一種無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的方法
【專利摘要】本發明是一種在基因診斷【技術領域】，以基因芯片為平臺技術的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的方法。本發明所述的微陣列基因芯片包括片基及固定在片基上的探針，所述的探針如表1-2所示的核苷酸序列。本發明所述的診斷方法包括如下步驟：待測DNA制備，多重PCR擴增，芯片雜交，數據處理和圖像分析，芯片掃描并獲得結果。同時，本發明還包含所述微陣列芯片無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的試劑盒；本發明所述的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的診斷方法簡便；檢測具有高通量、特異性好、高靈敏度的特點，可以快速篩查各個位點是野生型還是突變型，并將先天性耳聾疾病的診斷提高到基因水平上；采用無創產前診斷技術，節約成本時間，減少病人痛苦。
【專利說明】一種無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因診斷【技術領域】，具體涉及一種以微陣列基因芯片技術為平臺技術的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的方法。
【背景技術】
[0002]聾病是影響人類健康和造成人類殘疾的常見原因，我國現有2000多萬聾啞人， 占殘疾人總數1/3，并以每年新生兒3萬的速度增長。耳聾發生的原因、是否具有遺傳性、生育或再次生育是否安全，是耳聾患者及耳聾家庭極為關心的問題。據各國統計，有 1/2000(0.05% ) 一 1/1000(0.1% )的兒童出生時為極重度耳聾；同時，一半以上的兒童期耳聾是由于遺傳因素造成的。另外在大量的遲發性聽力下降患者中，亦有許多患者由自身的基因缺陷致病，或由于基因缺陷和多態性造成對致聾環境因素易感性增加而致病。
[0003]在遺傳性耳聾中，有70%為 NSHI (nonsyndromie hearingim pairment 非綜合征型耳聾)，大約75%?85%的NSHI表現為常染色體隱性遺傳模式，15%?24%為常染色體顯性遺傳模式，其余1%?2%為X連鎖遺傳模式。隨著人類基因組計劃的完成以及對耳聾疾病致病機制的研究不斷深入，遺傳性耳聾的病因學研究有了很大進展，目前至少有60余個耳聾基因被克隆，這些發現提示我們遺傳性耳聾具有很高的遺傳異質性，遺傳性耳聾的基因診斷涉及到多個基因的檢測，從而加重了遺傳性耳聾分子診斷的難度。
[0004]大量的研究表明，GJB2、SLC26A4(PDS)和線粒體基因(mtDNA)的病理性突變導致了大部分的遺傳性耳聾，并被證明是中國聾啞人群三種最常見的致聾基因突變。利用基因診斷技術對這三個常見基因檢測，可在大約70 %的遺傳性耳聾患者發現致聾基因突變，這不僅可以耳聾患者明確病因，還使耳聾的遺傳咨詢與產前診斷成為可能。這不僅使耳聾患者明確病因，還為耳聾的遺傳咨詢提供了理論依據及科學手段，使先天性耳聾產前診斷結果更客觀準確。
[0005]目前，可用于先天性耳聾產前診斷的技術主要有聚合酶鏈式反應、熒光原位雜交及基因芯片等技術。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction,PCR)該技術是分子實驗室重要的診斷技術之一，在體外擴增DNA片段用于遺傳學分析，包括巢式PCR、多重PCR、 熒光PCR、熒光定量PCR等。主要用于由于基因缺失而引起的疾病的診斷和多態性分析，即在致病基因附近尋找幾個與其緊密連鎖的DNA多態性位點，通過連鎖分析進行診斷和攜帶者檢測。但是PCR技術受到擴增效率、等位基因脫扣、污染的可能的影響可能導致誤診， 并且PCR僅能檢測已知的異常。突光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)該技術是利用熒光素標記的探針與DNA片段特異性雜交，探針與特異DNA片段結合形成的 雜交分子可以在熒光顯微鏡熒光激發下顯示熒光信號，依據判定信號的有無及類型達到診斷染色體病的目的。此方法無需細胞培養，僅24小時即可得到結果，污染機率小、信號直觀、檢測時間短，應用較廣泛。熒光原位雜交的探針包含以下幾種:著絲粒探針 (combining centromere probe, CEP)、位點特異性探針(focus-specific probe, LSI)、端粒探針(telomere probe, Tel)、全染色體涂抹探針(whole chromosome probe, WCP)和跨斷裂點探針(span break-point probe)。應用不同類型的探針可以篩查先天性耳聾疾病基因攜帶者進行遺傳學診斷。
