一種連續制備他汀藥物中間體(r)-3-羥基戊二酸乙酯的方法
【專利摘要】本發明公開了一種連續制備他汀藥物中間體(R)-3-羥基戊二酸乙酯的方法，包括以下工藝步驟：第一步(S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯（(S)-CHBE）在含有重組鹵醇脫鹵酶（HHDH）的催化下生成(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，第二步(R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯在重組腈水解酶（NIT）的催化下生成(R)-3-羥基戊二酸乙酯，所述的兩個反應步驟均在反應罐中的水溶液中催化反應；本發明通過兩步耦聯生物催化反應，采用特定的鹵醇脫鹵酶和腈水解酶，連續催化制備他汀類藥物的關鍵中間體，兩步串聯的連續綠色催化反應，無需提出中間體即可進行下一步反應，可連續操作、設備利用率高、成本低、簡便易操作。
【專利說明】一種連續制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的 方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及有機藥物合成領域，具體涉及一種兩步生物催化耦聯制備他汀藥物中 間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方法。
【背景技術】
[0002] 他汀類藥物已是世界上銷量最大，療效穩定的降脂類藥物。其中最有代表性的是 阿托伐他汀（Atorvastatin)和瑞舒伐他汀（Rosuvastatin),前者是世界上首款銷售額突 破百億美金的藥物，而后者則是迄今為止降脂效果最好的他汀類藥物，又被成為"超級他 汀"。瑞舒伐他汀由阿斯利康公司開發（英文商品名Crestor)，于2002年11月首次在荷蘭 獲批，2003年8月通過美國FDA上市審批，2011年在全球銷售額66.2億美元。（R)-3-羥 基戊二酸乙酯是合成瑞舒伐他汀的重要手性前體。
【權利要求】
1. 一種連續制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方法，其特征在于，包括以 下工藝步驟：第一步（S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯（（S)-CHBE)在含有重組鹵醇脫鹵酶（HHDH) 的催化下生成（R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯，第二步（R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯在重 組腈水解酶（NIT)的催化下生成（R)-3-羥基戊二酸乙酯，所述的兩個反應步驟均在反應罐 中的7iC溶液中偶化皮應。
2. 根據權利要求1所述的一種連續制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方 法，其特征在于，所述的制備裝置包括反應罐1和反應罐2,反應罐中設有攪拌裝置，反應罐 1和反應罐2通過帶有流量調節閥的管路相連接，反應罐1上設有底物添加管路，pH控制管 路和重組鹵醇脫鹵酶添加管路，反應罐2上設有重組腈水解酶添加管路和產物出口管。
3. 根據權利要求1和2所述的一種連續制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯 的方法，其特征在于，所述的制備方法為： 1) 以（S)-4-氯-3羥基丁酸乙酯為底物加入含氰化鈉水溶液的的反應罐1中，接著加 入重組鹵醇脫鹵酶進行催化反應；重組鹵醇脫鹵酶的用量為底物質量的2%?15% (w/w)， 氰化鈉的用量為底物質量的5%?20% (w/w);所述反應在pH為6. O?8. O的水相中進行， 反應體系的溫度為40?55°C ;當通過氣相色譜法測得混合液體中的底物轉化率大于95% 時,開始通過添加管路流加底物（S)-CHBE和鹵醇脫鹵酶液，同時打開兩個反應罐間的流量 調節閥，保持反應罐1中的反應體積不變； 2) 在反應罐2中起始加入腈水解酶緩沖液到最低攪拌葉處，調節反應溫度至25? 30°C，當從反應罐1中開始流出含中間體（R)-4-氰基-3-羥基丁酸乙酯的反應液時，同時 以反應罐2中加入腈水解酶粗酶液；腈水解酶粗酶液的用量為底物質量的20%?60% ;液 收集反應罐2產物出口管流出的反應液，調節反應液pH至2. 0,硅藻土過濾除酶，等體積乙 酸乙酯萃取水相3次，合并有機相，無水硫酸鈉除水，旋蒸，即得產品（R)-3-羥基戊二酸已 酯。
4. 根據權利要求2和3所述的一種連續制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯 的方法，其特征在于，所述從反應罐1流向反應罐2的速率為反應體系流加速率，所述反應 罐1中底物流加速率、鹵醇脫鹵酶液、氰化鈉溶液流加速率三者之和等于反應體系流加速 率。
5. 根據權利要求3所述的一種連續制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方 法，其特征在于，所述反應罐1中的氰化鈉溶液通過磷酸調節反應體系的pH值；反應罐1中 優選的pH為6. 8?7. 2,反應溫度為48?50°C。
6. 根據權利要求3和4所述的一種連續制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯 的方法，其特征在于，反應罐1中底物的流加速率為反應體系流加速率的1%?5%，鹵醇脫鹵 酶液的流加速率為反應體系流加速率的5%?25% ;反應罐2中腈水解酶粗酶液的流加速率 為反應體系流加速率的〇. 5%?2%。
7. 根據權利要求3所述的一種連續制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的方 法，其特征在于，所述的鹵醇脫鹵酶液按粗酶液：去離子水=1 :60的比例配制。
8.根據權利要求3和所述的一種連續制備他汀藥物中間體（R)-3-羥基戊二酸乙酯的 方法，其特征在于，所述的含有重組鹵醇脫鹵酶HHDH和腈水解酶NIT的制備方法為：將含有 重組鹵醇脫鹵酶HHDH和腈水解酶NIT基因的重組大腸桿菌單菌落分別接種到含卡那霉素 抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振蕩培養4?8小時，將培養得 到的菌液接種到含卡那霉素抗性的液體LB培養基中，于30?38°C下，搖床180-220rpm振 蕩培養，培養至OD 6tltl值達到0. 8?1. 2時，加入誘導劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG) 至終濃度ImM，于22?32°C下繼續培養16?20小時，4°C下離心收集菌體，加入生理鹽水 清洗菌體2遍，再次離心收集菌體，用2?8倍體積的三乙醇胺緩沖液（2mM，pH7. 0)懸浮細 胞；細胞懸浮液置于冰浴中超聲波破碎10-30分鐘；1：下15000g離心30min，取上清液，得 重組鹵醇脫鹵酶HHDH和腈水解酶NIT的粗酶液。
【文檔編號】C12P7/62GK104372040SQ201310348620
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年8月12日 優先權日:2013年8月12日
【發明者】陳令偉 申請人:南京朗恩生物科技有限公司