新型微rna篩選方法、驗證系統及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了新型微RNA篩選方法、驗證系統及其應用。本發明的篩選驗證系統可簡單快速經濟地檢測hetRNA的表達。本發明為天然hetRNA的篩選驗證提供了一個方便可行的路徑和方法，為將來大規模的發現驗證hetRNA提供了強大的技術支撐。本發明還提供了新的構建用于RNA篩選數據庫的方法。
【專利說明】新型微RNA篩選方法、驗證系統及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，特別涉及一種新型微RNA(hetRNA)篩選系統的構建方 法及其應用。
【背景技術】
[0002] 最近的研究表明，真核基因組90%以上的序列都會被轉錄，產生大量的非編 碼 RNA(ncRNAs) 【Costa FF.,Bioessays2010;32(7):599-608;Carninci P，Yasuda J，Hayashizaki Υ·，Curr Opin Cell Biol2008;20(3):274-280】，包括長的非編碼 RNA(lncRNAs)和小的非編碼（sRNAs〈200nt)。sRNAs幾乎能直接或間接影響細胞的每一個 生物學活動【Czech B, Hannon GJ·，Nat Rev Genet 2010;12(1):19-31】。自從 1993 年發 現microRNAs ( -種sRNA)以來，解析小RNA組學（sRNAome)已經成了很多實驗室的目標 【Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V·，Celll993;75(5):843-854】。這導致多種功能性的內源 微RNA(〈30nt)的發現【Choudhuri S.，JBiochem Mol Toxicol2010;24(3) :195-216. ;Taft RJ, Pang KC, Mercer TR, Dinger M, Mattick JS. , J Pathol 2009;220 (2):126-139. ；Li Z,Kim Sff, Lin Y et al. ,J Virol2009;83(24):12751-12758. ；Taft RJ, Simons C, Nahkuri S et al.，Nat Struct Mol Biol;17(8):1030-1034】。但是，這些微 RNA-般是連續地存在 于對應的基因組上。
[0003] 最近發展起來的深度測序技術（deep sequencing)特別適合于發現微RNA 【Hafner M，Landgraf P, Ludwig J et al·，Methods 2008;44(1):3_12】。深度測序技術 可以產生千萬乃至上億的微RNA數據，這使得人們能夠比先前更為詳盡地解析微RNA組 學，特別是它能夠發現那些先前克隆和標準的方法無法實現的新的尤其是低豐度的微RNA 【Nagalakshmi U，Waern K，Snyder M·， Curr Protoc Mol Biol2010;Chapter4:Unit4 11 11-13. ;van der Brug M，Nalls MA，Cookson MR·, Brain Res2010;1338:146_154·】。但 是，隨之而來的挑戰是如何確定這百萬級以上的小核苷酸序列在基因組上的定位。事實 上，對一般的測序平臺來說，的確有明顯比例的數據是不能在基因組中找到定位的【Blow N.，Nature2009 ;458(7235):239-242.】。有趣的是，最近，人們在高通量測序數據中發 現一種不連續的小于200nt的小RNA，這種小RNA在基因組上被一個內含子所隔開【Na ture2009;457(7232):1028-1032. ；Mercer TR, Dinger ME, Bracken CP et al., Genome Res;20(12):1639-1650. ；Valen E, Preker P, Andersen PR et al., Nat Struct Mol Biol; 18 (9) : 1075-1082.】。但是，有沒有小于30nt的不連續的微RNA還有待進一步探究。 畢竟小于200nt還是很大的分子，也容易與基因組匹配，但小于30nt的分子就很困難了。
[0004] 綜上所述，本領域對于微RNA的認識還非常有限，迫切需要開發新的鑒別新型微 RNA的方法。此外，還需要開發簡單方便快速的技術來進行驗證，以便篩選和鑒別新型的微 RNA。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的就是提供一種鑒別新型微RNA或其前體的方法。
