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高表達外源蛋白的哺乳動物細胞株快速篩選的制作方法

文檔序號:513559閱讀:654來源:國知局
高表達外源蛋白的哺乳動物細胞株快速篩選的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種快速篩選高表達外源蛋白的哺乳動物細胞株的方法。該方法應用新型的高效表達載體,實現目標蛋白在合適的哺乳動物宿主細胞中的高效表達,并通過獨特的篩選方法,快速篩選獲得高表達目標蛋白的細胞株。利用本發明的方法可大大減少篩選高表達目標蛋白細胞株的時間和成本,并顯著提高外源蛋白在哺乳動物宿主細胞中的表達水平。
【專利說明】高表達外源蛋白的晡乳動物細胞株快速篩選 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明屬于生物【技術領域】,具體涉及一種快速篩選穩定高產量哺乳動物細胞株的 方法。利用本發明的篩選方法可快速獲得高表達外源蛋白的穩定哺乳動物細胞株。 【背景技術】
[0002] 隨著生物醫藥技術的發展,治療用重組蛋白(包括抗體)已廣泛應用于臨床實踐 中。許多治療性的重組蛋白要保持其生物活性往往需要特定的翻譯后修飾,如糖基化等,而 原核生物或者低級的真核生物細胞表達系統缺少復雜的翻譯后修飾功能。隨著糖蛋白類藥 物的逐漸普及,哺乳動物表達系統尤其是CH0細胞(Chinese hamster ovary,中國倉鼠卵巢 細胞)表達系統正成為重組蛋白藥物生產的最主要宿主細胞。目前已有多種外源基因如人 組織型纖溶酶原激活劑、促紅細胞生成素(Erythropoietin,簡稱ΕΡ0)、凝血因子VIII和單 克隆抗體CD20等在哺乳動物細胞中得到表達和生產,上述藥物均已上市,且每個藥物年銷 售額超過10億美元。
[0003] 然而,由于哺乳動物細胞生長慢、培養基成分復雜、生長條件苛刻,而且外源蛋白 表達水平低、篩選表達目標蛋白的穩定高產細胞株耗時耗力、細胞培養成本高、技術復雜等 因素,致使利用哺乳動物細胞生產蛋白質類藥物的成本較高、周期長。快速篩選穩定高產量 的細胞工程株,是目前重組蛋白藥物研究和生產的主要瓶頸之一。
[0004] 為了獲得表達目標蛋白的高表達穩定細胞株,需要應用表達載體將目標基因轉染 到哺乳動物宿主細胞并整合到宿主細胞染色體上,隨著宿主細胞的轉錄翻譯,目標基因得 以有效表達。因此,獲得高表達哺乳動物細胞株的關鍵要素包括表達載體、宿主細胞、轉染 和篩選方法,其中表達載體和細胞株篩選方法是目標蛋白得以穩定高效表達的的最重要因 素。
[0005] 傳統的哺乳動物細胞表達載體通常包含四個表達框,分別用于表達目標基因、哺 乳動物細胞抗性篩選標記基因(如博來霉素,Zeocin,簡稱ΖΕ0)、擴增選擇性標記基因(如 二氫葉酸還原酶,dyhidrofolate reductase,簡稱DHFR)以及在大腸桿菌中復制增殖基因, 每個表達框都含有各自獨立的啟動子和終止子,位于上述表達基因的上下游。表達載體進 入細胞后,編碼蛋白通過細胞的轉錄和翻譯機制以及必要的翻譯后修飾產生。對于哺乳動 物宿主細胞來說,外源序列的整合必然會影響到宿主細胞的正常生長,宿主細胞會通過一 系列的機制來抵御外源基因的整合。由于傳統哺乳動物細胞表達載體含有4個表達框,載 體一般大于8kb,不利于外源基因整合到宿主細胞染色體上,增加宿主細胞的負擔并導致外 源基因對宿主細胞的傷害。因此縮減載體的大小,對于目標基因的高效穩定表達具有重要 意義。另外,由于外源基因非特異性的整合,載體過大會造成其各元件整合到宿主細胞基因 組的不同位置,給后期的篩選工作帶來很大的不便。例如,用抗性篩選得到的細胞很可能是 僅僅整合并表達了抗性篩選基因的細胞,而不表達目標蛋白的細胞。因此減小載體大小還 有利于減少篩選到假陽性的幾率。
