利用重組微生物生產生物燃料的制作方法

利用重組微生物生產生物燃料的制作方法
【專利摘要】本文提供了一種用于生產生物燃料的代謝修飾微生物。具體而言，本文提供了由合適的底物生產包括異丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇的高級醇的方法。
【專利說明】利用重組微生物生產生物燃料
本申請是針對申請日為2008年2月8日、申請號為200880009662.8、發明名稱為“利用重組微生物生產生物燃料”的專利申請的分案申請。
對相關申請的交叉引用
[0001]本申請要求2007年2月9日提交的第60/900，477號美國臨時專利申請、2007年2月9日提交的第60/900，546號美國臨時專利申請、2007年4月4日提交的第60/921，927號美國臨時專利申請和2007年8月17日提交的第60/956，634號美國臨時專利申請的優先權,這些申請的公開內容以引用的方式并入本申請。
【技術領域】
[0002]本發明提供代謝修飾微生物以及生產這種微生物的方法。還提供通過利用合適的底物與代謝修飾微生物及其酶制劑接觸生產生物燃料的方法。
【背景技術】
[0003]由于經濟和環境問題，用生物燃料代替石油的需求日益增長。常見的生物燃料如乙醇并不是一種理想的燃料，因為它的能量密度比汽油低，并且必須在限定的濃度范圍內與汽油混合，才能作為運輸用燃料。乙醇還具有吸濕性和腐蝕性，這就造成了貯存和配送系統方面的問題。

【發明內容】

[0004]本發明提供一種能夠產生選自下組的醇類的重組微生物:(a)正丙醇；(b)異丁醇，其產率為每克葡萄糖產生約0.12至0.41g異丁醇；(c)正丁醇；(d) 2-甲基-1-丁醇；Ce) 3-甲基-1-丁醇jP(f) 2-苯基乙醇，這種醇類從包含2-酮酸的代謝物中產生。在一實施方案中，該微生物經過112小時左右的培養，產生的乙醇不到240mg/L。在另一實施方案中，在相似條件下培養時，該微生物的乙醇生產曲線與被命名為SA237或CRS-BU0H23的微生物的生產曲線基本相同。在另一實施方案中，經過大約16至64小時的培養，異丁醇的產率約為每克葡萄糖產生約0.33至0.36g異丁醇,或每克葡萄糖產生約0.36至0.40g異丁醇。還有一實施方案中，每克葡萄糖的乙醇產率不足0.0037g/g左右。在一實施方案中，與親本微生物相比，該微生物的乙醇生產能力較低。在另一實施方案中，該微生物將乙酰輔酶A轉化為乙醇的能力降低或受到抑制。在另一實施方案中，重組微生物的乙醇脫氫酶含量減少，因此，其乙醇生產能力降低。在一實施方案中，該微生物能夠表達將丙酮酸轉化為α-酮異戊酸的酶或增加此酶的表達。在另一實施方案中，此酶是2-酮酸脫羧酶(例如，Pdc> Pdcl> Pdc5、Pdc6、Aro 10> Thi3、Kivd、KdcA和前述各種酶的同源體或變體，以及與前述任何一種酶有至少60%同一性且具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽)。在另一實施方案中，2-酮酸脫羧酶由一種多聚核苷酸編碼,這種多聚核苷酸與選自下組的一種核酸有60%的同一性:pdc、pdcl、pdc5、pdc6、arolO、thi3、kivd、kdcA和前述各種基因的同源基因或變體，或它們的片段，其中這種多聚核苷酸編碼具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。在一個具體實施方案中，2-酮酸脫羧酶由一個源自kivd基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。在一實施方案中，與其親本微生物相比，此微生物能夠增加2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達或活性。在一實施方案中，醇脫氫酶選自下組:Adhl、Adh2、Adh3、Adh4、Adh5、Adh6、Sfal和前述各種酶的同源體或變體，以及與前述任何一種酶有至少60%同一性并具有醇脫氫酶活性的多肽。在另一實施方案中，醇脫氫酶由一種多聚核苷酸編碼，這種多聚核苷酸與選自下組的一種核酸有至少60%同一性:adhl、adh2、adh3、adh4、adh5、adh6、sfal基因和前述各種基因的同源基因或變體，其中這種多聚核苷酸編碼具有2-醇脫氫酶活性的多肽。在一實施方案中，此重組微生物的一個基因發生一處或多處缺失或敲除，這個基因編碼的酶能夠催化乙酰輔酶A轉化為乙醇；催化丙酮酸酯轉化為乳酸酯；催化延胡索酸酯轉化為琥珀酸酯；催化乙酰輔酶A和磷酸酯轉化為輔酶A和乙酰磷酸；催化乙酰輔酶A和甲酸酯轉化為輔酶A和丙酮酸酯，乙酰輔酶A的乙酰基和3-甲基-2-氧代丁酸酯(2-氧代異戊酸酯)的縮合反應，2-異丙基蘋果酸酯和3-異丙基蘋果酸酯的異構化反應；催化α -酮酸轉化為支鏈氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；催化丙酮酸酯轉化為乙酰輔酶A ;催化生成支鏈氨基酸；催化蘇氨酸生成α -酮丁酸酯的反應；催化蛋氨酸生物合成的第一步反應；以及催化蘇氨酸的代謝。例如，這種微生物可能包含選自下組的一種或多種基因缺失:adhE、IdhAλ frdBC、fnr、pta、pflB、leuA、leuB、leuC、leuD、ilvE、tyrB、poxB、ilvB、ilvl、ilvA、metA、tdh、前述各種基因的同源基因及自然產生的突變。在一個具體實施方案中，此微生物的基因型選自下組:(a)選自下組基因的一種缺失或敲除，選自一組基因，這組基因包括:Δ adhE、Δ ldhA、Δ pta> Δ leuA、Δ leuB、Δ leuC、Δ leuD、ΔροχΒ、Δ ilvB> Δ ilvl>AmetA、Δ tdh及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生正丙醇；(b)選自下組基因的一種缺失或敲除:Λ adhE、Δ ldhA, AfrdB、Λ frdC、Δ fnr、Δ pta、Δ pf lB、Δ leuA、Δ ilvE、Δ poxB、Δ ilvA 及其任何組合，并包含 kivd>ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生異丁醇；(c)選自下組基因的一種缺失或敲除:Δ adhE> Δ ldhA、Δpta> ΔροχΒ、Δ ilvB> Δ ilvl> ΔmetA> Δ tdh 及其任何組合,并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生正丁醇；(d)選自下組基因的一種缺失或敲除:Λ ilvB、Λ ilvl、AmetA、Δ tdh及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生2-甲基-1-丁醇；(e)選自下組基因的一種缺失或敲除:Δ adhE> Δ ldhA、Δ frdB> Δ frdC、Δ fnr> Δ pta> Apf IB、Δ ilvE> Δ tyrB 及其任何組合，并包含kivd、ThrABC和adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生3-甲基1_ 丁酉享;和(:0選自下組基因的一種缺失或敲除:Δ adhE> Δ ldhA、Δ frdB> Δ frdC、Δ fnr>Δ pta、Δ pf IB、Δ leuA、Δ ilvE、Δ poxB、Δ ilvA 及其任何組合，并包含 kivd>ThrABC 和 adh2的表達或增強表達，其中，此微生物產生2-苯基乙醇。在另一實施方案中，ThrABC包含抗反饋抑制的ThrA*。在一實施方案中，此重組微生物含有被命名為SA237或CRS_BuOH23的微生物的表型。
[0005]本文提供的是代謝修飾微生物，其包括生化重組途徑，該途徑利用合適的底物，通過代謝工程微生物生產生物燃料，包括異丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇、2-苯基乙醇、正丙醇或正丁醇等。本發明還提供利用本文描述的微生物生產生物燃料的方法。
[0006]在一實施方案中，提供了產生一種醇類的重組微生物。該醇類可以是正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇。通常情況下，可利用含有2-酮酸的代謝物并以發酵或非發酵方式(即在有氧或無氧條件下)生產醇類。在某些方面，2-酮酸包含2-酮丁酸、2-酮異戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸、2-酮基-4-甲基戊酸或苯丙酮酸。在其他方面，與其親本微生物相比，此重組微生物增加2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達或活性。2-酮酸脫羧酶可能是來自釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Pdc6、或ArolO、或Thi3 ;來自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的Kivd;來自丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)的Pdc,或它們的同源體。2-酮酸脫羧酶可以由源自以下一種基因的多聚核苷酸編碼:來自釀酒酵母的H)C6、來自釀酒酵母的AROlO、來自釀酒酵母的THI3、來自乳酸乳球菌的kivd、來自丙酮丁醇梭菌的pdc，或它們的同源基因。