[0006] 本發明的第一方面，提供了一種構建用于hetRNA篩選的數據庫的方法，所述方法 包括：
[0007] (a)提供一微小RNA深度測序數據庫（或稱為微RNA垃圾數據庫，或0級RNA篩選 庫），
[0008] 其中所述微小RNA測序數據庫中的各RNA序列記為RNAjO,其中RNAjO表示序號為 j0的RNA序列，j0為1-nO的正整數，n0為所述微小數據庫中的RNA序列總數，并且RNAjO 是未能與基因組序列匹配的微小RNA，并且所述微小RNA測序數據庫不包括已驗證或證實 的hetRNA和已知小RNA的RNA序列；
[0009] (b)將所述微小RNA測序數據庫中的各RNA序列RNAjO,與標準RNA (reference RNA或RefSeq RNA)數據庫進行比對，從而在所述標準RNA數據庫中排除與各RNA序列 RNAjO不匹配的標準RNA序列，并選取標準RNA數據庫中與RNAjO匹配的標準RNA，并將對應 于該匹配的標準RNA的截短序列組成一級RNA篩選庫（匹配的RNAjO被稱為起始微RNA)， 其中，所述標準RNA的截短序列的結構如式I所示：
[0010] X-SEQfflAJ0-Y (I)
[0011] 式中，
[0012] SEQmj(l為相匹配的RNAjO的核苷酸序列；
[0013] X為所述標準RNA中位于所述RNAjO直接上游（immediately upstream)的長度為 50-100bp的核苷酸序列；
[0014] Y為所述標準RNA中位于所述RNAjO直接下游（immediately downstream)的長度 為50-100bp的核苷酸序列；
[0015] 為連接X和SEQmj(l以及連接SEQmj(l和Y的鍵（化學鍵）；
[0016] 其中所述一級RNA篩選庫所含有的各標準RNA的截短序列記為RNAj 1，其中，RNAj 1 表示序號為jl的標準RNA的截短序列，其中jl為1-nl的正整數，nl為一級RNA篩選庫中 的RNA序列總數；
[0017] (C)將所述一級篩選庫中的RNAjl，與基因組序列數據庫進行比對，從而排除不含 有內含子的RNA序列，并且選取內含子要位于成熟微RNA序列（即起始微RNA)之中的RNA 序列，組成二級RNA篩選庫，
[0018] 其中所述二級RNA篩選庫所含有的各RNA記為RNAj2,其中，RNAj2表示序號為j2 的RNA序列，其中j2為1-η2的正整數，n2為二級RNA篩選庫中的RNA序列總數；
[0019] (d)將所述二級篩選庫中的RNAj2序列進行二級結構分析，進行二級結構預測，排 除無法形成莖環結構的RNA序列，并將所述二級篩選庫中可形成莖環結構的RNA序列組成 三級RNA篩選庫，即用于hetRNA篩選的數據庫，
[0020] 其中，所述三級RNA篩選庫所含有的各RNA記為RNAj3, RNAj3表示序號為j3的 RNA序列，其中j3為1-η3的正整數，n3為三級RNA篩選庫中的RNA序列總數。
[0021] 在另一優選例中，所述的表示連接式I中各序列的腱，更佳地，為化學鍵。
[0022] 在另一優選例中，所述的微小RNA深度測序數據庫、標準RNA數據庫、和基因組序 列數據庫是來自同一物種的。
[0023] 在另一優選例中，所述的物種包括（但并不限于）：哺乳動物、鳥類、爬行動物、昆 蟲。
[0024] 較佳地，所述的哺乳動物包括人、嚙齒動物、靈長目、牛、羊、豬、狗、貓。
[0025] 更佳地，所述的哺乳動物包括小鼠、大鼠、人。
[0026] 在另一優選例中，所述的標準RNA數據庫是國際通用公用數據庫NCBI (National Center for Biotechnology Information)網站的標準 RNA 數據庫。
[0027] 在另一優選例中，在步驟（c)中，基因組序列是NCBI網站的基因組序列。
[0028] 在另一優選例中，在步驟（d)中，二級結構預測是用公用網站the mFold Server 進行。
[0029] 在另一優選例中，所述的三級RNA篩選庫也稱為包含內含子剪接位點的hetRNA前 體庫。
[0030] 在另一優選例中，所述的微小RNA測序數據庫中的RNA序列長度為18_30nt。
[0031] 在另一優選例中，在步驟（d)中還包括：將所述微小RNA測序數據庫中對應于 RNAjO的各RNA序列組成相應的成熟hetRNA庫。
[0032] 本發明第二方面，提供了一種鑒定由包含內含子的hetRNA前體產生的成熟 hetRNA的方法，包括步驟：
[0033] (a)提供一微小RNA深度測序數據庫（或稱為微RNA垃圾數據庫，或0級RNA篩選 庫），