[0006]PCR及FISH技術即成為大家公認并相繼使用的方法。但是這兩種方法都存在本身的缺陷，PCR僅可檢測已知的異常。熒光原位雜交技術是利用熒光素標記的探針與染色體特異性雜交，依據顯微鏡觀察熒光信號判定結果正常與否，信號直觀、檢測時間短。但是由于檢驗的樣本來源極為有限，通常僅有1-2個卵裂球細胞。FISH技術僅可檢測少量染色體及基因。然而先天性耳聾疾病的發生涉及多條染色體的多個基因，FISH技術并不能滿足產前先天性耳聾篩查的需要。
[0007]基因芯片技術是指將特定寡核苷酸片段作為探針固定于支持物上，摻入標記物的目的DNA片段通過PCR等技術擴增后，然后按堿基配對原理進行雜交，再通過信號檢測系統對芯片進行掃描，并配用相關分析軟件對每一探針上的信號作出比較和檢測。目前該技術在疾病檢測領域已得到了廣泛的應用。通過檢測孕婦及其配偶常見遺傳性耳聾致病基因突變攜帶情況，可早期發現遺傳性耳聾生育風險，結合產前診斷有效降低遺傳性耳聾的發病率。相對PCR擴增測序等方法，遺傳性耳聾基因芯片檢測具有結果可信度高、通量大、速度快、可操作性強等優點，適用于遺傳性耳聾產前基因檢測。
[0008]傳統的先天性耳聾診斷方法需要對孕17-20周的孕婦進行羊水穿刺，對羊水細胞及羊水培養細胞進行相應耳聾基因全序列擴增測序，從而對夫婦雙方攜帶先天性耳聾致病基因進行檢測，并進行遺傳性耳聾生育風險評估。這大大的加大了檢測的時間，并給受檢測者帶來了精神和身體上的雙重痛苦，不適用于產前診斷。因此，尋找一種高靈敏度的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的方法是非常必要的。
【發明內容】
[0009]本發明的內容在于克服現有技術的不足，提供一種以基因芯片技術為平臺技術的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的方法。本發明診斷先天性耳聾遺傳病的診斷技術操作步驟簡便，具有高通量的特點，可以快速篩查先天性耳聾相關基因的變異，并將先天性耳聾疾病的診斷提高到基因水平上；檢測的特異性好，且具有高分辨率、高靈敏度、準確、快速的特點，采用無創產前診斷技術，節約成本時間，減少病人痛苦。能用于產前先天性遺傳病的診斷，在無創產前診斷領域具有很大的潛力。
·[0010]本發明的技術方案是通過如下的技術方案實現的。
[0011]第一方面，本發明涉及一種分布如表1-1所示的核苷酸序列的微陣列基因芯片， 包括微陣列芯片的片基及固定在片基上的檢測先天耳聾相關基因的探針。
[0012]優選地，所述的探針的序列如表1-1所示:
[0013]表1-1?探針序列
[0014]
【權利要求】
1.一種無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片，包括片基及固定在片基上的檢測先天性耳聾相關基因的探針。
2.權利要求1所述的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片，其上探針的序列如下所示:
3.根據權利要求1所述的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片，其特征是:所述片基為載玻片、硅片或膜。
4.根據權利要求1所述的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片，其特征是:所述片基的材質為高分子材料。
5.一種根據權利要求1所述的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片的制備方法，包括如下步驟:片基的酸堿預處理，醛基化處理，異硫氰酸化處理，芯片探針的設計，探針的點制，立即將玻片在80°C烘烤lOmin，制成微陣列玻片，存儲在帶有干燥劑的盒子里，室溫保存即得。
6.一種根據權利要求1所述的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片的使用方法，其特征在于包括如下步驟:待測DNA制備，多重PCR擴增，芯片雜交，數據處理和圖像分析，芯片掃描獲得結果。
7.根據權利要求5所述的無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的微陣列基因芯片的使用方法，其特征在于所述的PCR擴增中所用的引物對如下表所示:
8.一種用于無創產前診斷先天性耳聾遺傳病的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括權利要求I所述的微陣列基因芯片。
【文檔編號】C12Q1/68GK103436609SQ201310348724
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月13日 優先權日:2013年8月13日
【發明者】不公告發明人 申請人:康盈創新生物技術(北京)有限公司