在某些方面，醇脫氫酶可能是來自釀酒酵母的Adh2或其同源基因，由源自釀酒酵母ADH2基因的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，提供了一種產生異丁醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含增加乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶以及醇脫氫酶的表達或活性。在某些方面，此微生物能夠包含增加乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶以及醇脫氫酶的表達。在某些方面，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的丙酮酸酯。因此，此重組微生物還可以含有adhE、ldh、frd、fnr、pflB、ackA或pta基因或它們的任何組合的基因缺失或表達抑制。特別是，此重組微生物能夠含有單獨的adh、ldh、frd基因缺失或與fnr、fnr和pta、pta和pflb組合的基因缺失。在某些方面，此重組微生物還可以含有其基因組的部分缺失，例如缺失大腸桿菌(E.coli)基因組中約I, 397，551個到約I, 439，877個的核苷酸。一方面，乙酰羥酸合成酶可由源自以下基因的多聚核苷酸編碼:ilvIH操縱子、ilvBN操縱子、大腸桿菌的ilvGM、來自枯草芽孢桿菌的alsS基因，或它們的同源基因。ilvIH操縱子的ilvl基因編碼乙酰羥酸合成酶的大亞基多肽，ilvIH操縱子的ilvH基因編碼乙酰羥酸合成酶的小亞基多肽。另一 方面，乙酰羥酸還原異構酶可由源自大腸桿菌ilvC基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另外，二羥酸脫水酶可由源自ilvD基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，2-酮酸脫羧酶可由源自以下基因的多聚核苷酸編碼:乳酸乳球菌的kivd基因或其同源基因，或釀酒酵母的AROlO基因或其同源基因。另一方面，醇脫氫酶可由源自釀酒酵母的ADH2基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。
[0007]通常，大腸桿菌的ilvIH操縱子編碼乙酰羥酸合成酶，這是異亮氨酸、纈氨酸和亮氨酸生物合成途徑中的第一個酶。乙酰羥酸合成酶III同功酶由兩個亞基組成，即ilvl基因產物(乙酰羥酸合成酶III的大亞基)和ilvH基因產物(乙酰羥酸合成酶的小亞基)，能夠催化大腸桿菌K-12中異亮氨酸、亮氨酸及纈氨酸生物合成的共同第一步反應。大腸桿菌的ilvC基因編碼乙酰羥酸還原異構酶，這是平行進行的異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑中的第二個酶。大腸桿菌的ilvD基因編碼二羥酸脫水酶，這是異亮氨酸-纈氨酸生物合成途徑中的第三個酶。在某些方面，此重組微生物包含乙酰乳酸合成酶的表達增加。乙酰乳酸合成酶可來自枯草芽抱桿菌(Bacillus subtilis)的AlsS。
[0008]在一實施方案中，提供了一種產生正丁醇的重組微生物。與其親本微生物相比,此微生物包含2-異丙基蘋果酸合成酶、β -異丙基蘋果酸脫氫酶、異丙基蘋果酸異構酶和蘇氨酸脫水酶的表達或活性增加。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的2-酮基戊酸。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有較低水平的2-酮異戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸或2-酮基-4-甲基戊酸或它們的任何組合。因此，與其親本微生物相比，此微生物還可含有ilvD基因缺失或表達受抑制。一方面，2-異丙基蘋果酸合成酶可由源自IeuA基因的多聚核苷酸或其同源體編碼。另一方面，β-異丙基蘋果酸脫氫酶可由源自IeuB基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，異丙基蘋果酸異構酶可由源自IeuCD操縱子或其同源操縱子的多聚核苷酸編碼。通常，IeuCD操縱子的IeuC基因編碼異丙基蘋果酸異構酶的大亞基多肽，IeuCD操縱子的IeuD基因編碼異丙基蘋果酸異構酶的小亞基多肽。另一方面，蘇氨酸脫水酶可由源自ilvA基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，蘇氨酸脫水酶可由源自tdcB基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還可含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶、蘇氨酸脫水酶或它們的任何組合的表達或活性的增加。在某些方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶或蘇氨酸脫水酶分別由源自以下基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼:ppc、pyc、aspC、thrA、asd、thrB、thrC、sdaAB 和 tdcB 基因。
[0009]在一實施方案中，提供了一種產生正丙醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含α -異丙基蘋果酸合成酶、問號鉤端螺旋體(Leptospira interrogans)的LeuB、異丙基蘋果酸異構酶和蘇氨酸脫水酶的表達或活性的增加。一方面，α-異丙基蘋果酸合成酶可由源自CimA基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。CimA基因可能是問號鉤端螺旋體的cimA基因或詹氏甲燒暖球菌(Methanocaldococcus jannaschii)的cimA基因。另一方面，異丙基蘋果酸脫氫酶可由源自IeuB基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，異丙基蘋果酸異構酶可由源自IeuCD操縱子或其同源操縱子的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還可含有以下酶的表達或活性的增加:磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲 氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶或蘇氨酸脫水酶，或它們的任何組合。在某些方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶或蘇氨酸脫水酶分別由源自以下基因的多聚核苷酸編碼:ppc、pyc、aspC、thrA、asd、thrB、thrC、sdaAB和tdcB基因，或其同源基因。
[0010]在另一實施方案中，提供了一種產生2-甲基-1-丁醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含蘇氨酸脫水酶、乙酰羥酸合成酶、乙酰羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達或活性的增加，并產生2-甲基1- 丁醇。在某些方面，蘇氨酸脫水酶可由源自ilvA基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，蘇氨酸脫水酶可由源自tdcB基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的2-酮基-3-甲基戊酸。另一方面，2-酮酸脫羧酶可由源自以下基因的多聚核苷酸編碼:kivd基因或其同源基因；H)C6基因或其同源基因；THI3基因或其同源基因。
[0011]在另一實施方案中，提供了一種產生3-甲基-1-丁醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含乙酰羥酸合成酶或乙酰乳酸合成酶、乙酰羥酸還原異構酶、二羥酸脫水酶，2-異丙基蘋果酸合成酶、異丙基蘋果酸異構酶、β -異丙基蘋果酸脫氫酶、2-酮酸脫羧酶以及醇脫氫酶的表達或活性的增加。在某些方面，乙酰羥酸合成酶可由源自ilvIH操縱子或其同源操縱子的多聚核苷酸編碼。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自alsS基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自ilvMG操縱子或其同源操縱子的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的2-酮異己酸。另一方面，乙酰乳酸合成酶可由源自ilvNB操縱子或其同源操縱子的多聚核苷酸編碼。
[0012]在另一個實施方案中，提供了一種生產苯基乙醇的重組微生物。與其親本微生物相比，此微生物包含分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶、分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶、2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的表達或活性的增加。另一方面，分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶可由源自pheA基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。另一方面，分支酸變位酶T/預苯酸脫水酶可由源自tyrA基因或其同源基因的多聚核苷酸編碼。在另一實施方案中，與其親本微生物相比，此重組微生物還含有更高水平的苯丙酮酸。