[0034] 其中所述微小RNA測序數據庫中的各RNA序列記為RNAjO,其中RNAjO表示序號為 j0的RNA序列，j0為1-nO的正整數，n0為所述微小數據庫中的RNA序列總數，并且RNAjO 是未能與基因組序列匹配的微小RNA，并且所述微小RNA測序數據庫不包括已驗證或證實 的hetRNA和已知小RNA的RNA序列；
[0035] (b)將所述微小RNA測序數據庫中的各RNA序列RNAjO,與標準RNA (reference RNA或RefSeq RNA)數據庫進行比對，從而在所述標準RNA數據庫中排除與各RNA序列 RNAjO不匹配的標準RNA序列，并選取標準RNA數據庫中與RNAjO匹配的標準RNA，并將對應 于該匹配的標準RNA的截短序列組成一級RNA篩選庫（匹配的RNAjO被稱為起始微RNA)， 其中，所述標準RNA的截短序列的結構如式I所示：
[0036] X-SEQfflAJ0-Y (I)
[0037] 式中，
[0038] SEQmj(l為相匹配的RNAjO的核苷酸序列；
[0039] X為所述標準RNA中位于所述RNAjO直接上游（immediately upstream)的長度為 50-100bp的核苷酸序列；
[0040] Y為所述標準RNA中位于所述RNAjO直接下游（immediately downstream)的長度 為50-100bp的核苷酸序列；
[0041] 為連接X和SEGUj。以及連接SEGUj。和Y的鍵（化學鍵）；
[0042] 其中所述一級RNA篩選庫所含有的各標準RNA的截短序列記為RNAj 1，其中，RNAj 1 表示序號為jl的標準RNA的截短序列，其中jl為1-nl的正整數，nl為一級RNA篩選庫中 的RNA序列總數；
[0043] (c)將所述一級篩選庫中的RNAjl，與基因組序列數據庫進行比對，從而排除不含 有內含子的RNA序列，并且選取內含子要位于成熟微RNA序列（即起始微RNA)之中的RNA 序列，組成二級RNA篩選庫，
[0044] 其中所述二級RNA篩選庫所含有的各RNA記為RNAj2,其中，RNAj2表示序號為j2 的RNA序列，其中j2為1-η2的正整數，n2為二級RNA篩選庫中的RNA序列總數；
[0045] (d)將所述二級篩選庫中的RNAj2序列進行二級結構分析，進行二級結構預測，排 除無法形成莖環結構的RNA序列，并將所述二級篩選庫中可形成莖環結構的RNA序列組成 三級RNA篩選庫，
[0046] 其中，所述三級RNA篩選庫所含有的各RNA記為RNAj3, RNAj3表示序號為j3的 RNA序列，其中j3為1-η3的正整數，n3為三級RNA篩選庫中的RNA序列總數；和
[0047] (e)對三級RNA篩選庫中的RNAj3序列，測定其形成hetRNA的能力，其中，如果所 述RNAj3能夠形成hetRNA，則所述的RNAj3是包含內含子的hetRNA前體，而其所形成的 hetRNA 為成熟 hetRNA。
[0048] 在另一優選例中，所述的hetRNA來源于選自下組的物種：哺乳動物、鳥類、爬行動 物、昆蟲。
[0049] 在另一優選例中，所述的哺乳動物包括人、嚙齒動物、靈長目、牛、羊、豬、狗、貓。
[0050] 更佳地，所述的哺乳動物包括小鼠、大鼠、人。
[0051] 在另一優選例中，所述的轉染受體細胞是293FT細胞。
[0052] 在另一優選例中，在轉染后，通過莖環引物擴增法（STEM LOOP PCR)進行檢測。
[0053] 在另一優選例中，所述的測序數據庫是深度測序的數據庫。
[0054] 在另一優選例中，所述的深度測序指測序深度彡20。
[0055] 本發明第三方面，提供了 一種鑒定候選RNA序列是否是包含內含子的hetRNA前體 的方法，包括步驟：
[0056] ⑴構建一表達載體，所述質粒攜帶對應于待鑒定的RNA序列的DNA序列并可將所 述DNA序列表達為RNA序列，其中所述的待鑒定的RNA序列包含內含子；
[0057] (ii)用所述表達載體轉染受體細胞，并培養所述的經轉染的受體細胞；
[0058] (iii)鑒別所述的經轉染的受體細胞中hetRNA，從而確定所述待鑒定的RNA序列 是否是包含內含子的hetRNA前體，其中，如果與對照的受體細胞相比，并經測序列證明，在 經轉染的受體細胞中形成了對應于所述待鑒定的RNA序列的hetRNA序列，則表示待鑒定的 RNA序列是包含內含子的hetRNA前體，而所形成的hetRNA為成熟hetRNA。
[0059] 在另一優選例中，所述的待鑒定的RNA序列來自用本發明第一方面所述方法構建 的用于hetRNA篩選的數據庫，即所述三級RNA篩選庫所含有的RNAj3。