[0006] 快速篩選方法是獲得高產量穩定表達細胞株的關鍵因素。常規的篩選方法是利 用單個篩選標記來篩選含有目標基因的穩定細胞株,單個篩選標記通常為抗性標記,如ZEO 標記,具體來說,將篩選標記基因和目的基因連接在同一載體中,然后轉染到宿主細胞中, 實現目的基因和標記基因的共同表達,常規篩選方法中標記基因和目標基因表達水平相 近,有可能篩選到的是表達標記基因的細胞,而不是表達目標基因的細胞。因而常規篩選方 法需要在成千上萬個細胞篩選到高表達穩定單克隆細胞,獲得穩定高表達細胞株的過程至 少需要半年以上的時間,耗費大量的時間和成本,制約了重組蛋白藥物的大規模生產。
【發明內容】

[0007] 本發明通過分子生物學技術構建和優化哺乳動物細胞新型表達載體,利用本發明 的表達載體將目標基因轉染到合適的宿主細胞,并通過獨特的篩選方法獲得高表達目標基 因的工程細胞株。本發明可快速、有效地篩選高表達外源蛋白的工程細胞株,實現目標蛋白 在哺乳動物細胞中的高效穩定表達,節約蛋白藥物開發成本和時間。
[0008] 本發明的一個目的是提供一種高效的新型哺乳動物細胞表達載體。具體說,本發 明的表達載體是利用分子生物學技術構建和優化的一種新型哺乳動物表達載體。該表達載 體僅含單個表達框,不含有任何目標蛋白在哺乳動物細胞表達系統中不必要的冗余序列, 利用一個啟動子實現目標基因的高效表達和標記基因的弱化表達,本發明的哺乳動物細胞 表達載體比傳統的表達載體至少小3kb。同時,本發明表達載體中在標記基因和目標基因中 間引入了 IRES(Internal ribosome entry site,內部核糖體進入位點)序列,該序列可弱 化下游標記基因的表達,從而在標記基因表達的同時,確保目標基因得以商效穩定的表達。
[0009] 具體來說,本發明的表達載體是多個基因或基因片段重要元件的優化組合,所述 表達載體由以下元件或序列組成,且最好以下列順序排列:
[〇〇1〇] a) -個強啟動子
[0011] b)目標基因克隆位點
[0012] c)合成的IRES序列
[0013] d)擴增標記基因
[0014] e)FMDV IRES 序列
[0015] f)合成的大腸桿菌EM7元件 [〇〇16] g)嵌合篩選標記基因
[〇〇17] h)轉錄終止子
[0018] i) 一個啟動在大腸桿菌中起始復制的PUC序列。
[0019] 所述的一個強啟動子是病毒啟動子,如CMV(cytomegalovirus,巨細胞病毒)、 SV40(Simian virus40,猴空泡病毒40)、RSV(Rous sarcoma virus,肉瘤病毒)、MLV(Murine leukovirus,小鼠白血病病毒)、MPSV(myeloproliferative sarcoma virus,骨髓增殖肉瘤 病毒),和/或非病毒啟動子(如人鐵蛋白重鏈核心啟動子)以及其他調控序列的組合。優 選的強啟動子是,CMV啟動子,其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0020] 所述的目標基因克隆位點是,用于克隆目標基因的多個限制性內切酶位點。
[0021] 所述合成的IRES序列是本領域內已知的GTX同源結構域蛋白的多個重復的5'非 翻譯區域的一部分,具有IRES的功能,其核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示。
[0022] 所述的擴增標記基因是本領域內已知的DHFR序列或GS序列 (Glutaminesynthetase,谷氨酰胺合成酶)。DHFR催化了二氫葉酸轉化為四氫葉酸。氨甲 喋呤(MTX)抑制二氫葉酸還原酶,因此轉染DHFR缺陷型宿主細胞,能夠通過擴增DHFR基因 來形成對MTX的抗性。
[0023] 所述的FMDV IRES序列是本領域已知的來自口蹄疫病毒(Foot and mouth disease virus,簡稱FMDV)的IRES序列,其核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示。
[0024] 所述的合成的大腸桿菌EM7元件為人工合成的EM7元件,該元件僅含有66個堿基 序列,其核苷酸序列如SEQ ID N0 :4所示。