[0013]在一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為正丁醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物的方法:2_異丙基蘋果酸合成酶活性、β -異丙基蘋果酸脫氫酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性和蘇氨酸脫水酶活性。
[0014]在另一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為異丁醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:乙酰羥酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。
[0015]在另一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為正丙醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:α -異丙基蘋果酸合成酶活性、β -異丙基蘋果酸脫氫酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性和蘇氨酸脫水酶活性。
[0016]在一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為2-甲基-1-丁醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:蘇氨酸脫水酶活性、乙酰羥酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。
[0017]在另一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為3-甲基-1- 丁醇。此方法包含用一種或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:乙酰羥酸合成酶活性或乙酰乳酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-異丙基蘋果酸合成酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性、β -異丙基蘋果酸脫氫酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。
[0018]在另一實施方案中，提供了一種生產重組微生物的方法，此微生物能夠將合適的底物或代謝中間物轉化為苯基乙醇。此方法包含用一種`或多種編碼包括以下活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶活性、分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。
[0019]在另一實施方案中，提供了一種生產一種醇類的方法。此方法包含提供一種本文中提供的重組微生物；在適合于將底物轉化為醇類的條件下，利用合適的底物或代謝中間物培養微生物；以及檢測醇類的產量。在許多方面，該醇類可以是正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇。另一方面，這些底物或代謝中間物包括一種2-酮酸，例如2-酮丁酸、2-酮異戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基-3-甲基戊酸、2-酮基-4-甲基-戊酸或苯丙酮酸。
[0020]本發明的一個或多個實施方案的細節通過附圖和以下說明陳述。其他特點、目標和優點在說明、附圖和權利要求中顯而易見。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]本附圖并入本說明書中，并構成本說明書的一部分，用來描述本發明的一個或多個實施方案，并與【具體實施方式】一起解釋本發明的原理與實現方式。
[0022]圖1A-C描述了有助于了解本發明的反應途徑。(A)描述了利用2-酮酸代謝生產醇類的一條代表性非發酵合成途徑。(B)描述了基因工程大腸桿菌中醇類化合物的代表性生成途徑。灰色箭頭代表2-酮酸降解途徑。酶、LeuAB⑶、IIvA和IIvIHCD代表氨基酸生物合成途徑。雙線代表氨基酸生物合成途徑的副反應。(C)描述了微生物的一般反應途徑，并標出了這個生物體內可被破壞或敲除的酶，以增加所需反應方向的通量(例如增加合成丙酮酸的通量，減少流向其他競爭性途徑的丙酮酸通量)。
[0023]圖2A-C描述了經修飾的氨基酸生物合成途徑，以改進異丁醇和正丁醇的生產。A圖顯示了經改造的ilvIHCD途徑存在或不存在的情況下異丁醇的產量。左邊區域:異丁醇產量；右邊區域:每克葡萄糖的異丁醇產率。異丁醇的最高產率的理論值為0.41g/g。B圖顯示了經改造的ilvA-leuAB⑶途徑存在或不存在的情況下由葡萄糖獲得正丁醇的產量。左邊區域:正丁醇產量；右邊區域:相同菌株的正丙醇產量。圖C顯示了加入L-蘇氨酸時的正丁醇產量。左邊區域:正丁醇產量；右邊區域:相同菌株的正丙醇產量。
[0024]圖3描述了異丁醇對細胞生長的影響。上面顯示含有或不含有2%異丁醇時，野生型菌株和高耐受性突變菌株的細胞生長時間過程。兩種菌株在LB培養基中都生長到指數期。在0D_為~3.5時，向培養基加入2%`異丁醇。三角形:未加異丁醇的野生型菌株；菱形:添加異丁醇的野生型菌株；方形:未添加異丁醇的高耐受性突變菌株；圓形:添加異丁醇的高耐受性突變菌株。
[0025]圖4描述了大腸桿菌中異丁醇的代表性生產途徑。
[0026]圖5描述了異丁醇產量的質譜分析檢測結果。
[0027]圖6描述了質譜分析數據。
[0028]圖7描述了由丙酮酸生成2-酮基異戊酸的代表性途徑。
[0029]圖8描述了亮氨酸的代表性生物合成途徑。
[0030]圖9描述了異亮氨酸的代表性生物合成途徑。
[0031]圖10描述了以2-酮基丁酸為中間產物的丁醇代表性生物合成途徑。
[0032]圖11描述了由丙酮酸生成丁醇的代表性生物合成途徑。
[0033]圖12描述了以蘇氨酸為中間產物的丁醇代表性生物合成途徑。
[0034]圖13描述了生產異丁醇類化合物(例如，2-甲基丙基醇)、3_甲基-1-丁醇、正丁醇、乙醇、2-甲基-1- 丁醇和正丙醇的代表性生物合成途徑。
[0035]圖14描述了生產苯基乙醇、乙醇、3-甲基-1- 丁醇和異丁醇類化合物(例如2-甲基丙基醇)的代表性生物合成途徑。
[0036]圖15描述了源自kivd基因的核酸序列(序列ID號:27)，此基因編碼具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。
[0037]圖16描述了源自H)C6基因的核酸序列(序列ID號:29)，此基因編碼一段具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。
[0038]圖17描述了源自AR010基因的核酸序列(序列ID號:31 )，此基因編碼一段具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。
[0039]圖18描述了源自THI3基因的核酸序列(序列ID號:33)，此基因編碼一段具有
2-酮酸脫羧酶活性的多肽。
[0040]圖19描述了源自pdc基因的核酸序列(序列ID號:35)，此基因編碼一段具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。
[0041]圖20描述了源自ADH2基因的核酸序列(序列ID號:37)，此基因編碼一段具有醇脫氫酶活性的多肽。
[0042]圖21描述了源自ilvl基因的核酸序列(序列ID號:39)，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶大亞基活性的多肽。
[0043]圖22描述了源自ilvH基因的核酸序列(序列ID號:41 )，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶小亞基活性的多肽。
[0044]圖23描述了源自ilvC基因的核酸序列(序列ID號:43)，此基因編碼一段具有乙酰羥酸還原異構酶活性的多肽。
[0045]圖24描述了源自ilvD基因的核酸序列(序列ID號:45)，此基因編碼一段具有二羥酸脫水酶活性的多肽。
[0046]圖25描述了源自ilvA基因的核酸序列(序列ID號:47)，此基因編碼一段具有蘇氨酸脫水酶活性的多肽。
[0047]圖26描述了源自IeuA基因的核酸序列(序列ID號:49)，此基因編碼一段具有
2-異丙基蘋果酸合成酶活性的多肽。
[0048]圖27描述了源自IeuB基因的核酸序列(序列ID號:51)，此基因編碼一段具有β-異丙基蘋果酸脫氫酶活性的多肽。
[0049]圖28描述了源自IeuC基因的核酸序列(序列ID號:53)，此基因編碼一段具有異丙基蘋果酸異構酶大亞基活性的多肽。
[0050]圖29描述了源自IeuD基因的核酸序列(序列ID號:55)，此基因編碼一段具有異丙基蘋果酸異構酶小亞基活性的多肽。
[0051]圖30描述了源自CimA基因的核酸序列(序列ID號:57)，此基因編碼一段具有α-異丙基蘋果酸合成酶活性的多肽。
[0052]圖31描述了源自ilvM基因的核酸序列(序列ID號:59)，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶大亞基活性的多肽。