[0060] 在另一優選例中，在步驟（iii)中，鑒別步驟包括：抽提所述經轉染的受體細胞的 總RNA ;PCR擴增待驗證的成熟hetRNA序列；以及對上述PCR擴增序列進行測序驗證。
[0061] 本發明第四方面，提供了一種用本發明第三方面所述的方法所鑒別出的微RNA分 子或微RNA分子的前體。
[0062] 在另一優選例中，所述的微RNA分子的序列如SEQ ID N0. :22或23所示的hetRNA ; 或
[0063] 所述的微RNA分子前體的序列如SEQ ID N0. : 24或25所示。
[0064] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0065] 圖1顯示了 hetRNA(前體包含內含子的微RNA)形成的示意圖。
[0066] 圖2顯示了本發明篩選天然hetRNA的分析流程圖。
[0067] 圖3顯示人工構建的包含內含子的miRNA前體可在細胞體系中剪切形成成熟 miRNA。圖中，"Primer"表示引物。
[0068] 其中，（A)為人造的包含內含子的miRNA前體的剪接過程的示意圖。
[0069] (B)對應于⑷中的核酸序列及結構。箭頭表示內含子hmirtron-1224插入 miR-1955前體的位點。
[0070] (C)內含子剪接后剩余產物的RT-PCR結果。剪接的確認引物與載體匹配，不與前 體匹配，如圖（A)所示，其序列為PCDNA6F和PCDNA6R。最后一條泳道的235bp和320bp條 帶分別指剪接前后的PCR產物。
[0071] (D)人工設計結構產生的成熟hetRNA-1955的RT-PCR結果。引物設計用標準 的莖環引物法。"No vector"指HEK293FT沒有轉染質粒；PE-miR-126, PE-miR-1955和 PE-miR-1955-hmirtron-1224 指樣品各自轉染包含 miR-126,miR-1955 和 miR-1955 中含內 含子 mirtron-1224 的 miR-1955 前體質粒；PE 指載體 pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR。U6 和 gapdh 作為上樣對照。所有PCR產物均經測序驗證。
[0072] 圖4顯示了天然內源性hetRNA_Ubap21的篩選和驗證。
[0073] 其中，（A)hetRNA_Ubap21的篩選示意圖。
[0074] (B)天然hetRNA_Ubap21過表達的證明。上圖的表達情況證實了內含子剪接。 最后一條泳道的926bp和243bp條帶指剪接前后的PCR產物。剪接的確認引物與載體匹 配，但不與前體匹配，如圖3(A)所示，其序列為1^)嫩6?和1^)嫩61? ;下圖指檢測成熟的 hetRNA_Ubap21。
[0075] (C)檢測小鼠組織中天然的內源性hetRNAs。上圖，證明天然內含子的剪接，引物 設計跨過內含子（見實施例）。下圖檢測小鼠組織中的hetRNA-Ubap21。PCR引物設計用標 準的莖環引物法。質粒被轉染進HEK293FT細胞。PE指所用載體。U6和gapdh作為上樣對 照。所有PCR產物均經測序驗證。
[0076] 圖5顯示了天然內源性hetRNA-Pccb的驗證。
[0077] 其中，（A)天然內源性hetRNA-Pccb利用細胞體系的驗證示意圖。
[0078] (B)對應于（A)中的核酸序列及結構。箭頭表示天然內含子插入hetRNA-Pccb前 體的位點。
[0079] (C)天然人hetRNA-Pccb過表達的證明。上圖的表達證實了內含子剪接的證明。 最后一條泳道的217bp條帶指剪接后的PCR產物，剪接的確認引物與載體匹配，但不與前體 匹配，如圖（A)所示，其序列為PCDNA6F和PCDNA6R ;下圖指檢測成熟的hetRNA-Pccb。
[0080] (D)檢測小鼠組織中天然的內源性hetRNAs。hetRNA-Pccb序列在大鼠附睪小RNA 文庫的垃圾序列中發現。在大鼠睪丸中能夠被RT-PCR和測序證明。PCR引物設計用標準的 莖環引物法。質粒被轉染進HEK293FT細胞。PE指所用載體。U6和gapdh作為上樣對照。 所有PCR產物均經測序驗證。
【具體實施方式】
[0081] 本發明人經過廣泛而深入的研究，首次開發了一種RNA-hetRNA篩選系統，并利用 篩選系統，首次驗證了在哺乳動物等物種中，存在內源性的含內含子的hetRNA前體分子， 即hetRNA前體。在此基礎上完成了本發明。
[0082] 具體地，本發明人選取質粒pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR作為載體，用含內含子的 hetRNA前體序列作為受體，FASTDIGEST限制性內切酶作為消化酶，293FT細胞作為反應器， STEM LOOP PCR作為表達檢測方法，形成一個完全的篩選技術系統，從而實現簡單快速經濟 地檢測hetRNA的表達。
