(delta-endotoxin)。ICPs對多種重要的農林業害蟲具毒殺作用，Bt已作為有效的微生物農藥廣泛應用于害蟲的生物防治。然而受本身生物學特性的限制，在實際使用中存在毒力不強、殺蟲譜窄、殺蟲速度慢等影響大面積推廣應用的問題，同時害蟲對蘇云金桿菌抗藥性的產生和發展也越來越受到人們的關注，因此構建廣譜、高效Bt殺蟲工程菌成為蘇云金桿菌殺蟲劑研究與開發的新方向。增效蛋白(Enhancin)最早是在粘蟲顆粒體病^iPseudaletiaunip皿ctagranulovirus, PuGV)包涵體中發現的能提高核型多角體病毒侵染能力的生物增效因子，目前已在PuGV、粉紋夜蛾顆粒體病毒(rricAoWttsia ni GV，TnGV)、棉鈴蟲顆粒體病毒{Helicoverpa armigera, HaGV)等8種顆粒體病毒、4種痘病毒、2種多角體病毒中發現這類增效作用的蛋白存在 。增效蛋白對Bt毒力同樣具有顯著增強作用。將TnGV包涵體中純化的增效蛋白加入Bt后飼喂試蟲，測試的6種不同鱗翅目幼蟲的死亡率提高了 2-10倍；4種不同的Bt商品制劑中加入TnGV增效蛋白對粉紋夜蛾的防效提高了 3-6倍。江蘇里下河地區農科所自2000年開展轉屬主顆粒體病毒PuGV-Ps對Bt增強作用研究，證明PuGV-Ps中含有提高Bt毒力的增效蛋白，微量PuGV-Ps對Bt增效作用顯著，同時可提高Bt對害蟲的作用速度。顆粒體病毒增效蛋白的殺蟲增效活性，在桿狀病毒、蘇云金桿菌等微生物農藥的研究應用上具有廣闊的前景。目前構建Bt工程菌的主要途徑是通過增加ICPs基因拷貝數、消除冗余質粒、輔助蛋白利用等手段提高ICPs基因的表達量。這種改造雖提高了 Bt工程菌的殺蟲活性，但某種意義上講是通過提高ICPs使用濃度而提高防效，同樣也存在由于增加ICPs選擇壓力帶來的害蟲抗藥性風險
發明內容
本發明的目的是提供一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌及其構建方法，本發明利用增效蛋白基因構建增效基因，在ICPs正常使用濃度下，通過增效蛋白的協同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，從而增強防效，產品毒力強、殺蟲譜寬、殺蟲速度快，不僅可以降低農藥殘留、提高農產品品質，而且更是保護環境、促進農業可持續發展的有效途徑。本發明的目的是通過以下技術方案實現的，一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌，所述工程菌是以轉屬主粘蟲顆粒體病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因為目的基因、蘇云金桿菌(Bt)為受體菌，通過含轉座子的衍生載體pLTV-Ι將PuGV-Ps增效蛋白基因整合到蘇云金桿菌染色體上，并經過高溫轉接消除轉座單元外的抗性標記基因獲得。上述染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法:
(1)PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆:室內人工飼養東方粘蟲，以PuGV感染寄主，分離純化獲得PuGV-Ps，提取顆粒體病毒DNA，PCR擴增增強蛋白全長基因En ;擴增基因En與克隆載體pET-15b經酶切連接并轉化大腸桿菌DH5 α，氨芐青霉素LB平板篩選克隆子，酶切鑒定重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En ；
(2)增效蛋白整合載體的構建:以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，擴增增效蛋白基因；以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體，Saml酶切線性化連接擴增的增效蛋白基因后轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子ToplO-3, Xhol和Nhel雙酶切鑒定增效蛋白基因的插入位點和方向，獲得增效蛋白基因整合載體pLTVl-En ；
(3)蘇云金桿菌感受態細胞的制備及整合載體的轉化:LB液體培養基接種蘇云金桿菌活化，以LB+0.5M山梨醇為培養基轉接培養制備蘇云金桿菌感受態細胞；ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合載體pL TVl-En，電擊法將整合載體pLTVl-En轉化至蘇云金桿菌感受態細胞，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子，獲得轉化子Bt-En-1 ；
(4)轉化子的高溫轉接和篩選:將轉化子Bt-En-1接種于LB培養液中，40_50°C培養并轉接5-7次后涂氨芐青霉素LB平板產生單菌落，分別點種在氨芐青霉素單抗平板和無抗平板的對應位置，置28-30°C培養48h后，挑選無抗培養基中失去抗性的單菌落，顯微鏡鏡檢是否產生伴胞晶體蛋白，再通過提取質粒和PCR擴增，最后得到染色體重組增效蛋白蘇云金桿菌工程菌Bt-En。步驟(I)中所述提取顆粒體病毒DNA，PCR擴增增強蛋白全長基因En的方法為:堿裂解酚抽提法提取PuGV-Ps DNA用作模板，設計上游引物:5’_ GC CAT ATG TCG TAC AAAGTG ATT GTA CCC GC T-3，，下游引物:5’ - GC CTC GAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TATCAT T -3’，引入!,Xho I兩個酶切位點，PCR擴增PuGV-Ps增效蛋白基因；PCR擴增的反應條件:先94°C預變性4min，然后依次94°C變性30sec、56°C復性30sec、72°C延伸3min，30個循環；最后72°C延伸IOmin ;瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。