一種小分子rna及其在害蟲防治中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種小分子RNA及其在害蟲防治中的應用。本發明提供了一種小分子RNASli-miR-2771，通過體內、體外試驗證實Sli-miR-2771可通過結合解毒酶谷胱甘肽轉移酶slgste1的3’非編碼區，抑制slgste1的表達，使斜紋夜蛾減少對有毒的植物次生物質的解毒能力，進而影響斜紋夜蛾進食植物與生長狀況，達到害蟲防治的目的。該發明為害蟲防治提供了新思路和新途徑，在害蟲防治領域中將具有廣闊的應用前景。
【專利說明】—種小分子RNA及其在害蟲防治中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，特別涉及一種小分子RNA及其在害蟲防治中的應用。
【背景技術】
[0002]小分子RNA (miRNA)是一類長度約21~24核苷酸非編碼的小分子RNA，廣泛存在于動、植物體中。一系列實驗表明miRNA可能是一類在進化上保守的、在生物體中具有重要調控作用的分子。
[0003]miRNA源自細胞核內編碼miRNA的基因轉錄成pr1-microRNA,接著被Drosha酶剪切為長度約70 bp呈發夾狀的pre-miRNA,隨后被核質/細胞質轉運蛋白從細胞核內轉運到胞質中，之后被Dicer酶剪切成長為18-26bp的miRNA雙螺旋復合體。其中一條解螺旋，并結合到RNA誘導的基因沉默的復合物內，形成非對稱的RISC復合物。這個復合物通過其中的miRNA與靶mRNA的3’ UTR互補配對結合，從而降解靶目標mRNA或阻斷其翻譯，實現對靶標基因的負調控。近年來盡管有大量的miRNA被鑒定，但僅少數miRNA的功能被闡明。有文獻報道，miRNA在基因表達、信號轉導、植物發育、抵抗脅迫、預防疾病等方面起著至關重要的作用。因此，研究對昆蟲抗藥性相關基因具有沉默功能的miRNA，并將其應用于農業害蟲的綜合治理成為近年研究的熱點。
[0004]谷胱甘肽轉移酶是一種多功能的二相解毒酶，它廣泛存在于動物與植物中，它通過催化還原谷胱甘肽與親電性有毒物質的結合作用而轉化為親水性的無毒物質；同時谷胱甘肽轉移酶還具有過氧化物酶活性，通`過催化還原谷胱甘肽與脂質過氧化中間或終端產物作用，而參與細胞內因農藥和重金屬等引起的氧脅迫，而增加生物體的耐性。但是，生物體中的谷胱甘肽轉移酶是一大家族基因，不同的同工酶可能有不同的作用底物與酶活性，而且雖然動物與植物體內都有谷胱甘肽轉移酶，但對不同種類有毒物質的降解作用會不一樣。
[0005]斜紋夜蛾為雜食性昆蟲，可危害多達290多種植物，特別是十字花科的經濟作物，對經濟收入有很大的影響。目前害蟲的防治仍以化學殺蟲劑為主，但大量而長期的使用不僅造成了各地害蟲的抗藥性，使殺蟲劑的劑量使用越來越多，進而造成環境的污染和影響食品的安全。 申請人:從農業害蟲斜紋夜蛾中篩選出高活性的編碼谷胱甘肽轉移酶的解毒基因，以其為靶標，研制出防治害蟲的抑制劑，為斜紋夜蛾的防治提供新思路。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在于提供一種小分子RNA。
[0007]本發明的再一個目的在于提供該小分子RNA在害蟲防治中的應用。
[0008] 申請人:從斜紋夜蛾中獲得了一小分子RNA，命名為Sl1-miR-2771，其序列為:UAACAUUAUGAGGAUGGGUUGAACUG (SED ID N0.1)。通過生物信息學分析，預測 SliiiR-2771可能調控并通過熒光素酶報告載體實驗、細胞轉染實驗、蟲體注射實驗以及實時熒光定量PCR等多種實驗技術，證實了 Sl1-miR-2771可通過結合的3’非編碼區，抑制ie7的表達。蟲體體內實驗更證實了 Sl1-miR-2771可以通過抑制的表達，使斜紋夜蛾減少了對有毒的植物次生物質的解毒能力，進而影響斜紋夜蛾進食植物與生長狀況，達到害蟲防治的目的。該發明方法為害蟲防治提供了新思路和新途徑，在害蟲防治領域中將具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009]圖1為注射miRNAs后斜紋夜蛾的體重統計結果；
圖2為注射miRNAs72h后斜紋夜蛾的外型觀察結果；
圖3為注射miRNAs后進食芥菜的斜紋夜蛾中slgstel的表達量檢測結果；
圖4為熒光素酶報告系統驗證miRNAs與slgsten’ UTR結合的實驗流程圖；