[0083] 術語
[0084] 如本文所用，術語"本發明RNA"、"hetRNA"可互換使用，指由hetRNA前體所產生 的、長度彡30nt的微RNA。通常，hetRNA的長度為18-30nt。
[0085] 如本文所用，術語"本發明前體"、"本發明的RNA前體"、"hetRNA前體"可互換使 用，指可產生所述hetRNA的RNA分子，該前體的特點是具有莖環結構（也稱為發夾結構）， 并且在前體的序列中含有插入的內含子序列。所述hetRNA前體在剪接過程中，可剪切掉內 含子序列，從而產生長度< 30nt的hetRNA。通常，hetRNA前體的長度為50-200bp。
[0086] 應理解，本發明前體可指RNA序列、DNA序列或RNA-DNA序列，也包括相應的正義 序列或反義序列。
[0087] hetRNA
[0088] 本發明證實了，在未匹配的深度測序數據中，至少一部分序列是基因組轉錄來的 hetRNA前體，它被一個內含子所隔開。
[0089] 如圖1所示，在未匹配的深度測序數據中，基因組轉錄來的轉錄物（hetRNA前體） 被一個內含子所隔開。不象典型的miRNA和mirtron前體，產生的成熟hetRNA是前體中的 內含子被剪接后所形成的產物。
[0090] 天然hetRNA的鑒別
[0091] 本發明提供了一種鑒別各物種中，天然存在的或內源性hetRNA的方法和系統。
[0092] 參見圖2, 一種代表性的方法包括：
[0093] 通過對RNA深度測序小RNA數據的"垃圾"數據在NCBI網站上對標準RNA使用 BLAST，然后選取能夠匹配的標準RNA (reference RNA)(也可稱為參照RNA);
[0094] 將匹配的標準RNA再與基因組序列（同一物種）進行基因組的BLAST，選出在基 因組中被內含子所分隔的序列作為目標序列；
[0095] 將目標序列用the mFold Server網站進行二級結構預測，選取前體有莖環結構 的內含子打斷的微RNA作為以后實驗驗證的候選分子；
[0096] 對所述具有莖環結構的RNA序列，測定其形成hetRNA的能力，其中，如果所述 RNA能夠形成hetRNA，則表示所形成的微RNA是hetRNA，而相應的RNA序列是hetRNA前體。
[0097] 在本發明方法中，可使用商業化的或公開的數據庫，也可使用通過常規方法構建 的數據庫。代表性的數據庫包括（但并不限于）NCBI數據庫等。例如，網站blast可使用 地址：http://blast, ncbi. nlm. nih. gov/ ;mFold Server 網站可使用地址：http://mfold. rna. albany. edu/?q=mfold〇
[0098] 篩選系統和測定方法
[0099] 本發明還提供了一種用于本發明方法的篩選系統（RNA-hetRNA篩選系統）。
[0100] -種代表性的RNA-hetRNA的篩選系統包括：
[0101] (a)轉染質粒，所述轉染質粒用于插入對應于待篩選RNA分子的DNA序列；
[0102] (b)轉染受體細胞，所述的轉染受體細胞用于轉入所述的轉染受體，并且將所述轉 染質粒中所插入的DNA轉錄為RNA ;
[0103] (c)任選的抽提細胞總RNA的試劑；
[0104] (d)任選的進行STEM-LOOP PCR的試劑。
[0105] 一種代表性的轉染系統測定方法包括：
[0106] (el)提供質粒（例如pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR)作為轉染載體；
[0107] (e2)用多個引物對（含前體序列及插入其中的intron序列），通過PCR拼接形成 序列X，或商業化人工合成所述序列X，其中該序列X包含待測定的具有莖環結構的hetRNA 前體序列；
[0108] (e3)用合適內切酶分別酶切質粒和序列X ;
[0109] (e4)將上述序列X亞克隆進所述載體；
[0110] (e5)將步驟（e4)所得到質粒轉染合適的轉染受體細胞（如293FT細胞）；
[0111] (e6)用TRIZ0L試劑提取細胞總RNA ;
[0112] (e7)將步驟（e6)所得RNA用STEM-LOOP PCR方法檢測目標hetRNA的表達。
[0113] 本發明的主要優點包括：
[0114] (a)提供了一種篩選天然hetRNA的方便可行的路徑和方法，為將來大規模的發現 驗證hetRNA提供了強大的技術支撐。
[0115] (b)首次證實了包括人在內的物種中，存在hetRNA前體以及所述hetRNA前體可產 生長度< 30nt的hetRNA。為研究hetRNA及其前體的功能奠定了基礎。