步驟(2)中所述以重組增效蛋白基因質粒pET-15b_En為模板，擴增增效蛋白基因為:以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，設計上游引物:5’_AG AAT TCG AGC TCGGTA CCC GGG ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GCT-3，；下游引物:GT CGA CTC TAG AGGATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入酶切位點，PCR 擴增增效蛋白基因，PCR擴增反應條件:先95°C預變性5 min，然后依次97°C變性30sec、55°C復性30sec、72°C延伸3min，35個循環；最后72°C延伸10 min ;瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。步驟(2)中所述以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體，Saml酶切線性化連接增效蛋白基因后轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO的方法為:以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體，5.湖 7酶切線性化后與所述擴增增效蛋白基因、In-Fusion HD酶混合，50°C反應15min，將增效蛋白基因連接到整合載體pLTVl Saml酶切位點上，CaCl2法到轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO。步驟(3)中所述ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合載體pLTVl-En的方法為:ToplO-3菌株氨芐青霉素LB培養液培養，小量質粒提取法提取增效蛋白基因整合載體PLTVl-En0步驟(3)中所述電擊法采用BIO-RAD電擊儀電擊轉化，電擊條件為20KV/cm。步驟(4)中所述轉接參數為:1次/12 h，100-120代。步驟(4)中所述PCR擴增反應條件為:先94 °C預變性4 min，然后依次94 °C變性30 sec,56 °C復性30 sec,72 °C延伸3 min，30個循環；最后72 °C延伸10 min ;瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
第一，增效蛋白是昆蟲病毒基因編碼的一類具有增效作用的新蛋白，對蘇云金桿菌、核型多角體病毒等昆蟲病原微生物的殺蟲效率具有增強作用，利用增效蛋白基因構建增效基因，在ICPs正常使用濃度下，通過增效蛋白的協同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，從而增強防效。第二，增效蛋白對Bt毒力具有顯著增強作用，增強Bt的毒性，殺蟲譜范圍擴大；PuGV-Ps中含有提高Bt毒力的增效蛋白，可提高Bt對害蟲的作用速度。第二，本法明不僅可以降低農藥殘留、減少農廣品農藥殘留、提聞農廣品品質、減輕害蟲危害，而且生態環保、保護環境、促進農業可持續發展的有效途徑。
圖1是PCR擴增的2.7kb PuGV-Ps增效蛋白基因；
圖2是克隆載體pET-15b圖譜；
圖3是質粒pET-15b-En的酶切鑒定；
圖4是含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl圖譜；
圖5是增效蛋白基因整合載體pLTVl-En的酶切鑒定。
具體實施例方式一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌，所述工程菌是以轉屬主粘蟲顆粒體病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因為目的基因、蘇云金桿菌(Bt)為受體菌，通過含轉座子的衍生載體pLTV-Ι將PuGV-Ps增效蛋白基因整合到蘇云金桿菌染色體上，并經過高溫轉接消除轉座單元外的抗性標記基因獲得。
上述染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法:
(I)PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆:室內人工飼養東方粘蟲，以PuGV感染寄主，分離純化獲得PuGV-Ps，提取顆粒體病毒DNA，PCR擴增增強蛋白全長基因En ;擴增基因En與克隆載體pET-15b經酶切連接并轉化大腸桿菌DH5 α，氨芐青霉素LB平板篩選克隆子，酶切鑒定重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En ；
(2)增效蛋白整合載體的構建:以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，擴增增效蛋白基因；以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體，Saml酶切線性化連接擴增的增效蛋白基因后轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子ToplO-3, Xhol和Nhel雙酶切鑒定增效蛋白基因的插入位點和方向，獲得增效蛋白基因整合載體pLTVl-En ；