[0025] 所述的嵌合篩選標記基因是多個選擇性抗性標記基因的組合,抗性基因包括抗 ΖΕ0、PUR(pur〇mycin,嘌呤霉素)、HYP(Hygr〇mycin,潮霉素)或是任何一個熒光標記基因, 優選的包括 GFP(Green Fluorescent Protein,綠色突光蛋白)、RFP(Red Fluorescent Protein,紅色突光蛋白)。
[0026] 所述的轉錄終止子是本領域內已知的終止序列,如BGH(bovine growth hormone, 牛生長激素)終止子、SV40 終止子、HSV TK(Herpes simplex virus-thymidine kinase,單 純皰疹病毒胸苷激酶基因)終止子。
[0027] 所述的一個啟動在大腸桿菌中起始復制的PUC序列是本領域內已知的啟動在大 腸桿菌中起始復制的PUC起始序列。
[0028] 本發明的另一個目的是提供一種快速篩選高表達外源蛋白的哺乳動物細胞株的 方法,該方法包括以下步驟:
[0029] a)利用上述本發明新型的高效表達載體將目標基因轉染到宿主細胞;
[0030] b)利用本發明獨特的篩選方法快速篩選得到高表達目標蛋白的穩定細胞株。
[0031] 所述的表達載體僅含單個表達框,是多個基因或基因片段重要元件的優化組合, 其結構與上述本發明的表達載體結構相同。
[0032] 所述的宿主細胞選自CH0, NS0, HEK293, Sp2/0,優選的是CH0細胞。
[0033] 所述的轉染方法是所述的轉染方法包括磷酸I丐法,電轉法(electroporation),脂 質體轉染(phospholipids),優選的轉染方法是電轉法轉染。
[〇〇34] 所述的快速篩選方法是利用嵌合篩選標記進行高表達穩定細胞株的篩選。嵌合篩 選標記可以是ΗΥΡ、ΖΕ0和PUR等抗性基因與DHFR、GS或GFP的任意組合。優選的嵌合篩選 標記為ΖΕ0和GFP的組合(ZE0-GFP),其核苷酸序列如SEQ ID N0 :5所示。
[0035] 本發明的篩選方法同時采用了嵌合篩選標記,可大大提高篩選效率,具體說,利用 傳統篩選方法獲得高產穩定表達目標蛋白的細胞株需要6-9個月,而采用本發明獨特的篩 選方法,只需8-9周便可獲得高表達目標蛋白的細胞株。
[0036] 本發明快速篩選高產穩定細胞株的方法與常規篩選方法相比,具有以下優點和效 果:
[0037] 本發明表達載體僅含有單個哺乳動物細胞表達框,并在目標基因和標記基因之間 引入了合成的優化IRES序列,大大降低了假陽性克隆的概率,并顯著提高目標基因在宿主 細胞中的表達水平。
[0038] 基于上述表達載體,本發明采用了獨特的篩選方法,常規方法需要在103幾何階數 的細胞中篩選到表達目標基因的細胞克隆,而本發明只需從1〇 2幾何階數的細胞中便可篩 選到高表達目標基因的細胞克隆。特別是嵌合了 GFP熒光標記,可根據熒光強度使用流式 細胞分選儀進行高通量分選,使用熒光顯微鏡進一步確認陽性表達克隆,簡化了篩選步驟, 縮短了篩選時間,因而大大提高了篩選效率。換言之,利用常規表達系統在哺乳動物細胞中 獲得重組蛋白的最優表達水平需要6-9個月,而利用本發明表達系統只需8-9周便可獲得 商表達目標蛋白的細胞株。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 附圖強調了本發明的原則,不一定成比例。
[0040] 圖1 :實施例1構建的哺乳動物細胞表達載體示意圖。
[0041] A)傳統的哺乳動物細胞表達載體pA。傳統表達載體含有四個獨立的表達框,各兀 件的排列順序如下:(1)CMV啟動子;(2)目標基因克隆位點;(3)BGH終止子;(4)EFl-a啟 動子;(5)DHFR擴增基因序列;(6)HSV TK終止子;(7)SV40啟動子;(8)ZE0抗性基因;(9) SV40終止子;(10)PUC復制起點;(11)大腸桿菌骨架和氨芐抗性基因(AmpO。
[0042] B)本發明的表達載體pB。本發明的表達載體僅包括單個表達框,不同表達基因間 采用不同的IRES序列連接。表達載體pB各元件的排列順序如下:(1) CMV啟動子;(2)目標 基因克隆位點;(3)合成的GTX IRES序列;(4)DHFR擴增基因;(5)FDMV IRES序列;(6)EM7 元件;(7) ZE(f-GFP嵌合篩選標記基因;(8) SV40終止子;(9) PUC復制起點。