[0053]圖32描述了源自ilvG基因的核酸序列(序列ID號:61 )，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶小亞基活性的多肽。
[0054]圖33描述了源自 ilvN基因的核酸序列(序列ID號:63)，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶大亞基活性的多肽。[0055]圖34描述了源自ilvB基因的核酸序列(序列ID號:65)，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶小亞基活性的多肽。
[0056]圖35描述了源自adhE2基因的核酸序列(序列ID號:67)，此基因編碼一段具有醇脫氫酶活性的多肽。
[0057]圖36描述了源自L1-cimA基因的核酸序列(序列ID號:69)，此基因編碼一段具有α-異丙基蘋果酸合成酶活性的多肽。
[0058]圖37描述了源自L1-1euC基因的核酸序列(序列ID號:71 )，此基因編碼一段具有異丙基蘋果酸異構酶大亞基活性的多肽。
[0059]圖38描述了源自L1-1euD基因的核酸序列(序列ID號:73)，此基因編碼一段具有異丙基蘋果酸異構酶小亞基活性的多肽。
[0060]圖39描述了源自L1-1euB基因的核酸序列(序列ID號:75)，此基因編碼一段具有β-異丙基蘋果酸脫氫酶活性的多肽。
[0061]圖40描述了源自PheA基因的核酸序列(序列ID號:77)，此基因編碼一段具有分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶活性的多肽。
[0062]圖41描述了源自TyrA基因的核酸序列(序列ID號:79)，此基因編碼一段具有分支酸變位酶T/預苯酸脫水酶活性的多肽。
[0063]圖42描述了源自alsS基因的核酸序列(序列ID號:81 )，此基因編碼一段具有乙酰乳酸合成酶活性的多肽。
[0064]圖43描述了不同微生物的敲除突變與異丙酸產量間的相關性。
[0065]圖44描述了對普通搖瓶與`帶螺旋蓋燒瓶內異丁醇產量的比較。
[0066]圖45描述了超過200小時的分批補料過程中，添加不同的復合培養基組分對異丁
醇產量的影響。
[0067]圖46顯示了從葡萄糖轉化為3-甲基-1-丁醇的代謝途徑。除另有注明外，所有基因均來自大腸桿菌。BS=枯草芽孢桿菌；LL=乳酸乳球菌；SC=釀酒酵母。
[0068]圖47A-B顯示了 3_甲基_1_ 丁醇的初期產量。方格柱形代表異丁醇；實心柱形代表3-甲基-1- 丁醇。(A) JCL16中3-甲基-1- 丁醇的產量。對攜帶ilvIH (EC)或alsS(BS)基因并具有IeuAB⑶基因染色體或質粒表達的菌株進行了醇產量測定。(B)JCL260中3-甲基-1-丁醇的產量。對攜帶ilvIH(IAA92)或alsS (IAA85)基因的菌株進行了醇產量測定。
[0069]圖48A-B是描述α -酮酸產量的圖表。方格柱形代表2_酮異戍酸；實心柱形代表2-酮基異己酸。(A)JCL260背景下α-酮酸的產量。對菌株的2_酮異戍酸(異丁醇)和2-酮基異己酸(3-甲基-1- 丁醇)的產量進行了測定。改變RBS僅用于IeuA基因產物(IPMS)。(B) L-亮氨酸合成敲除背景中α-酮酸的產量。‘ Λ ’表示缺失。
[0070]圖49Α-Β顯示了消除反饋抑制后3-甲基_1_ 丁醇的產量。(A)對含有WT IPMS(ΙΑΑ88)和IPMS (G462D) (ΙΑΑ89)的JCL260宿主的生長和醇產量進行了比較。(B)對JCL260 Δ iIνΕ Δ tyrB(IAA69)背景中含有WT IPMS (IAA90)菌株的生長和醇產量進行了定量檢測。
[0071]圖50是基因工程大腸桿菌內由蘇氨酸生成丙醇和丁醇的生物合成途徑示意圖。圖中描述了特定途徑的中斷；空心矩形框表示醇產物的前體。圖中還描述了非正常的正纈氨酸途徑，以及纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸和蛋氨酸(這些氨基酸分別以縮寫形式寫在灰色框中)的生物合成途徑。
[0072]圖51顯示了 thrA*BC的過度表達對BW WT中醇和主要代謝產物的影響，并顯示了 CRS-Bu0H12 (實心菱形)和CRS-Bu0H31 (空心菱形)中丙醇、丁醇、主要副產物、微生物生長及葡萄糖消耗的時間過程。CRS-Bu0H12和CRS-Bu0H31均為BW WT菌株。CRS_Bu0H31含有pSA62和pSA55I，CRS-BuOHI2還含有另外的質粒pCS49，此質粒攜帶的thrA*BC位于PLlacOl后。按照本發明所述的材料和方法培養細胞。
[0073]圖52A-B對各種敲除菌株的醇產量進行了比較。A.菌株被從左到右依次編號為CRS-Bu0H12、32、2、ll、23。所有菌株均包含pCS49、pSA62和pSA55I質粒。如本文所述，將細胞培養72小時。圖中所示為第72個小時時間點的數據。B.A圖中顯示的各菌株生長時間過程。
[0074]圖53對采用替代性抗反饋蘇氨酸脫水酶和2-異丙基蘋果酸合成酶生產的丙醇和丁醇的產量進行了比較。比較時采用BWAmetA、Δ tdh、Δ ilvB、Δ ilvl作為背景菌株。各菌株被編號為0?-8110!111、18、19、20，除圖中所示的質粒外，所有菌株還含有？5462和？54551質粒。質粒編號下方為表達特定的蘇氨酸脫水酶和2-異丙基蘋果酶的基因名稱。如本文所述，將細胞培養72小時。圖中所示為第72個小時時間點的數據。
[0075]圖54A-E顯示了 CRS_Bu0H23中丙醇、丁醇和代謝副產物的時間過程。A.正丙醇和正丁醇的產量。實心菱形代表丁醇，空心菱形代表丙醇。B.主要副產物醋酸的產量。C.次要副產物丙酮酸、乳酸和乙醇的產量。實心菱形代表丙酮酸，空心方塊代表乳酸，交叉符號代表乙醇。D.葡萄糖的消耗過程。E.CRS-Bu0H23在100小時內的生長過程。
[0076]每張圖里類似的參考符號代表類似的要素。`【具體實施方式】
[0077]除非文中另有明確說明，否則，本文及隨后所附的權利要求中使用的表示單數含義的“一種”、“和”及“此”等詞語也包含復數指代。因此，例如提到“一種多聚核苷酸”時，也包含多種這樣的多聚核苷酸；當提到“此微生物”時，也指一種或多種微生物等等。
[0078]除非另有說明，本文中使用的所有技術術語與科學術語均與本發明所屬【技術領域】的技術人員通常理解的意思相同。雖然與本文所述的方法和材料相似或相當的方法和材料也能用于本發明公開的方法和成分中，但是本文描述的是代表性方法、裝置和材料。
[0079]提供的上述及全文中的任何公開內容僅為在提交此申請之日公開的內容。本文不得被視為發明人無權憑借先有公開內容而先于這樣的公開。
[0080]丁醇是疏水性化合物，其揮發性比乙醇差。正丁醇的能量密度與汽油接近。濃度為85%的丁醇可用于汽車，并且不需對發動機做任何改動(與乙醇不同)，它產生的動力比乙醇大，幾乎與汽油相同。丁醇也被作為溶劑用于化學和紡織工藝、有機合成以及用作化學中間體。丁醇還被作為液壓制動液中的一種成分使用，以及作為基礎成分用于香水中。
[0081]與乙醇相比，異丁醇具有優點且和正丁醇相同。此外，由于異丁醇帶有分支碳鏈，所以其辛烷值比正丁醇高，正丁醇作為發酵產物生產，并用作發動機燃料。雖然異丁醇已被用作發動機添加劑，但是還不能以高產率由可再生資源生產出異丁醇。異丁醇尚未被考慮作為汽油的替代品。[0082]能夠生產正丁醇的天然菌種如丙酮丁醇梭菌，還能生產出作為發酵產物的諸如丙酮、乙醇及丁酸等副產物。但是，這些微生物較難操控，其基因操控工具不如大腸桿菌等易操控的宿主的基因操控工具有效，而且對它們的生理學和代謝調節的了解也較少，因此阻礙了其高效生產的步伐。此外，雖然已在微生物代謝副產物中發現少量的其他高級醇，例如異丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇和2-苯基乙醇，但是尚未發現可以由葡萄糖生成并能夠達到工業利用量的高級醇的天然菌種。
[0083]通過各種酵母菌(包括釀酒酵母)生產異丁醇和其他雜醇，這對酒精飲料制造商頗具吸引力。對酒精飲料而言，雜醇通常屬于不期望的異常成分。用野生型酵母菌生產異丁醇已經在各種培養基上證實過，這些培養基包括制酒過程中的葡萄汁(Romano等，Metabolic diversity of Saccharomyces cerevisiae strains from spontaneouslyfermented grape musts (來自自然發酵葡萄汁的各種釀酒酵母菌株的代謝多樣性)，19:311-315，2003)到基本補充培養基(Oliviera 等，(2005) World Journal ofMicrobiology and Biotechnology21:1569-1576),前者可產生 12_219mg/L異丁醇，后者可產生 16-34mg/L 異丁醇。Dickinson 等人的研究(J Biol Chem.272 (43): 26871-8，1997)已確定支鏈氨基酸(例如，纈氨酸和亮氨酸)轉化為異丁醇的反應途徑中的酶反應步驟。
[0084]本發明提供了代謝工程微生物，其包含利用合適底物生產高級醇(包括異丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇和2-苯基乙醇)的生物化學途徑。本發明的一種代謝工程微生物包含該生物體基因組內的或該生物體基因組以外的一種或多種重組多聚核苷酸。此微生物能夠包含在野生型微生物內發現的基因的減少、破壞或敲除，和/或導入外源多聚核苷酸。
[0085]本發明還包括利用生物體的天然氨基酸途徑的代謝工程生物合成途徑。利用天然氨基酸途徑生產生物燃料有多種好處。它不僅避免了表達一大組的外源基因的困難，還將積累有毒中間產物的可能性降到最低。與在多種梭狀芽孢桿菌(Clostridium)中發現的丁醇產生途徑相反，用于生物燃料生產的經改造氨基酸生物合成路徑避免了涉及氧氣敏感酶和對輔酶A依賴的中間產物。本發明提供了一種宿主友好型生物燃料生產系統，其利用微生物氨基酸生物合成途徑中的自然代謝產物生產生物燃料。