(3)蘇云金桿菌感受態細胞的制備及整合載體的轉化:LB液體培養基接種蘇云金桿菌活化，以LB+0.5M山梨醇為培養基轉接培養制備蘇云金桿菌感受態細胞；ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合載體pLTVl-En，電擊法將整合載體pLTVl-En轉化至蘇云金桿菌感受態細胞，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子，獲得轉化子Bt-En-1 ；
(4)轉化子的高溫轉接和篩選:將轉化子Bt-En-1接種于LB培養液中，40_50°C培養并轉接5-7次后涂氨芐青霉素 LB平板產生單菌落，分別點種在氨芐青霉素單抗平板和無抗平板的對應位置，置28-30°C培養48h后，挑選無抗培養基中失去抗性的單菌落，顯微鏡鏡檢是否產生伴胞晶體蛋白，再通過提取質粒和PCR擴增，最后得到染色體重組增效蛋白蘇云金桿菌工程菌Bt-En。步驟(I)中所述提取顆粒體病毒DNA為:堿裂解酚抽提法提取PuGV-Ps DNA用作模板，設計上游引物:5’_ GC CAT ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GC T-3’，下游引物:5’ - GC CTC GAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CAT T -3’，引入I,IAo I 兩個酶切位點，PCR擴增PuGV-Ps增效蛋白基因；PCR擴增的反應條件:先94 °C預變性4 min,然后依次94 °C變性30 sec,56 °C復性30 sec,72 °C延伸3 min，30個循環；最后72 °〇延伸10 min。瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。步驟(2)中所述以重組增效蛋白基因質粒pET-15b_En為模板，擴增增效蛋白基因為:以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，設計上游引物:5’_AG AAT TCG AGC TCGGTA CCC GGG ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GCT-3，；下游引物:GT CGA CTC TAG AGGATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入酶切位點，PCR 擴增增效蛋白基因，PCR擴增反應條件:先95 °C預變性5 min，然后依次97 °C變性30 sec,55°C復性30 sec,72 °C延伸3 min，35個循環；最后72 °C延伸10 min，瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。步驟(2)中所述以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體，Saml酶切線性化連接增效蛋白基因后轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO的方法為:以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體，5.湖 7酶切線性化后與所述擴增增效蛋白基因、In-Fusion HD酶混合，50°C反應15min，將增效蛋白基因連接到整合載體pLTVl Saml酶切位點上，CaCl2法到轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO。步驟(3)中所述ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合載體pLTVl_En的方法為:ToplO-3菌株氨芐青霉素LB培養液培養，小量質粒提取法提取增效蛋白基因整合載體PLTVl-En0步驟(3)中所述電擊法采用BIO-RAD電擊儀電擊轉化，電擊條件為20KV/cm。
步驟(4)中所述轉接參數為:1次/12 h，100-120代。步驟(4)中所述PCR擴增反應條件為:先94 °C預變性4 min，然后依次94 °C變性30 sec,56 °C復性30 sec,72 °C延伸3 min，30個循環；最后72 °C延伸10 min ;瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。實施例1
粘蟲顆粒體病毒增效蛋白基因的克隆:以PuGV為原始病毒，感染2齡人工飼養的東方粘蟲幼蟲,收集感病的蟲尸研磨勻漿,3層紗布過濾，濾液經差速離心(5000 r.HiirT1 10min, 15000 r.mirT1 40 min),棄去組織殘洛,用無菌的生理鹽水多次洗漆沉淀,再反復差速離心，制得純化的PuGV-Ps。堿裂解酚抽提法提取PuGV-Ps DNA用作模板，設計上游引物:5’ - GC CAT ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GC T-3’，下游引物:5’ - GC CTCGAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CAT T -3’，引入MZe I,IAo I 兩個酶切位點，PCR 擴增PuGV-Ps增效蛋白基因。反應條件:先94 °C預變性4 min，然后依次94 °C變性30 sec、56 °C復性30 sec,72 °C延伸3 min，30個循環；最后72 °C延伸10 min。瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段，獲得2.7kb的增效蛋白基因，見圖1。圖1中I為2.7 kb增效蛋白基因，M為DNA Marker。PCR產物與克隆載體pET_15b (圖2)經Λ汝1、沿ο I雙酶酶切后分別回收，連接轉化DH5 α，氨芐青霉素的LB平板篩選。Xho I單酶切及!,Xho I雙酶酶切鑒定重組質粒。質粒DNA雙酶切片段與預期大小(2.7 kb)相符的質粒是重組正確的質粒，命名為質粒pET-15b-En，見圖3。圖3是質粒pET-15b_En的酶切鑒定，其中1、2、3、4為!,Xho I雙酶切片段，5、6、7、8為沿ο I單酶切片段，M為DNA Marker。實施例2