[0043] 圖2 :實施例2中的Western Bloting結果圖。比較了含ΕΡ0基因的表達系統 A(pA-EPO)和表達系統B(pB-EPO)穩定表達目標基因的水平。
[0044] 圖3 :實施例2中獲得穩定轉染的含ΕΡ0基因的pA(pA-EPO)和pB(pB-EPO)細胞 株的表達量對比圖。
[0045] 圖4 :實施例5中的Western Bloting的結果圖。比較了含tPA基因的表達系統 A(pA-tPA)和表達系統B(pB-tPA)穩定表達目標基因的水平。
[0046] 圖5 :實施例5中獲得穩定轉染的含tPA基因的pA(pA-tPA)和pB(pB-tPA)細胞 株的表達量對比圖。 【具體實施方式】
[〇〇47] 實施例1 :哺乳動物細胞表達載體的構建
[0048] 方法:通過分子生物學技術,如限制性酶切、DNA連接、大腸桿菌轉化和克隆篩選 按照《分子克隆實驗指南》(第三版,黃培堂譯,科學出版社)等標準方法構建傳統表達載體 PA和本發明表達載體pB。具體操作方法如下:
[0049] 1. 1傳統表達載體pA的構建:以Invitrogen公司pcDNA3. 1載體為模板。
[0050] 人工合成啟動子SV40、DHFR、終止子sv40及其他調控序列的融合序列(1. 8kb)并 在其末端分別添加 spel和Nael的酶切位點。將該合成的融合序列采用T4DNA連接酶連接 到經spel和Nael雙酶切的pcDNA3. 1,通過大腸桿菌轉化,并進行單克隆篩選得到傳統表達 載體pA。
[0051] 1. 2本發明表達載體pB的構建:利用限制性內切酶Bglll和Seal雙酶切去掉
[0052] pcDNA3. 1載體上的大腸桿菌中的骨架序列(1. 4kb),用Klenow酶將粘性末端補齊 后再用T4DNA連接酶連接。使用限制性內切酶去除BGH終止子、SV40啟動子序列(1. 5kb), 同時人工合成含有GTX IRES、DHFR、FWDV IRES E7融合序列及嵌合選擇標記基因 ZE0-GFP 的融合DNA序列,用T4DNA連接酶將酶切的載體與人工合成的融合序列連接。通過大腸桿 菌轉化和克隆篩選得到本發明表達載體PB。
[0053] 結果:圖1顯示了傳統哺乳動物細胞表達載體pA的結構圖(大小:7. 4kb)和本發 明表達載體PB的結構圖(大小:4. 5kb)。
[0054] 傳統表達載體含有四個獨立的表達框。表達載體pA各兀件的排列順序如下:
[0055] a)CMV 啟動子;
[0056] b)目標基因克隆位點;
[0057] c) BGH 終止子;
[0058] d)EFl_a 啟動子;
[0059] e)DHFR擴增基因序列;
[0060] f) HSV TK 終止子;
[0061] g)SV40 啟動子;
[0062] h)ZE0抗性基因;
[0063] i) SV40 終止子;
[0064] j)PUC復制起點;
[0065] k)大腸桿菌骨架序列和氨芐抗性基因(Amp。序列
[〇〇66] 本發明的表達載體pB僅含單個表達框,由以下元件或序列組成,且以如下順序排 列:
[0067] a)CMV 啟動子;
[0068] b)目標基因克隆位點;
[0069] c)合成的GTX IRES序列
[0070] d) DHFR擴增標記基因;
[0071] e)FMDV IRES 序列;
[0072] f) EM7 元件
[0073] g)ZE(f-GFP嵌合篩選標記基因;
[0074] h) SV40 終止子;
[0075] i)PUC復制起點。
[0076] 結果:與含有多個表達框的傳統哺乳動物細胞表達載體比較,本發明表達載體pB 僅含一個表達框,只使用一個CMV啟動子,同時刪除了大腸桿菌中的骨架序列及其他多余 的啟動子和終止子序列,比傳統載體至少小3kb。
[0077] 實施例2 :快速篩選高表達ΕΡ0蛋白的穩定細胞株