圖5為miRNAs與slgstelZ, UTR結合實驗的熒光素酶活性測定結果；
圖6為細胞株添加miRNAs后吲哚-3-甲醇(I3C) % slgstel的誘導結果；
圖7為miR-2771與slgstel 3’ UTR結合的計算機模擬圖。
【具體實施方式】
[0010] 申請人:用植物源殺蟲劑、有機磷殺蟲劑和擬除蟲菊酯類殺蟲劑、以及有機氯類的DDT對農業重要害蟲斜紋夜蛾進行誘導實驗，發現了一個谷胱甘肽轉移酶對這些處理都有著高表達。經測序發現該酶為基因庫中號碼為A`Y506545的谷胱甘肽轉移酶，按分類原則，將其重新命名為把Wgsid基因進行體外蛋白表達，并對它的酶催化作用進行分析，結果表明，它對芥菜的兩種主要次生物質吲哚-3-甲醇(非揮發的)和烯丙基異硫氰酸酯(氣味成分)具有解毒作用，對其他的次生物質如花椒毒素也有作用。
[0011] 申請人:從斜紋夜蛾中獲得了一小分子RNA，命名為Sl1-miR-2771，其序列為:UAACAUUAUGAGGAUGGGUUGAACUG (SED ID N0.1)。通過生物信息學分析，預測 miR-2771 可能調控并通過熒光素酶報告載體實驗、細胞轉染實驗、蟲體注射實驗以及實時熒光定量PCR等多種實驗技術，證實了 miR-2771可以通過結合的3’非編碼區，抑制slgstel的表達。蟲體體內實驗更證實了 miR-2771可以通過抑制的表達,使斜紋夜蛾減少了對有毒的植物次生物質的解毒能力，進而影響斜紋夜蛾進食植物與生長狀況。
[0012]下面結合具體實施例，進一步闡述本
【發明內容】
。
[0013]以下實施例中所用Sl1-miR-2771 mimics (后續簡寫為miR-2771 mimics)和NCmimics (陰性對照mimics)由上海吉瑪制藥技術有限公司合成,稀釋濃度為2 μ g/μ I。當然，本領域技術人員也可選擇通過構建載體，表達后純化獲得Sl1-miR-2771。
[0014]實施例1
選取大小一致、健康狀況一致的五齡第一天斜紋夜蛾幼蟲，稱量每頭蟲子的重量，隨機分為miR-2771 mimics處理組和NC mimics對照組,每組40頭，重復3次。順血液循環流動方向，用WPI微量注射器從斜紋夜蛾幼蟲的側腹部分別注射miR-2771 mimics和NCmimics，注射量為每頭蟲4 μ g，注射后飼喂芥菜。注射后第1、2、3天觀察蟲子的形態變化并拍照取證，每天統計蟲子體重的變化，并隨機取3條蟲子提取RNA，熒光定量PCR檢測slgstel mRNA 的表達。[0015]圖1顯示注射miRNAs后斜紋夜蛾幼蟲的體重統計結果、圖2顯示注射miRNAs 72h后斜紋夜蛾幼蟲的外型觀察結果，可見，注射miR-2771 mimics后喂食芥菜，斜紋夜蛾生長速度變慢，無論從體重還是外型上，注射miR-2771 mimics的斜紋夜蛾進食及生長速度顯著低于NC對照組。
[0016]將蟲子樣品按Trizol法抽提總RNA，測定濃度后取2 μ g總RNA進行反轉錄(參考TAKARA的M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit說明書進行)，得到的cDNA產物稀釋后用于熒光定量PCR的模板。所用PCR引物對SIGSTel-realtime-F和SlGSTel-realtime-R的序列如下:
SIGSTel-realtime-F GCTGAACTCCGCCTATGAAA(SED ID N0.2)；
SlGSTel- realtime-R CCAGAAGGGATGCTGATGATAC (SED ID N0.3)。
[0017]突光定量PCR反應體系如表1所示:
表1熒光定量PCR反應體系__
【權利要求】
1.一種小分子 RNA，其序列為:UAACAUUAUGAGGAUGGGUUGAACUG (SED ID N0.1)。
2.權利要求1所述的小分子RNA在害蟲防治中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用 ，所述害蟲為斜紋夜蛾。
【文檔編號】C12N15/113GK103497950SQ201310288857
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年7月10日 優先權日:2013年7月10日
【發明者】鄒曉鵬, 鄭思春, 馮啟理, 鄒海望, 徐智斌 申請人:華南師范大學