增效蛋白基因整合載體的構建 :以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，設計上游引物:5，-AG MT TCG AGC TCG GTA CCC GGG ATG TCG TAC MA GTG ATT GTA CCC GCT-3，；下游引物:GT CGA CTC TAG AGG ATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入5)^7酶切位點，PCR擴增增效蛋白基因。反應條件:先95 °C預變性5 min，然后依次97 °C變性30 sec,55 °C復性30 sec,72 °C延伸3 min，35個循環；最后72 °C延伸10min。瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體(圖Ol酶切線性化后與上述擴增純化的增效蛋白基因、In-Fusion HD酶混合，50°C反應15min，將增效蛋白基因連接到整合載體pLTVl Saml酶切位點上，CaCl2法到轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子ToplO-3，Xhol和Nhel雙酶切鑒定增效蛋白基因的插入位點和方向，獲得增效蛋白基因整合載體pLTVl-En，見圖5。圖5是增效蛋白基因整合載體pLTVl-En的酶切鑒定，其中M為DNA Marker，I為2.7 kb增效蛋白基因；2 為 pLTVl/small 酶切；3 為 pLTVl-En/small 酶切；4 為 pLTVl/Xhol、BamHl 雙酶切。實施例3
整合載體的轉化及工程菌的篩選:ToplO-3菌株氨芐青霉素LB培養液培養，小量質粒提取法提取增效蛋白基因整合載體pLTVl-En。蘇云金桿菌(Bt)接種LB培養液過夜搖菌活化，LB+0.5M山梨醇為培養基轉接培養至OD6tltl ^ 0.3 0.5時，以電擊緩沖液(10%甘油、0.5M山梨醇、0.5M甘露醇)漂洗四次后分裝400 μ 離心管中，加入提取的整合載體pLTV_En，BIO-RAD電擊儀電擊轉化，電擊條件:20KV/cm。電擊后恢復培養4h，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子，獲得轉化子Bt-En-1。將轉化子Bt-En-1接種于20 ml LB培養液中，42 °C下培養并轉接6次(I次/12 h，約120代)，最后取2 5μ1菌液涂布于LB平板，待其上長出單菌落后，再挑出1000個菌落對點于含氨芐青霉素和不含氨芐青霉素的LB平板上，置28-30°C培養48h后，挑選丟失氨芐青霉素抗性的菌落鏡檢觀察伴胞晶體蛋白。轉接LB培養液培養，提取質粒并按實施案例I法PCR擴增增效蛋白基因，獲得染色體重組增效蛋白蘇云金桿菌工程菌Bt-En 。
權利要求
1.一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌，其特征是，所述工程菌是以轉屬主粘蟲顆粒體病毒PuGV-Ps增效蛋白基因為目的基因、蘇云金桿菌Bt為受體菌，通過含轉座子的衍生載體PLTVl將PuGV-Ps增效蛋白基因整合到蘇云金桿菌染色體上，并經過高溫轉接消除轉座單元外的抗性標記基因獲得。
2.權利要求1所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是: (1)PuGV-Ps增效蛋白基因的克隆:室內人工飼養東方粘蟲，以PuGV感染寄主，分離純化獲得PuGV-Ps，提取顆粒體病毒DNA，PCR擴增增強蛋白全長基因En ;擴增基因En與克隆載體pET-15b經酶切連接并轉化大腸桿菌DH5 α，氨芐青霉素LB平板篩選克隆子，酶切鑒定重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En ； (2)增效蛋白整合載體的構建:以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，擴增增效蛋白基因；以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體，Saml酶切線性化連接擴增的增效蛋白基因后轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子ToplO-3, Xhol和Nhel雙酶切鑒定增效蛋白基因的插入位點和方向，獲得增效蛋白基因整合載體pLTVl-En ； (3)蘇云金桿菌感受態細胞的制備及整合載體的轉化:LB液體培養基接種蘇云金桿菌活化，以LB+0.5M山梨醇為培養基轉接培養制備蘇云金桿菌感受態細胞；ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合載體pLTVl-En，電擊法將整合載體pLTVl-En轉化至蘇云金桿菌感受態細胞，氨芐青霉素LB平板篩選陽性克隆子，獲得轉化子Bt-En-1 ； (4)轉化子的高溫轉接和篩選:將轉化子Bt-En-1接種于LB培養液中，40_50°C培養并轉接5-7次后涂氨芐青霉素LB平板產生單菌落，分別點種在氨芐青霉素單抗平板和無抗平板的對應位置，置28-30°C培養48h后，挑選無抗培養基中失去抗性的單菌落，顯微鏡鏡檢是否產生伴胞晶體蛋白， 再通過提取質粒和PCR擴增，最后得到染色體重組增效蛋白蘇云金桿菌工程菌Bt-En。