[0078] 2. 1.構建含有目標基因的表達載體:根據NCBI已有的序列信息人工合成ΕΡ0的 編碼序列,并通過引入相應的酶切位點(Nhel和Hindlll)將其克隆至實施例1構建的表達 載體pA和pB中,獲得含有目標基因的表達質粒pA-EPO和pB-EPO。
[0079] 2. 2. DNA轉染至CHO-dhfr-懸浮細胞株:將上述含有目標基因的表達質粒pA-EPO 和pB-EPO,以及表達載體對照pA和pB分別轉染到DHFR酶缺陷的CH0細胞(CH〇-dhfr_)中。 CH〇-dhff細胞為懸浮培養,轉染時細胞密度為1. 5X106/ml,轉染體積為30ml。轉染方法 按照Lipofectamine2000(購自Invitrogen)使用說明操作。
[0080] 2. 3.穩定表達ΕΡ0細胞株的篩選:
[0081] 具體方法如下:
[0082] (1)將上述DNA轉染至CH〇-dhfr_細胞后,搖瓶培養48小時,分別取樣觀察細胞活 力,活力大于90%可以進行種板。用新鮮的選擇培養基(含100yg/ml Zeocin)重懸離心 后的細胞,以1000-5000個/孔種在96孔板中。轉染20天可見明顯的細胞克隆生長。
[0083] (2)分別挑選轉染了 4種DNA的全部細胞克隆于另外的96孔板中,用不含抗性的 懸浮培養基培養3天,取上清用ELISA測定96孔板中ΕΡ0的表達,以此計算陽性克隆率。
[0084] (3)將培養了 4種DNA的細胞克隆96孔板的上清分別收集并混合后做Western Blotting,用于檢測4種轉染了不同DNA的細胞表達。
[0085] (4)根據ELISA測定結果,分別選擇5-10個轉染了 pA-EPO和pB-EPO表達質粒的 最高0D讀數的細胞克隆進行擴增,擴增時用不含抗性的懸浮培養基培養。當各個克隆擴增 至細胞數大于1X 1〇7個時,為了提高目的基因的拷貝數和目標基因的穩定表達,各個克隆 采用MTX加壓篩選方法。
[0086] (5)轉染了 pA-EPO 的細胞克隆用梯度 ΜΤΧ (50ηΜ、500ηΜ、1μΜ、2μΜ、3μΜ、4μΜ、 5 μ Μ)進行逐步加壓篩選,每次接種于96孔板的細胞密度為每孔100-500個,每個梯度的篩 選時間為10-15天,并用ELISA檢測較高表達的1-2個克隆用于下一梯度ΜΤΧ加壓,最終得 到穩定表達的細胞株。
[〇〇87] (6)轉染了 pB-EPO的細胞克隆首先用流式細胞術篩選出熒光最亮的5%的細胞, 用5 μ Μ MTX進行加壓篩選,接種于96孔板的細胞密度為每孔100-500個,篩選時間為 10-15天,并用ELISA檢測較高表達的1-2個克隆作為穩定表達的細胞株候選,最終通過比 較得到最終的工程細胞株。
[0088] (7)兩種轉染了含ΕΡ0表達質粒的細胞克隆分別保種5X107細胞總數后擴增至 100ml,密度以IX 106/ml開始,每日檢測細胞的密度和表達量,連續培養10天,記錄下各個 細胞克隆的每日的細胞密度及表達水平,并繪制生長曲線以及表達曲線。
[0089] 結果:與傳統的篩選方法比較,本發明的篩選方法采用含嵌合ZE0-GFP熒光標記 的表達載體。經過篩選得到的細胞克隆,ELISA分析結果顯示,本發明篩選方法的陽性克隆 率為95%,傳統篩選方法的陽性克隆率僅為15%,即本發明的篩選方法假陽性率顯著低于 傳統的篩選方法(P < 〇. 05)。
[0090] Western Blotting的結果表明(圖2),與陰性對照(pA、pB)相比,轉染了 pA-EPO 和pB-EPO的細胞能檢測到目標基因的表達,且本發明篩選方法(pB-EPO)中ΕΡ0表達水平 明顯高于傳統篩選方法(pA-EPO) (P < 0. 05)。
[0091] 經過MTX加壓篩選得到穩定表達ΕΡ0的細胞株,連續培養10天后檢測其中的ΕΡ0 蛋白表達量,結果顯示,本發明篩選方法(表達載體pB-EPO)從第4天開始表達量明顯比傳 統篩選方法(表達載體pA-EPO)中的ΕΡ0表達量高(圖3),到第10天時本發明篩選方法中 蛋白表達量為136.9mg/L,而傳統篩選方法中蛋白表達量僅為15. 5mg/L(表1、圖3)。