[0116] (c)為從廢棄的微RNA深度測序列數據庫中挖掘新型微RNA提供了一種新思路。
[0117] (d)打破了基因測序結果分析中傳統以與基因組匹配為標準的黃金準則，建議改 為以RNA和基因組雙重匹配為標準。
[0118] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照 常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否 則百分比和份數是重量百分比和重量份數。
[0119] 材料和通用方法
[0120] 1.主要試劑
[0121] pcDNA6· 2_GW/EmGFP-miR :購自 INVITRIGEN。
[0122] 限制性內切酶 Fast-Digest :購自 Fermentas。
[0123] 2.試驗方法
[0124] 2.1質粒構建
[0125] 質粒pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR-X的產生。序列X由上海博尚生物技術公司合成， 然后亞克隆進載體 pcDNA6. 2-GW/EmGFP(Invitrogen，UK)的 Hind III 和 EcoR I 位點。 質粒pcDNA6. 2-GW/EmGFP-miR-Y的產生。序列Y用引物對通過PCR，然后亞克隆進載體 pcDNA6.2_GW/EmGFP(Invitrogen，UK)的 BamHI and Xhol 位點。為了成功的構建質粒，不 要選用通常所的限制性內切酶，而要選用Fast-Digest系統（如Fermentas, Canada)來作 用于特別復雜的雙發夾前體結構的。X序列用于構建人工模型，Y序列用于鑒定內源性的 hetRNAs。所有的序列最終均過測序確認（Biosune，China)。
[0126] X序列如下：
[0127] Mir-1955-hmirtron_1224 前體：
[0128] ctggtttacttactacaagtcccag gtgaggactcgggaggtggagggtggtgccgccggggc cgggcgctgtttcagctcgcttctccccccacctcctctctcctcag gatgcactgcagctttttcttaa cttcagacaagagcattgcatgctgggacatgtagttggtttaaatagca(SEQ ID NO:1)
[0129] 其中，粗體為 intron hmirtron-1224;非粗體部分為 mir_1955precursor ;下劃線 部分是成熟的 mir-1955(agtcccaggatgcactgcagctttt，SEQ ID N0:2);斜體堿基為突變堿 基。
[0130] Y序列如下：
[0131] HetRNA_Ubap21前體序列（含天然內含子），PCR擴增用小鼠Raw264. 7細胞基因 組DNA為模板。引物如下：
[0132] Pre-hetRNA-Ubap21_F:catcgcggatcctcagtcgacaacttatacctcccaa(SEQ ID NO:3);
[0133] Pre-hetRNA-Ubap21in-R:gaaccgctcgagaccttcaacagattgcgtggtctg (SEQ ID NO:4)〇
[0134] HetRNA_Ubap21前體序列（不含天然內含子），用Trizol法抽提的Raw264. 7細胞 總RNA轉錄來的cDNA為模板，通過PCR擴增獲得。其中，引物如下：
[0135] hetRNA-Ubap21-F:CATCGCGGATCCtcagtcgacaacttatacctcccaa(SEQ ID NO. :5);
[0136] hetRNA-Ubap21in-R:GAACCGCTCGAGactgtttcattgagagagggtatact(SEQ ID NO. : 6)。
[0137] hetRNA-Pccb的前體序列（含或不含天然內含子）均用HEK293FT細胞，其中不含 天然內含子的前體序列擴增所使用的是Trizol法抽提的細胞總RNA轉錄來的cDNA為模 板，前體含天然內含子的序列擴增則使用細胞基因組DNA為模板。擴增hetRNA前體及前體 含內含子的引物如下：
[0138] hhetRNA-Pccb-F:TCACCGGAATTCgtcacagtcatcaccaggaa(SEQ ID NO. :7);
[0139] hhetRNA_Pccb-R:GTACCCAAGCTTtagttggtatcaccacaaaggtgc(SEQ ID NO. :8)。
[0140] 細胞培養和轉染