[0086]一方面，本發明提供了一種重組微生物，與其親本微生物相比,此重組微生物包含至少一種目標酶的表達增加，或編碼在其親本微生物中未發現的酶。另一方面，此微生物包含至少一種基因的減少、破壞或敲除，此基因編碼的酶與生產期望的高級醇產物所需的代謝產物有競爭作用。重組微生物產生至少一種與異丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、
3-甲基-1- 丁醇或2-苯基乙醇的生物合成途徑相關的代謝產物。一般情況下，重組微生物包含至少一種重組代謝途徑，此途徑包含一種目標酶，并且還可包含競爭性生物合成途徑中一種酶的活性或表達降低。此途徑的作用是修飾異丁醇、正丁醇、正丙醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇生產過程中的底物或代謝中間產物。目標酶通過源自合適的生物來源的多聚核苷酸進行編碼和表達。在某些實施方案中，此多聚核苷酸包含源自一種細菌或酵母的一種基因，其經重組改造引入本發明的微生物中。
[0087]正如本文中所使 用的，“代謝工程”或“代謝改造”這一術語涉及生物合成基因、與操縱子有關的基因以及此類多聚核苷酸的調控元件的合理途徑改造與組裝，其目的是在一種微生物里產生期望的代謝產物，例如2-酮酸或高級醇。“代謝工程”還包含利用基因工程和合適的培養基條件(包括與導向所需路徑的中間產物相競爭的一種競爭性代謝途徑的減少、破壞或敲除)對轉錄、翻譯、蛋白質穩定性和蛋白質功能進行調節和優化，以優化代謝通量。一種生物合成基因可能與宿主微生物異源，可利用宿主異源的基因，或通過致突變作用、重組進行修飾，并且/或與存在于內源性宿主細胞的異源表達控制序列有關。一方面，如果此多聚核苷酸對宿主生物體是異源基因，則能對此多聚核苷酸進行密碼子優化。
[0088]術語“生物合成途徑”，也稱“代謝途徑”，指將一種化合物轉化(改變)為另一種化合物的一組合成代謝或分解代謝生化反應。如果基因產物平行或連續地作用于相同的底物，產生相同的產物或作用于或產生一種在該相同底物與代謝終產物之間的代謝中間物(例如代謝產物)，則這些基因產物屬于相同的“代謝途徑”。
[0089]例如，通過L-亮氨酸固有的生物合成途徑合成亮氨酸，此途徑偏離L-纈氨酸生物合成系統的中間產物(2-酮異戊酸)。在大腸桿菌中，L-纈氨酸的生物合成和L-亮氨酸固有的生物合成是通過一組分別由ilvGMEDA操縱子和IeuAB⑶操縱子編碼的酶進行。
[0090]IeuABCD操縱子包括leuA、leuB、IeuC和IeuD基因。其中，leu A編碼α -異丙基蘋果酸合成酶，IeuB編碼β -異丙基蘋果酸脫氫酶，IeuC和IeuD編碼α -異丙基蘋果酸異構酶。其中，α-異丙基蘋果酸合成酶催化由α-酮異戊酸生成α-異丙基蘋果酸的合成反應，α-異丙基蘋果酸異構酶催化由α-異丙基蘋果酸生成β_異丙基蘋果酸的異構化反應，β_異丙基蘋果酸脫氫酶催化由β_異丙基蘋果酸生成α-酮基異己酸的脫氫反應，α-酮基異己酸是L-亮氨酸生物合成的最終中間產物。大腸桿菌具有四種轉氨酶，即由aspC基因編碼的轉氨酶A (天冬氨酸-谷氨酸轉氨酶)、由iIvGMEDA操縱子含有的ilvE基因編碼的轉氨酶B (BCAA轉氨酶)、由avtA基因編碼的轉氨酶C (丙氨酸-纈氨酸轉氨酶)和由tyrB基因編碼的轉氨酶D (酪氨酸轉氨酶)。這些酶參與各種胺化反應。其中，轉氨酶B和轉氨酶D催化上述由α-酮基異己酸生成L-亮氨酸的胺化反應。轉氨酶C和轉氨酶D催化L-纈氨酸生物合成途徑的最后一步反應，這一步是L-纈氨酸生物合成和L-亮氨酸生物合成的共有反應。
`[0091]另外，IeuAB⑶操縱子的表達也受到L-亮氨酸的抑制。編碼乙酰羥酸合成酶I的iIvBN基因的表達受到L-纈氨酸和L-亮氨酸的協同抑制，編碼乙酰羥酸合成酶II的iIvGM基因的表達受到L-異亮氨酸、L-纈氨酸和L-亮氨酸的協同抑制，編碼乙酰羥酸合成酶III的iIvIH基因的表達受到L-亮氨酸的抑制。
[0092]術語“底物”或“合適的底物”指在酶的作用下轉化為或要轉化為另一種化合物的物質或化合物。此術語不僅包含一種化合物，也包含化合物組合，例如溶液、混合物或至少包含一種底物或其衍生物的其他物質。并且，術語“底物”不僅包括適合作為起始物質的提供碳源的化合物，例如源自任何生物質的糖類，還包括本文所述的用于與代謝工程微生物相關途徑的中間代謝產物和最終代謝產物，“源自生物質的糖類”包括但不限于例如葡萄糖、蔗糖、甘露糖、木糖和阿拉伯糖的分子。術語“源自生物質的糖類”包括通常被微生物利用的合適的碳底物，諸如6碳糖，包括但不限于葡萄糖、乳糖、山梨糖、果糖、艾杜糖、半乳糖和甘露糖，所有糖的構型均為D型或L型，或6碳糖組合如葡萄糖和果糖和/或6碳糖酸類，包括但不限于2-酮基-L-古洛糖酸、艾杜糖酸(IA)、葡萄糖酸(GA)、6-磷酸葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸(2KDG)、5-酮基-D葡萄糖酸、2-酮基葡萄糖酸磷酸、2，5- 二酮基-L-古洛糖酸、2，3-L- 二酮基古洛糖酸、脫氫抗壞血酸、異抗壞血酸(EA)和D-甘露糖酸。[0093]術語“醇類”包括正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或
2-苯基乙醇。術語“1-丁醇”或“正丁醇” 一般指末端碳原子帶有醇官能團的直鏈異構體。內部碳原子帶有醇官能團的直鏈異構體是仲丁醇或2- 丁醇。末端碳原子帶有醇官能團的支鏈異構體是異丁醇，內部碳原子帶有醇官能團的支鏈異構體是叔丁醇。
[0094]本文提供的重組微生物能夠表達多種目標酶，這些酶與由合適碳底物生成正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-1- 丁醇、3-甲基-1- 丁醇或2-苯基乙醇的合成途徑相關。
[0095]因此，通過將基因物質引入選擇的某個宿主或親本微生物，從而產生經代謝“改造”或“修飾”的微生物，以修改或改變此微生物的細胞生理學或生物化學特性。通過引入基因物質，親本微生物獲得了新性狀，例如，能夠產生新的或更多數量的胞內代謝產物。在一示例實施方案中，將基因物質引入親本微生物中導致其獲得新的能力或經改進的能力，能夠生產一種醇，例如正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇。引入親本微生物的基因物質包括基因或部分基因，其編碼一種或多種與醇類生產的生物合成途徑相關的酶，并且還包含參與這些基因的表達和/或表達調控的其他要素，例如啟動子序列。
[0096]除了將基因物質引入宿主或親本微生物外，在可選的方法中，一種經改造或修飾的微生物還能包括基因或多聚核苷酸的破壞、缺失或敲除，以改變微生物的細胞生理學和生物化學特性。通過基因或多聚核苷酸的減少、破壞或敲除，微生物獲得了新的或經改進的性狀(例如能夠產生一種新的或更多數量的胞內代謝產物，改進所需途徑的代謝通量，并且/或降低不需要的副產物的產量)。
[0097]本發明證實了在具有以下酶活性的多肽存在時編碼具有酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的多肽的一種或多種異源多聚核苷酸的表達或過度表達:α-異丙基蘋果酸合成酶、β -異丙基蘋果酸脫氫酶、α -異丙基蘋果酸異構酶、蘇氨酸脫水酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶活性以及蘇氨酸合成酶。
[0098]例如,本發明證實了通過異源kivd和adh2 ;大腸桿菌的ilvA、leuA、leuB、leuC、IeuD(或 Leu 操縱子，例如 IeuABO));以及 thrA、thrB、thrC 或 Thr 操縱子(例如 thrABC, thrA可能是抗反饋抑制多肽，例如thrA*)的過表達可以生產出正丁醇和正丙醇。利用2-酮戊酸生產正丁醇涉及到中間產物2-酮基丁酸和非自然的正纈氨酸生物合成途徑。由于Kivd與兩種2-酮酸的親和力相近，且2-酮基丁酸是LeuA的第二底物，因此，正丙醇與正丁醇一同被生產出來，且數量相近。
[0099]本文提供的微生物經修飾能夠大量產生親本微生物中不能產生的代謝產物。“代謝產物”指微生物產生的任何物質或某代謝過程所需的或參與此過程的物質。一種代謝產物可以是作為起始物質的一種有機物(例如，葡萄糖或丙酮酸)；代謝過程中的一種中間產物(例如，2-酮酸)；或一種最終產物(例如，正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1- 丁醇或2-苯基乙醇)。代謝產物可用來構建更復雜的分子，或被分解成更簡單的分子。中間代謝產物可由其他代謝產物合成，可用來構建更復雜的物質，或被分解成更簡單的化合物，通常伴隨著化學能的釋放。
[0100]代表性代謝產物包括葡萄糖、丙酮酸、正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基1-丁醇、
3-甲基1-丁醇或2-苯基乙醇，以及2-酮酸。如圖1A所示，代表性的2-酮酸中間產物包括2-酮基丁酸、2-酮異戊酸、2-酮基戊酸、2-酮基3-甲基戊酸、2-酮基4-甲基-戊酸、和苯丙酮酸。圖1A所示的代表性2-酮酸可被用作正丙醇、異丁醇、正丁醇、2-甲基-1-丁醇、