3.根據權利要求2所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是，步驟(I)中所述提取顆粒體病毒DNA，PCR擴增增強蛋白全長基因En的方法為:堿裂解酚抽提法提取PuGV-Ps DNA用作模板，設計上游引物:5’_ GC CAT ATG TCG TAC AAAGTG ATT GTA CCC GC T-3，，下游引物:5’ - GC CTC GAG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TATCAT T -3’，引入!,Xho I兩個酶切位點，PCR擴增PuGV-Ps增效蛋白基因；PCR擴增的反應條件:先94 °C預變性4 min，然后依次94 °C變性30 sec,56 °C復性30 sec,72 °〇延伸3 min, 30個循環；最后72 °C延伸10 min ;瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。
4.根據權利要求2所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是，步驟(2)中所述以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，擴增增效蛋白基因為:以重組增效蛋白基因質粒pET-15b-En為模板，設計上游引物:5’_AG AAT TCG AGC TCGGTA CCC GGG ATG TCG TAC AAA GTG ATT GTA CCC GCT-3，；下游引物:GT CGA CTC TAG AGGATC CCC GGG TGA ACG TTA TTA GAA CGC TAT CATT，上下游引入酶切位點，PCR 擴增增效蛋白基因，PCR擴增反應條件:先95 °C預變性5 min，然后依次97 °C變性30 sec,55°C復性30 sec,72 °C延伸3 min，35個循環；最后72 °C延伸10 min ;瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。
5.根據權利要求2所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是，步驟(2)中所述以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體，酶切線性化連接增效蛋白基因后轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO的方法為:以含有轉座子Tn917的衍生質粒pLTVl為載體，Saml酶切線性化后與所述擴增增效蛋白基因、In-Fusion HD酶混合，50°C反應15min，將增效蛋白基因連接到整合載體pLTVl Saml酶切位點上，CaCl2法到轉化大腸桿菌感受態細胞ToplO。
6.根據權利要求2所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是，步驟(3)中所述ToplO-3菌中提取增效蛋白基因整合載體pLTVl-En的方法為:ToplO-3菌株氨芐青霉素LB培養液培養，小量質粒提取法提取增效蛋白基因整合載體PLTVl-En0
7.根據權利要求2所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是，步驟(3)中所述電擊法采用BIO-RAD電擊儀電擊轉化，電擊條件為20KV/cm。
8.根據權利要求2所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是，步驟(4)中所述轉接參數為:1次/12 h，100-120代。
9.根據權利要求2所述的染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌的構建方法，其特征是，步驟(4)中所述PCR擴增反應條件為:先94 °C預變性4 min，然后依次94 °C變性30 sec,56 °C復性30 sec,72 °C延伸3 min，30個循環；最后72 °C延伸10 min ;瓊脂糖電泳檢測擴增增效蛋白基因片段。
全文摘要
本發明公開了一種染色體重組增效蛋白基因蘇云金桿菌工程菌及其構建方法以轉屬主粘蟲顆粒體病毒(PuGV-Ps)增效蛋白基因為目的基因、蘇云金桿菌(Bt)為受體菌，通過含轉座子的衍生載體pLTV-1將PuGV-Ps增效蛋白基因整合到蘇云金桿菌染色體上，并經過高溫轉接消除轉座單元外的抗性標記基因，從而構建穩定表達增效蛋白基因、無抗性標記基因的增效Bt工程菌。本發明利用增效蛋白基因構建增效基因，在Bt毒蛋白(ICPs)正常使用濃度下，通過增效蛋白的協同增效作用提高Bt毒蛋白的活性，從而增強防效，產品毒力強、殺蟲譜寬、殺蟲速度快，不僅可以降低農藥殘留、提高農產品品質，而且更是保護環境、促進農業可持續發展的有效途徑。
文檔編號C12N15/63GK103205392SQ20131013298
公開日2013年7月17日 申請日期2013年4月17日 優先權日2013年4月17日
發明者徐健, 韓光杰, 趙松, 劉琴, 李傳明, 馬談斌 申請人:江蘇里下河地區農業科學研究所