[0141] HEK293T細胞（實驗室保存或常規市售）用培養其常規的市售培養基Dulbecco' s modified Eagle's medium(DMEM)，其中含 10% 胎牛血清（Hyclone，USA)。質粒轉染用 Lipofectamine2000 (Invitrogen，UK)，操作按說明書進行。
[0142] E14T小鼠胚胎干細胞（ESCs)(購自Austin Smith)用無飼養層培養。E14T小鼠 胚胎干細胞用懸滴法誘導向心肌的自發分化。簡單講，ESCs被胰酶消化（D0)并懸浮培養 在培養基中，沒有LIF for2days (D2)，接下懸浮培養四天，胚狀體鋪板于明膠覆蓋的培養盤 (D6)當出現自發收縮的買心肌細胞時收集樣品D9。在各個時間點樣品用于提取RNA。
[0143] RNA 分離和 RT-PCR
[0144] 小鼠或培養的細胞總RNA用TRIzol提取（購自Invitrogen，UK)，用Super Script II reverse transcriptase(Invitrogen，UK)反轉錄 cDNA，其中 miRNA用特異性莖環引物， mRNA和u6用隨機引物，mRNA和gapdh用oligo dT。PCR擴增必須用高保真的K0D-PLUS DNA polymerase(Toyobo，Japan)。所有操作根據說明書進行。所有PCR產物均經測序確認 (Invitrogen，UK)〇
[0145] 引物如下（5'to3'）：
[0146]
【權利要求】
1. 一種構建用于hetRNA篩選的數據庫的方法，其特征在于，所述方法包括： (a) 提供一微小RNA深度測序數據庫， 其中所述微小RNA測序數據庫中的各RNA序列記為RNAjO,其中RNAjO表示序號為jO 的RNA序列，jO為1-nO的正整數，nO為所述微小數據庫中的RNA序列總數，并且RNAjO是 未能與基因組序列匹配的微小RNA，并且所述微小RNA測序數據庫不包括已驗證或證實的 hetRNA和已知小RNA的RNA序列； (b) 將所述微小RNA測序數據庫中的各RNA序列RNAjO,與標準RNA (reference RNA或 RefSeq RNA)數據庫進行比對，從而在所述標準RNA數據庫中排除與各RNA序列RNAjO不匹 配的標準RNA序列，并選取標準RNA數據庫中與RNAjO匹配的標準RNA，并將對應于該匹配 的標準RNA的截短序列組成一級RNA篩選庫（匹配的RNAjO被稱為起始微RNA)，其中，所述 標準RNA的截短序列的結構如式I所示： X-SEQ碰J0-Y (I) 式中， SEQ?^為相匹配的RNAjO的核苷酸序列； X為所述標準RNA中位于所述RNAjO直接上游的長度為50-100bp的核苷酸序列； Y為所述標準RNA中位于所述RNAjO直接下游的長度為50-100bp的核苷酸序列； 為連接X和SEQK_以及連接SEQK_和Y的鍵； 其中所述一級RNA篩選庫所含有的各標準RNA的截短序列記為RNAjl，其中，RNAjl表 示序號為jl的標準RNA的截短序列，其中jl為1-nl的正整數，nl為一級RNA篩選庫中的 RNA序列總數； (c) 將所述一級篩選庫中的RNAj 1，與基因組序列數據庫進行比對，從而排除不含有內 含子的RNA序列，并且選取內含子要位于成熟微RNA序列之中的RNA序列，組成二級RNA篩 選庫， 其中所述二級RNA篩選庫所含有的各RNA記為RNAj2,其中，RNAj2表示序號為j2的 RNA序列，其中j2為1-η2的正整數，n2為二級RNA篩選庫中的RNA序列總數； (d) 將所述二級篩選庫中的RNAj2序列進行二級結構分析，進行二級結構預測，排除無 法形成莖環結構的RNA序列，并將所述二級篩選庫中可形成莖環結構的RNA序列組成三級 RNA篩選庫，即用于hetRNA篩選的數據庫， 其中，所述三級RNA篩選庫所含有的各RNA記為RNAj3, RNAj3表示序號為j3的RNA序 列，其中j3為l_n3的正整數，n3為三級RNA篩選庫中的RNA序列總數。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的微小RNA測序數據庫中的RNA序列長 度為 18-30nt。
3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟（d)中還包括：將所述微小RNA測序 數據庫中對應于RNAjO的各RNA序列組成相應的成熟hetRNA庫。