3-甲基-1-丁醇或2-苯基乙醇生產過程中的代謝中間產物。例如，如圖1B所示，一種重組微生物經代謝改造，可以提供表達水平增加的如由Leu操縱子(例如LeuAB⑶)編碼的2-異丙基蘋果酸合成酶、β -異丙基蘋果酸脫氫酶和異丙基蘋果酸異構酶，其催化2-酮基丁酸生成2-酮基戊酸。2-酮戊酸代謝物可用于生產正丁醇，此過程由代謝修飾微生物產生的其他酶產生。此外，可通過重組微生物由2-酮丁酸和2-酮基-3-甲基戊酸生產1-丙醇和2-甲基-1- 丁醇，此微生物經過代謝改造，可表達或過度表達乙酰羥酸合成酶、α -酮酸脫羧酶和醇脫氫酶，這些酶由例如ilvIHDC、kdc和adh基因編碼。此外，代謝產物2-酮酸異戊酸可由經過代謝改造的重組微生物生成，此微生物能夠表達或過度表達由例如ilvIHCD基因編碼的乙酰羥酸合成酶。此代謝產物可繼續用于異丁醇或3-甲基-1-丁醇的生產。代謝產物丙酮酸和苯丙酮酸可用于由經過代謝改造的重組微生物生產2-苯基乙醇，此微生物能夠表達或過度表達α -酮酸脫羧酶和醇脫氫酶，這些酶由例如kdc和adh基因編碼。其他代謝產物和基因見圖1B。
[0101]此外，本文提供的是生產異丁醇的重組微生物，在某些方面，可能包含目標酶的增加表達，例如乙酰羥酸合成酶(例如ilvIH操縱子)、乙酰羥酸還原異構酶(例如ilvC)、二羥酸脫水酶(例如ilvD)、2-酮酸脫羧酶(例如roC6、AR010、THI3、kivd或pdc)及醇脫氫酶(例如ADH2)。此微生物還可含有乙醇脫氫酶(例如，adhE)、Idh (例如ldhA)、frd (例如frdB、frdC或frdBC)、fnr、leuA、ilvE、poxB、ilvA、pflB、pta基因或它們的任何組合的表達缺失或受抑制，以增加丙酮酸的可利用性或減少會爭奪所需的生物合成途徑里的代謝物的酶。在某些方面，此重組微生物可以含有乙酰乳酸合成酶(例如alsS)、乙酰羥酸還原異構酶(例如ilvC)、二羥酸脫水酶(例如ilvD)、2-酮酸脫羧酶(例如roC6、AR010、TH13、kivd或pdc)，以及醇脫氫酶(例如ADH2)的增加表達。關于醇脫氫酶方面，雖然乙醇脫氫酶屬于醇脫氫酶，但是在此生物合成途徑中，乙醇的合成是不需要的副反應。因此，當提到微生物里醇脫氫酶活性或表達增強時，明確不包括乙醇脫氫酶活性。
[0102]本發明還提供產生正丁醇的重組微生物，可包括目標酶的增加表達，例如2-異丙基蘋果酸合成酶(例如leuA)、β -異`丙基蘋果酸脫氫酶(例如leuB)、異丙基蘋果酸異構酶(例如IeuCUeuD或Ieu⑶操縱子)、絲氨酸脫水酶(例如ilvA)。與親本微生物相比，此微生物還可以含有2-酮異戊酸、2-酮基-3-甲基-戊酸、2-酮基-4-甲基戊酸或他們的任何組合的含量減少。此外，與親本微生物相比，此微生物可含有二羥酸脫水酶(例如ilvD基因)表達破壞、缺失或敲除。產生正丁醇的重組微生物還可以含有磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶、天冬氨酸轉氨酶、高絲氨酸脫氫酶、天冬氨酸-半醛脫氫酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶、L-絲氨酸脫水酶和/或蘇氨酸脫水酶的表達或活性增加，這些酶分別由源自ppc、pyc、aspC、thrA、asd、thrB、thrC、sdaAB、tdcB基因或其同源基因的核酸序列編碼。
[0103]本發明還提供產生正丙醇的重組微生物，可包括目標酶的增加表達，例如α-異丙基蘋果酸合成酶(例如cimA)、β -異丙基蘋果酸脫氫酶(例如leuB)、異丙基蘋果酸異構酶(例如Ieu⑶操縱子)和絲氨酸脫水酶。
[0104]本發明還提供產生2-甲基-1-丁醇的重組微生物，可包含目標酶的增加表達，例如蘇氨酸脫水酶(例如ilvA或tdcB)、乙酰羥酸合成酶(例如ilvIH操縱子)、乙酰羥酸還原異構酶(例如ilvC)、二羥酸脫水酶(例如ilvD)，2-酮酸脫羧酶(例如PDC6、AR010、THI3,kivd和/或pdc)及醇脫氫酶(例如ADH2)。
[0105]本發明還提供產生3-甲基-1- 丁醇的重組微生物，可以含有目標酶的增加表達，例如乙酰乳酸合成酶(例如alsS)、乙酰羥酸合成酶(例如ilvIH)、乙酰乳酸合成酶(例如ilvMG)或(例如ilvNB)、乙酰輕酸還原異構酶(例如ilvC), 二輕酸脫水酶(例如ilvD), 2-異丙基蘋果酸酶合成酶(leuA)、異丙基蘋果酸異構酶(例如leuC、D或Ieu⑶操縱子)、β-異丙基蘋果酸脫氫酶(例如leuB)、2-酮酸脫羧酶(例如kivd、roC6或THI3)及醇脫氫酶(例如ADH2)。
[0106]本發明還提供產生苯基乙醇的重組微生物，可以含有目標酶的增加表達，例如分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶(例如pheA)、分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶(例如tyrA)、2-酮酸脫羧酶(例如kivd、PDC6、或THI3)和醇脫氫酶(例如ADH2)。
[0107]如前所述，本發明描述的目標酶一般都會生成代謝產物。例如，2-異丙基蘋果酸合成酶(leuA)、β -異丙基蘋果酸脫氫酶(IeuB)和異丙基蘋果酸異構酶(leuC、IeuD或IeuCD操縱子)可由含有2-酮基丁酸的底物生成2-酮基戊酸。此外，本文所述的目標酶都由多聚核苷酸編碼。例如，蘇氨酸脫水酶由源自ilvA基因的多聚核苷酸編碼。乙酰羥酸合成酶由源自ilvIH操縱子的多聚核苷酸編碼。乙酰羥酸還原異構酶由源自ilvC基因的多聚核苷酸編碼。二羥酸脫水酶由源自ilvD基因的多聚核苷酸編碼。2-酮酸脫羧酶由源自roC6、AR010、THI3、kivd和或pdc基因的多聚核苷酸編碼。醇脫氫酶由源自ADH2基因的多聚核苷酸編碼。其他酶和代表性基因詳見本文。各種多肽與多聚核苷酸的同源體可以來自提供由合適多聚核苷酸編碼的合適酶的任何生物來源。例如，可以通過參考各種數據庫來確定同源體。
[0108]本發明確定了對本發明的方法、組成成分和生物體有用的特定基因；但是，應當認識到，沒必要完全識別這些基因。例如，為了改變活性，可以對含有編碼某多肽或酶的序列的某種基因或多聚核苷酸進行·改變或篩選。通常，此類改變包含保守突變和沉默突變。可以利用所屬領域中的方法對這類修飾或突變多聚核苷酸和多肽進行功能酶活性表達篩選。
[0109]由于此遺傳密碼固有的簡并性，其他編碼基本相同或功能等同的多肽的多聚核苷酸也可用于復制，并表達編碼此類酶的多聚核苷酸。
[0110]正如本發明所屬領域的技術人員所理解的，修飾編碼序列有利于增強在特定宿主中的表達。此遺傳密碼具有64個可能的密碼子是冗余的，但是大多數生物體通常只利用其中的部分密碼子。一個物種中最頻繁利用的密碼子稱為最佳密碼子，那些不經常被利用的稱為稀有或低利用率密碼子。密碼子的取代反應了宿主對偏愛密碼子的利用，此過程通常稱為“密碼子優化”或“物種密碼子偏愛控制”。
[0111]可以制備含有特定的原核宿主或真核宿主偏愛的密碼子的優化編碼序列(見Murray等，(1989)《核酸研究》(Nucl.Acids Res.) 17:477-508)，例如，以增加翻譯率或生成具有所需的特性的重組RNA轉錄產物，例如與非優化序列產生的轉錄產物相比此轉錄產物具有更長的半衰期。也可根據宿主偏好修飾翻譯終止密碼子。例如，釀酒酵母和哺乳動物的典型終止密碼子分別為UAA和UGA0單子葉植物的典型終止密碼子是UGA，昆蟲和大腸桿菌共同利用的終止密碼子是UAA(Dalphin等，(1996)《核酸研究》(Nucl.AcidsRes.)24:216-218)。第6，015，891號美國專利以及本文引用的文獻提供了用于植物中表達的優化核苷酸序列的方法。[0112]本發明所屬領域的技術人員公認的，由于遺傳密碼的簡并性，許多具有不同核苷酸序列的DNA化合物可用于編碼本發明中的某種酶。本文對編碼上述生物合成酶的天然DNA序列的引用僅為了說明本發明的一個實施方案，公開的內容包括對本發明提供的方法中利用的酶和多肽的氨基酸序列進行編碼的任何序列的DNA化合物。以類似的方式，通常可以允許多肽的氨基酸序列中發生一個或多個氨基酸的置換、缺失和插入，而不對其所需的活性造成損害或嚴重損害。本發明包含與本文所述的特定蛋白質具有不同氨基酸序列的多肽，這些經過修飾的多肽變體具有參照多肽的酶的合成代謝或催化代謝活性。此外，本文所示的DNA序列編碼的氨基酸序列僅用于說明本發明的實施方案。
[0113]此外，本文提供的方法和微生物包含可用于產生代謝物(例如，酮硫解酶、乙酰CoA,乙酰基轉移酶、羥丁酰Cok脫氫酶、巴豆酸酶、巴豆酰-Cok還原酶、丁酰-CoA-脫氫酶、醇脫氫酶(ADH))的酶的同源體。針對第一個家族或物種的原始的酶或基因而言的所用術語“同源體”指第二個家族或物種的不同酶或基因，這些不同酶或基因通過進行功能、結構或基因組分析確定，對應于第一個家族或物種的原始酶或基因。同源體往往具有相似的功能、結構或基因組。通過基因探針和PCR能夠易于克隆酶或基因的同源體的技術是已知的。通過功能分析或基因的基因組作圖可確認復制的同源體序列的身份。
[0114]如果編碼一個蛋白質的核酸序列與編碼第二個蛋白質的核酸序列相似，則該蛋白質與第二個蛋白質具有“同源性”或是“同源的”。或者，如果這兩種蛋白質具有“相似”的氨基酸序列，則這兩種蛋白質具有同源性(因此，術語“同源蛋白質”是指具有相似氨基酸序列的兩種蛋白質)。