[0092] 本發明篩選方法采用含嵌合ZE0-GFP熒光標記的表達載體,特別是嵌合了 GFP熒 光標記,可根據熒光強度使用流式細胞分選儀進行高通量分選,簡化了篩選步驟,縮短了篩 選時間,因而大大提高了篩選效率。
[0093] 同時,本發明結合利用IRES使得標記基因 DHFR弱化表達,在相同濃度MTX加壓 時,本發明表達方法獲得的目標基因拷貝數遠遠高于傳統表達方法,從而本發明表達體系 中的假陽性率遠遠低于傳統篩選體系,并且表達水平更高。因此傳統篩選方法需要MTX加 壓梯度更多,至少需要32周才能獲得穩定表達的細胞株。而本發明篩選方法由于其陽性率 高,MTX加壓梯度少,僅需要9周便得到了高表達目標蛋白的細胞株(表1)。
[0094] 表1.傳統篩選方法和本發明快速篩選方法獲得的ΕΡ0穩定細胞株各參數對比
[0095]
【權利要求】
1. 一種新型的哺乳動物細胞表達載體,其特征在于,所述的哺乳動物表達載體僅含有 單個表達框,由一個強啟動子帶動目標基因、篩選標記基因和擴增標記基因的表達。這些基 因之間通過IRES序列連接。
2. 根據權利要求1所述的哺乳動物細胞表達載體,其中單個表達框包括下列原件,且 優選以如下順序排列:(a)強啟動子;(b)目標基因克隆位點;(c)合成的IRES元件;(d)擴 增標記基因;(e)FMDV IRES元件;(f)合成的大腸桿菌EM7元件;(g)嵌合篩選標記基因; (h)轉錄終止子;和(i)啟動在大腸桿菌中起始復制的PUC序列。
3. 根據權利要求2所述的哺乳動物細胞表達載體,其中強啟動子包括CMV、SV40、 EFl-a、RSV、MLU、MPSV啟動子,優選CMV啟動子,其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
4. 根據權利要求2所述的哺乳動物細胞表達載體,其中合成的IRES元件包括FMDV IRES序列和合成的GTX IRES序列,所述的FMDV IRES核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示,所 述的合成的GTX IRES核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示。
5. 根據權利要求2所述的哺乳動物細胞表達載體,其中擴增標記基因包括DHFR基因和 GS基因。
6. 根據權利要求2所述的哺乳動物細胞表達載體,其中嵌合篩選標記基因包含具有雙 功能的抗生素篩選基因如ZEO,HYP,NEO,和熒光蛋白基因如GFP,RFP的嵌合體,前者可用于 轉化子的抗生素篩選,后者可作為熒光顯微鏡或流式細胞儀分選標記。
7. -種高表達外源蛋白的哺乳動物細胞株的快速篩選方法,該方法包括以下步驟:1) 采用權利要求1-6任意一項權利要求所述的哺乳動物細胞表達載體將目標基因轉染到合 適的哺乳動物宿主細胞,2)利用篩選方法快速篩選高表達目標蛋白的穩定細胞株。
8. 根據權利要求7所述的快速篩選方法,其中所述的轉染方法包括磷酸鈣法,電轉法, 脂質體轉染,優選的轉染方法是電轉法轉染。
9. 根據權利要求7所述的快速篩選方法,其中所述的哺乳動物宿主細胞選自中國倉鼠 卵巢CH0細胞,HEK293、BHK、NS0和Sp2/0,優選的宿主細胞是中國倉鼠卵巢CH0細胞。
10. 根據權利要求7所述的快速篩選方法,其特征在于,將多個不同的篩選標記基因進 行組合,采用嵌合篩選標記進行高表達細胞株的篩選,所述的嵌合篩選標記包括ZEO、HYP、 PUR等抗性基因與GFP、RFP的任意組合,優選的嵌合篩選標記為ZE0和GFP的組合ZE0-GFP, 其核苷酸序列如SEQ ID NO : 5所示。
【文檔編號】C12N5/10GK104087612SQ201310232148
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年6月13日 優先權日:2013年6月13日
【發明者】侯永敏, 李強, 李屹晨, 雷瑤 申請人:廣州優聯康醫藥科技有限公司
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