4. 一種鑒定由包含內含子的hetRNA前體產生的成熟hetRNA的方法，其特征在于，包括 步驟： (a)提供一微小RNA深度測序數據庫， 其中所述微小RNA測序數據庫中的各RNA序列記為RNAjO,其中RNAjO表示序號為jO 的RNA序列，jO為Ι-nO的正整數，nO為所述微小數據庫中的RNA序列總數，并且RNAjO是 未能與基因組序列匹配的微小RNA，并且所述微小RNA測序數據庫不包括已驗證或證實的 hetRNA和已知小RNA的RNA序列； (b) 將所述微小RNA測序數據庫中的各RNA序列RNAjO,與標準RNA (reference RNA或 RefSeq RNA)數據庫進行比對，從而在所述標準RNA數據庫中排除與各RNA序列RNAjO不匹 配的標準RNA序列，并選取標準RNA數據庫中與RNAjO匹配的標準RNA，并將對應于該匹配 的標準RNA的截短序列組成一級RNA篩選庫（匹配的RNAjO被稱為起始微RNA)，其中，所述 標準RNA的截短序列的結構如式I所示： X-SEQ碰J0-Y (I) 式中， SEQ?^為相匹配的RNAjO的核苷酸序列； X為所述標準RNA中位于所述RNAjO直接上游的長度為50-100bp的核苷酸序列； Y為所述標準RNA中位于所述RNAjO直接下游的長度為50-100bp的核苷酸序列； 為連接X和SEQK_以及連接SEQK_和Y的鍵； 其中所述一級RNA篩選庫所含有的各標準RNA的截短序列記為RNAjl，其中，RNAjl表 示序號為jl的標準RNA的截短序列，其中jl為1-nl的正整數，nl為一級RNA篩選庫中的 RNA序列總數； (c) 將所述一級篩選庫中的RNAj 1，與基因組序列數據庫進行比對，從而排除不含有內 含子的RNA序列，并且選取內含子要位于成熟微RNA序列之中的RNA序列，組成二級RNA篩 選庫， 其中所述二級RNA篩選庫所含有的各RNA記為RNAj2,其中，RNAj2表示序號為j2的 RNA序列，其中j2為1-η2的正整數，n2為二級RNA篩選庫中的RNA序列總數； (d) 將所述二級篩選庫中的RNAj2序列進行二級結構分析，進行二級結構預測，排除無 法形成莖環結構的RNA序列，并將所述二級篩選庫中可形成莖環結構的RNA序列組成三級 RNA篩選庫， 其中，所述三級RNA篩選庫所含有的各RNA記為RNAj3, RNAj3表示序號為j3的RNA序 列，其中j3為l_n3的正整數，n3為三級RNA篩選庫中的RNA序列總數；和 (e) 對三級RNA篩選庫中的RNAj 3序列，測定其形成hetRNA的能力，其中，如果所 述RNAj3能夠形成hetRNA，則所述的RNAj3是包含內含子的hetRNA前體，而其所形成的 hetRNA 為成熟 hetRNA。
5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的hetRNA來源于選自下組的物種：哺 乳動物、鳥類、爬行動物、昆蟲。
6. 如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述的哺乳動物包括人、哨齒動物、靈長目、 牛、羊、豬、狗、貓。
7. -種鑒定候選RNA序列是否是包含內含子的hetRNA前體的方法，其特征在于，包括 步驟： (i) 構建一表達載體，所述質粒攜帶對應于待鑒定的RNA序列的DNA序列并可將所述 DNA序列表達為RNA序列，其中所述的待鑒定的RNA序列包含內含子； (ii) 用所述表達載體轉染受體細胞，并培養所述的經轉染的受體細胞； (iii) 鑒別所述的經轉染的受體細胞中hetRNA，從而確定所述待鑒定的RNA序列是否 是包含內含子的hetRNA前體，其中，如果與對照的受體細胞相比，并經測序列證明，在經轉 染的受體細胞中形成了對應于所述待鑒定的RNA序列的hetRNA序列，則表示待鑒定的RNA 序列是包含內含子的hetRNA前體，而所形成的hetRNA為成熟hetRNA。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，在步驟（iii)中，鑒別步驟包括：抽提所述 經轉染的受體細胞的總RNA ;PCR擴增待驗證的成熟hetRNA序列；以及對上述PCR擴增序列 進行測序驗證。
9. 一種用權利要求4所述的方法所鑒別出的微RNA分子或微RNA分子的前體。
10. 如權利要求9所述的微RNA分子，其特征在于，所述的微RNA分子的序列如SEQ ID NO. : 22或23所示的hetRNA ;或 所述的微RNA分子前體的序列如SEQ ID NO. : 24或25所示。
【文檔編號】C12N15/113GK104123480SQ201310153531
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月27日 優先權日:2013年4月27日
【發明者】荊清, 李湘麒, 李粵 申請人:中國科學院上海生命科學研究院