[0115]如本文所使用的，當兩種蛋白質(或蛋白質區域)的氨基酸序列具有至少30%、40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的同一性時，它們就基本同源。為了確定兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的百分比同一性，將這兩種序列進行比對以達到最優的比較目的(例如，可在第一和第二氨基酸或核酸之一或兩者中插入空位以便于最優比對，并且通過比對能夠忽略非同源序列)。在一實施方案中，進行比較目的時比對用的參考序列長度`至少為該序列長度的30%，通常為40%以上，較典型的長度為50%以上，更加典型的長度為60%以上，最典型的長度至少為70%、80%、90%、100%。然后，比較相應位置的氨基酸殘基或核苷酸。如果第一個序列某位置的氨基酸殘基或核苷酸與第二個序列相應位置的相同，則這兩個分子在此位置上相同(如本文所使用的，氨基酸或核酸“相同”等同于氨基酸或核酸“同源”)。兩種序列間的百分比同一性是這兩種序列的相同位置數目的函數，同時要考慮空位數以及每段空位的長度，空位是為了便于最優比對兩種序列而插入的。例如，kivd基因包含來自其他生物體的編碼具有基本相似酶活性的酶的同源基因(例如pdc6、arolO、thI3、pdc、kdcA、pdcl、pdc5),以及與該參考基因的同一性至少為30、40、50、60、70、80、85、90、95、98、或99%并且它們編碼的酶與參考基因編碼的酶具有基本相似酶活性的基因。例如，乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)中的丙酮酸脫羧酶在氨基酸水平上與Kivd同一性為37% ;kivd和thI3在核酸水平上的同一性為32% ;粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中的醇脫氫酶與釀酒酵母中的ADH2在氨基酸序列水平上的同一性為52% ;釀酒酵母adh2與乳酸乳球菌adh的同一性為49% ;KIVD (乳酸乳球菌)與H)C6 (釀酒酵母)間的同一性為36% (相似殘基=322/562 (57%)，空位=24/562 (4%))；KIVD (乳酸乳球菌)和THI3 (釀酒酵母)間的同一性為32% (相似殘基=307/571 (53%)，空位=35/571 (6%) ) ；kivd (乳酸乳球菌)和AROlO (釀酒酵母)間的同一性為30% (相似殘基=296/598 (49%)，空位=65/598 (10%) ) ；AR010 (釀酒酵母)與PDC6 (釀酒酵母)間的同一性為34% (相似殘基=320/616 (51%)，空位=61/616 (9%)) ;AR010 (釀酒酵母)與THI3 (釀酒酵母)間的同一性為30% (相似殘基=304/599 (50%)，空位=48/599(8%) ) ；AR010 (釀酒酵母)與丙酮酸脫羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)間的同一性為30% (相似殘基=291/613 (47%)，空位=73/613(11%) ) ;PDC6 (釀酒酵母)與THI3 (釀酒酵母)間的同一性為50% (相似殘基=402/561 (71%)，空位=17/561 (3%) ) ；PDC6 (釀酒酵母)與丙酮酸脫羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)間的同一性為 38% (相似殘基=328/570 (57%)，空位=30/570 (5%) ) ；THI3 (釀酒酵母)與丙酮酸脫羧酶(丙酮丁醇梭菌ATCC824)間的同一性為35%(相似殘基=284/521 (54%)，空位=25/521 (4%))。本文所列的每個基因和多肽/酶的序列可通過互聯網上的數據庫輕易獲得(例如http: (//) eecol1.kaist.ac.kr/main.html)。此外,可利用本發明所屬領域的常用算法對氨基酸序列和核酸序列進行比對，以確定其同一性。
[0116]當“同源”一詞用于蛋白質和多肽時，即承認不相同的殘基位置通常其保守氨基酸置換不同。“保守氨基酸置換”指一個氨基酸殘基被另一個具有側鏈(R基團)的氨基酸殘基置換，此另一個氨基酸殘基具有相似的化學性質(例如電荷、疏水性)。一般情況下，保守氨基酸置換不會顯著改變蛋白質的功能特性。如果兩個或多個氨基酸序列由于保守置換互不相同，則可以要向上調整序列同一性或同源度，以修正置換的保守性。本發明所屬領域的技術人員很了解這種調整方法(見Pearson等，1994，以引用的方式并入本文)。
[0117]以下六組中，每組的氨基酸都可以相互進行保守置換。I)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E) ；3)天冬酰胺(N)、谷胺酰胺(Q) ；4)精氨酸(R)、賴氨酸(K)；
5)異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)、纈氨酸(V) ；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)。
[0118]多肽的序列同源也稱為序列百分比同一性，通常利用序列分析軟件對其進行測量。例如威斯康辛大學生物技術中心遺傳學計算機集團(Genetics Computer Group) (GCG)的序列分析軟件包(Sequence Analysis Software Package),該公司位于威斯康星州麥迪遜大學街910號，郵編53705。蛋白質分析軟件通過測定各種置換、缺失及其他修飾(包括保守氨基酸置換)的同源性配對相似序列。例如，GCG包含諸如“Gap (空位)”和“Bestf it (最佳配合)”之類的程序，他們能夠結合使用默認參數來確定緊密相關的多肽例如來自不同種類生物體的同源多肽間的序列同源度或序列同一性，或野生型蛋白質與其突變體之間的序列同源度或序列同一'I"生。見GCG6.1版。
[0119]計算機程序BLAST (Altschul, 1990 ；Gishl993 ；Madden, 1996 ；Altschull997 ；Zhang, 1997)特別是blastp或tblastn (Altschul, 1997)是一種典型算法，它可以將一個分子序列與包含大量源自不同生物體的序列的數據庫進行比較。BLASTp的典型參數是:期望值:10 (默認值)；過濾器:seg (默認值)；開放空位罰分:11 (默認值);擴展空位罰分:1(默認值)；最大比對:100 (默認值)；字長:11 (默認值)；描述量:100 (默認值)；矩陣罰分:BL0WSUM62。
[0120]在搜索包含來自大量不同生`物體序列的數據庫時，通常要比對氨基酸序列。可以利用本發明所屬領域內除blastp以外的算法分析氨基酸序列搜索數據庫。例如，可以利用FASTA, GCG6.1版中的一個程序，來比對多肽序列。FASTA提供查詢和搜索序列間最佳重疊區域的比對和序列百分比同一性(Pearson，1990，以引用的方式并入本文)。例如，可以利用FASTA及GCG6.1版中提供的默認參數(字長為2，以及PAM250得分矩陣)，確定氨基酸序列間的序列百分比同一性，此參數以引用的方式特此并入本文。
[0121]下表及公開內容提供了基因以及每種基因的同源基因的非限定性例子，這些基因的多聚核苷酸和多肽序列是本發明所屬領域的技術人員可以得到的。
表1:描述了生產各種高級醇的重組途徑(“+” =表達、表達或活性增強/ =表達或活性降低或敲除*)。·
【權利要求】
1.重組微生物，其包含具有2-酮酸脫羧酶活性的異源基因和/或和具有醇脫氫酶活性的異源基因，其中所述重組微生物以0.12-0.41g異丁醇/g葡萄糖和/或0.12-0.42g異丁醇/g丙酮酸的產率產生異丁醇。
2.權利要求1的重組微生物,其中所述微生物在112小時的培養后產生低于240mg/L的乙醇。
3.權利要求1或2的重組微生物，其中當在相似的條件下培養時，通過以0.12-0.41g異丁醇/g葡萄糖和/或0.12-0.42g異丁醇/g丙酮酸的產率產生異丁醇，所述微生物的醇生產狀況與具有ATCC專利保藏名稱PTA-8945 (SA237)的微生物的醇生產狀況基本相同。
4.權利要求1的重組微生物，其中異丁醇的產率為0.33-0.36g異丁醇/g葡萄糖和/或0.34-0.37g異丁醇/g丙酮酸。
5.權利要求1的重組微生物,其中異丁醇的產率為在16-64小時的培養后0.36-0.40g異丁醇/g葡萄糖和/或在16-64小時的培養后0.34-0.37g異丁醇/g丙酮酸。
6.權利要求4或5的重組微生物，其中每克葡萄糖的乙醇產率為低于0.0037g/g和/或其中每克丙酮酸的乙醇產率為低于0.0038g/g。
7.權利要求1的重組微生物,其中所述重組微生物包含對乙酰CoA至乙醇的轉化的降低或抑制。
8.權利要求1或7的重組微生物，其中所述重組微生物包含選自以下的一種或多種修飾: (a)乙醇脫氫酶的表達減少； (b)編碼乙醇脫氫酶的一種或多種基因的部分缺失；和 (C)編碼乙醇脫氫酶的一種或多種基因的敲除。
9.權利要求8的重組微生物，其中所述乙醇脫氫酶是AdhE，其同源體或變體。
10.權利要求1或7的重組微生物，其中所述重組微生物包含轉化選自以下反應的一種或多種酶的表達或增加的表達: (a)從丙酮酸轉化為乙酰乳酸 (b)從乙酰乳酸轉化為2，3-二羥基異戊酸 (C)從2，3-二羥基異戊酸轉化為α-酮異戊酸 (d)從α-酮異戊酸轉化為異丁醛 (e)從異丁醛轉化為異丁醇。
11.權利要求10的重組微生物，其中所述酶是2-酮酸脫羧酶，其選自Pdc、Pdcl、Pdc5、Pdc6、Aro 10, Kivd、KdcA、前述各種酶的同源體或突變體，以及與前述任何一種酶具有至少60%同一性且具有2-酮酸脫羧酶活性的多肽。
12.權利要求11的重組微生物，其中所述2-酮酸脫羧酶由kivD基因或其同源基因編碼。
13.權利要求11的重組微生物，其中使異丁醛轉化為異丁醇的所述酶是醇脫氫酶。
14.權利要求13的重組微生物，其中所述醇脫氫酶選自Sfal、Adh2、Adhl、Adh3、Adh4、Adh5、Adh6、前述任一酶的同源體或變體以及與前述任何一種酶具有至少60%同一性且具有醇脫氫酶活性的多肽。
15.權利要求1的重組微生物，其中，所述重組微生物包含基因的一處或多處缺失或敲除，所述基因編碼酶，所述酶催化:丙酮酸轉化為乙醇；乙酰-CoA轉化為乙醇；丙酮酸轉化為乳酸；延胡索酸轉化為琥珀酸；乙酰-Cok和磷酸轉化為CoA和乙酰磷酸；乙酰-Cok和甲酸轉化為CoA和丙酮酸；乙酰-CoA的乙酰基和3-甲基-2-氧代丁酸(2-氧代異戊酸)的縮合；2_異丙基蘋果酸和3-異丙基蘋果酸之間的異構化；a-酮酸轉化為支鏈氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；丙酮酸轉化為乙酰-CoA ;支鏈氨基酸的形成；從蘇氨酸生成a-酮丁酸；蛋氨酸生物合成的第一步反應；以及蘇氨酸的分解代謝。
16.權利要求1或15的重組微生物，其中所述重組微生物包含選自下組基因的一處或多處基因缺失:adhE、ldhA、pflB、frdBC、fnr、pta、leuA、leuB、leuC、leuD、ilvE、tyrB>poxB、ilvB、ilvl、ilvA、metA、tdh和前述任一基因的同源基因及自然產生的變體。
17.權利要求1或15的重組微生物，其中所述重組微生物包含選自下組基因的缺失或敲除:adhE、ldhA、frdB、frdC、fnr、pta、pflB、leuA、ilvE、poxB、ilvA 及其任何組合，并進一步包含kivD、ThrABC和adh2的表達或增加的表達。
18.重組微生物，與其親本微生物相比，包含以下酶的增加的表達或活性: a)乙酰羥酸合成酶； b)乙酰羥酸還原異構酶； c)二羥酸脫水酶； d)2-酮酸脫羧酶；和 e)醇脫氫酶； 并且其中所述 重組微生物包含至少一個編碼涉及丙酮酸轉化為乙醇的基因的敲除或破壞； 其中，所述重組微生物產生異丁醇。
19.重組微生物，與其親本微生物相比，包含以下酶的增加的表達或活性: a)乙酰乳酸合成酶； b)乙酰羥酸還原異構酶； c)二羥酸脫水酶； d)2-酮酸脫羧酶；和 e)醇脫氫酶； 并且其中所述重組微生物含有至少一個編碼選自以下酶的基因敲除或破壞:乙醇脫氫酶、乳酸脫氫酶、延胡索酸還原酶、磷酸乙酰基轉移酶、丙酮酸甲酸裂解酶、甲酸乙酰基轉移酶及其任何組合； 其中，所述重組微生物產生異丁醇。
20.產生異丁醇的方法，所述方法包含: a)提供權利要求1、2、7、10、13、18和19任一項的重組微生物； b)在存在合適的底物或代謝中間物并且在適于將所述底物轉化為異丁醇的條件下培養a)的微生物； c)基本純化所述異丁醇。
21.權利要求20的方法，其中所述底物或代謝中間物包括2-酮異戊酸。
22.產生將合適的底物或代謝中間物轉化為異丁醇的重組微生物的方法，所述方法包括用一種或多種編碼包括以下酶活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:乙酰羥酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性，并且其中所述重組微生物被工程改造以破壞乙醇脫氫酶活性和/或乳酸脫氫酶。
23.權利要求22的方法，其中通過以0.12-0.41g異丁醇/g葡萄糖和/或0.12-0.42g異丁醇/g丙酮酸的產率產生異丁醇，按照此方法生產的重組微生物包括在存在葡萄糖時產生的醇狀況與ATCC?專利保藏名稱PTA-8945(命名為SA237)產生的醇狀況基本相似。
24.權利要求1、18或19任一項的重組微生物，其中所述重組微生物衍生自選自以下的微生物:埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、乳桿菌屬、乳球菌屬、沙門氏桿菌屬、腸桿菌屬、腸球菌屬、藍細菌屬、歐文氏菌屬、泛菌屬、藻類、摩根菌屬、果膠桿菌屬、變形桿菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、克雷伯氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、酵母屬、德克酵母屬(dekkera)、克魯維酵母屬(kluyveromyces)和畢赤氏酵母屬。
25.權利要求24的重組微生物，其中所述埃希氏菌屬是大腸桿菌。
26.權利要求24的重組微生物，其中所述酵母屬是釀酒酵母。
27.產生選自下組的醇類的重組微生物: (a)正丙醇， (b)異丁醇， (c)正丁醇， (d)2-甲基1-丁醇 (e)3- 甲基1- 丁醇 (f)2-苯基乙醇 其中 a)醇類從包含2-酮酸的代謝物產生，并且其中所述2-酮酸通過2-酮酸脫羧酶和醇脫氫酶被轉化為所述醇；并且其中 b)所述重組微生物包含基因的一處或多處缺失或敲除，所述基因編碼酶，所述酶催化:丙酮酸轉化為乙醇；乙酰-CoA轉化為乙醇；丙酮酸轉化為乳酸；延胡索酸轉化為琥珀酸；乙酰-Cok和磷酸轉化為CoA和乙酰磷酸；乙酰-Cok和甲酸轉化為CoA和丙酮酸；乙酰-Cok的乙酰基和3-甲基-2-氧代丁酸(2-氧代異戊酸)的縮合；2_異丙基蘋果酸和3-異丙基蘋果酸之間的異構化；α-酮酸轉化為支鏈氨基酸，苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或亮氨酸的合成；丙酮酸轉化為乙酰-Cok ;支鏈氨基酸的形成；從蘇氨酸生成α -酮丁酸；蛋氨酸生物合成的第一步反應；以及蘇氨酸的分解代謝。
28.根據權利要求27的重組微生物，與親本微生物相比，包含以下酶的增加的表達或活性: a)2-異丙基蘋果酸合成酶； b)i3_異丙基蘋果酸脫氫酶； c)異丙基蘋果酸異構酶； d)蘇氨酸脫水酶； 其中，所述重組微生物產生正丁醇。
29.產生將合適的底物或代謝中間物轉化為正丁醇的重組微生物的方法，所述方法包括用一種或多種編碼包括以下酶活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:2_異丙基蘋果酸合成酶活性、β -異丙基蘋果酸脫氫酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性和蘇氨酸脫水酶活性。
30.權利要求29的方法。其中如此產生的所述重組微生物包含在存在葡萄糖時產生的與ATCC? f利保藏名稱PTA-8944(命名為CRS_BuOH23)的醇狀況基本相似的醇狀況。
31.根據權利要求27的重組微生物，與親本微生物相比，包含以下酶的增加的表達或活性: a)α-異丙基蘋果酸合成酶； b)i3_異丙基蘋果酸脫氫酶； c)異丙基蘋果酸異構酶；和 d)蘇氨酸脫水酶； 其中，所述重組微生物產生正丙醇。
32.產生將合適的底物或代謝中間物轉化為正丙醇的重組微生物的方法，所述方法包含用一種或多種編碼包含以下酶活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:α -異丙基蘋果酸合成酶活性、β -異丙基蘋果酸脫氫酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性和蘇氨酸脫水酶活性。
33.根據權利要求27的重組微生物，與親本微生物相比，包含以下酶的增加的表達或活性: a)蘇氨酸脫水酶； b)乙酰羥酸合成酶； c)乙酰羥酸還原異構酶； d)二羥酸脫水酶； e)2-酮酸脫羧酶； f)醇脫氫酶； 其中，所述重組微生物產生2-甲基-1-丁醇。
34.產生將合適的底物或代謝中間物轉化為2-甲基-1-丁醇的重組微生物的方法，所述方法包含用一種或多種編碼包含以下酶活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:蘇氨酸脫水酶活性、乙酰羥酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。
35.根據權利要求27的重組微生物，與親本微生物相比，包含以下酶的增加的表達或活性: a)乙酰羥酸合成酶或乙酰乳酸合成酶； b)乙酰羥酸還原異構酶； c)二羥酸脫水酶； d)2-異丙基蘋果酸合成酶； e)異丙基蘋果酸異構酶； f)i3-異丙基蘋果酸脫氫酶； g)2-酮酸脫羧酶；和 h)醇脫氫酶； 其中，所述重組微生物產生3-甲基-1-丁醇。
36.產生將合適的底物或代謝中間物轉化為3-甲基-1-丁醇的重組微生物的方法，所述方法包含用一種或多種編碼包含以下酶活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:乙酰羥酸合成酶活性或乙酰乳酸合成酶活性、乙酰羥酸還原異構酶活性、二羥酸脫水酶活性、2-異丙基蘋果酸合成酶活性、異丙基蘋果酸異構酶活性、β -異丙基蘋果酸脫氫酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。
37.根據權利要求27的重組微生物，與親本微生物相比，包含以下酶的增加的表達或活性: a)分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶； b)分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶； c)2-酮酸脫羧酶；和 d)醇脫氫酶； 其中，所述重組微生物產生苯基乙醇。
38.產生將合適的底物或代謝中間物轉化為苯基乙醇的重組微生物的方法，所述方法包含用一種或多種編碼包含以下酶活性的多肽的重組多聚核苷酸轉化微生物:分支酸變位酶P/預苯酸脫水酶活性、分支酸變位酶T/預苯酸脫氫酶活性、2-酮酸脫羧酶活性和醇脫氫酶活性。
39.命名為SA237并具有ATCC?專利保藏名稱PTA-8945的重組微生物。
40.命名為 CRS-BuOH23并具有ATCC?專利保藏名稱PTA-8944的重組微生物。
【文檔編號】C12R1/865GK103540559SQ201310303591
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2008年2月8日 優先權日:2007年2月9日
【發明者】詹姆士·C·里奧, 渥美正太, 凱文·M·史密斯, 羅·普·克萊爾·沈, 安東尼·F·卡恩, 邁克爾·R·康諾 申請人:加利福尼亞大學董事會