生成微脈管網絡、內皮原始脈管、組織和人冠狀動脈替代品的方法
【專利摘要】本發明提供了生成微脈管網絡、內皮原始脈管、組織和人冠狀動脈替代品的方法。在體外由組織工程化的原始脈管（200，202）制造微血管網絡，所述組織工程化的原始脈管萌芽至細胞外基質蛋白的支撐基質中，例如凝膠。微血管系統集成在能夠進行可控的流體灌注的設備中。所述血管可以包括源自一種細胞型的細胞如內皮細胞，或源自兩種或三種細胞型的組合。根據本發明提供的模型可以適用于提供能夠應用于生物工程化的人工組織的供功能齊全的脈管體系。
【專利說明】生成微脈管網絡、內皮原始脈管、組織和人冠狀動脈替代品的方法
[0001]相關申請
[0002]本申請是申請號為200780010627.3、申請日為2007年3月9日、發明名稱為“可
灌注的微脈管體系的制造方法”的中國發明專利申請的分案申請。
[0003]關于聯邦政府贊助研究的聲明
[0004]本發明具有政府的支持，是在美國國立衛生研究院國家心臟、肺和血液研究所授予的基金號為1R21HL081152-01的基金下完成的。美國政府在本發明中具有一定的權利。
【技術領域】
[0005]本發明關于一種用于研究生理的和病理的脈管生長以及響應脈管生成因子或抗脈管生成因子的脈管生長的方法。
【背景技術】
[0006]在正常的脈管的生長過程中(例如，月經周期，胎盤形成，發胖，傷口愈合，炎癥)，新血管的生成是規律的并最終停止。值得關注的是，脈管生長的反常是病理學上的一個關鍵因素。例如，腫瘤的生長、糖尿病性視網膜病變、關節炎、和牛皮癬涉及直接促成病理狀態的脈管的過度增殖。相反，作為老年個體的特征，脈管生長的削弱危害了傷口的愈合以及由損傷或疾病致使的局部缺血組織的脈管再生。因此，對指導組裝新血管的機理以及啟動和終止血管生長的過程的理解，是控制血管疾病的策略的發展的核心。
[0007]在新血管的生長過程中(血管生成)，萌芽(sprout)源自血管內皮細胞，該血管內皮細胞排列成毛細血管和后毛細血管的內腔(Iument)-血管系統的最小分枝。血管生成是一個復雜的、多步驟的過程。盡管公開了數以千計的關于血管生成的研究，但是，對介導和控制血管生成以及形態發生的細胞機理了解甚少。
[0008]由于大部分組織的不透明性，很難在體內實時地觀察血管生成萌芽態的具體情況。很難在三維空間重建組織切片，且無法與血管生長的動態性質相聯系。此外，很難在組織切片中發現接近血管生成萌芽的尖端的區域(控制血管浸潤(vascular invasion)和形態發生的關鍵區域)。為了克服傳統組織學的局限性，開發出了各種體內的和體外的血管生成模型。
[0009]體內的血管生成模型:為了克服活體組織的不透明性，研究者通過活體動物體內的“窗戶”或專門的觀察腔來觀察血管生成，所述動物體內的“窗戶”包括兩棲類幼蟲的天然透明的尾巴(Clark and Clarkl939),所述專門的觀察腔或者植入在兔子耳朵、老鼠的皮膚(Algire, Chalkley et al, 1945)和倉鼠頰袋(Greenblatt and Shubi 1968)中，或者所述專門的觀察腔發育自兔角膜囊袋(Gimbrone, Cotran et al.1974)或雞胚絨毛尿囊膜(Ausprunk, Knighton et al.1974)。從這些早期的、大量描述性的研究中，得出了對腫瘤誘導的血管化學趨向性的中心范例的驗證，以及能促進血管生長的可擴散的源自腫瘤的分子相關發現。體內血管生成的新實驗，檢測了血管向聚合海綿體或基本植入至嚙齒動物的凝膠基底膜蛋白栓塞中的向內生長(Passaniti Taylor et al.1992; Andrade, Machado etal.1997;Akhtar, Dickerson et al.2002;Koike, Vernon et al.2003)。由于下述原因，體內的方法難以實施:(I)血管生成反應中動物至動物的種內變化；(2)缺乏從一個物種到另一個物種的結果轉譯；(3)購買和飼養動物的花費高；(4)公眾不贊成以研究為目的使用動物；以及(5)在動物手術和可視化方面以及結果的評估上遇到的復雜性。
[0010]體外血管生成的二維(2D)模型:在努力了解血管生成的分子力學的過程中，將從較大的血管中分離出的內皮細胞置于平板培養皿中培養，直至它們形成匯合的(confluent)、類似路面的單細胞層，該單細胞層模擬了血管內皮細胞的內襯(lining)(Jaffe, Nachman et al.1973;Gimbronel976)。盡管作為響應大血管中內皮損傷的增生性模型是有用的(Gimbrone, Cotran et al.1974;Fishman, Ryan et al.1975;Madriand Stennl982;Madri and Prattl986;Jozaki, Marucha et al.1990;Rosen, Meromskyet al.1990)，但是，在模擬血管生成的過程中，在剛性基質上培養的內皮細胞的單層細胞并不典型地組織成毛細血管樣的管。在1980年，在成功地長期培養毛細管內皮細胞后(Folkman, Haudenschild et all979),據報道，培養牛或人類內皮細胞20-40天后，在匯合的單層細胞的頂部形成二維的細胞網絡，這個過程被稱為“體外血管生成”(Folkman，Haudenschild et all980)。出現了看起來像填充有纖維狀/無定形物質的“管”和“內腔”的內皮細胞網絡，被認為是內源合成的軸芯網絡，細胞在軸芯上形成。后續的研究報道了類似的二維網絡的形成，該二維網絡是由源自大血管的內皮細胞(Maciag，Kadish etal.1982;Madri 1982; Feder, Marasa et al.1983)和接種在具有延展性的基質膜蛋白的水
凝膠上的內皮細胞形成的(e.g.Matrigel? gel) (Kubota, Kleiman et al.1988)。
[0011]盡管脈管發展的二維模型仍沿用至今(基于Matrigel?的分析(Kubota, Kleinman et al.1988)是可商用的)，該模型不具有真正的血管生成的以下5個特點:
[0012]1、浸潤(invasio n) -二維模型中的內皮細胞在細胞外基質的頂部形成網絡并顯示出很小的進入細胞外基質的傾向(Vernon, Angeilo et al.1992, Vernon, Lara etal.1995)。
[0013]2、方向性-在二維模型中，在體外形成的內皮細胞網絡或多或少的同時遍及預定位細胞的區域，然而體內血管生成包括通過多級分枝使纖維狀萌芽分叉而引起的細胞外基質的矢量浸潤。
[0014]3、正確的極性-盡管二維模型使單細胞管與毛細管非常類似(Maciag, Kadish etal.1982; Feder, Marasa et al.1983; Sage and Vernonl994),但是,它們的極性是“由內向外的”，即，他們將基底膜物質沉積在它們的內腔表面，并且使它們的凝血酶原表面向外面向周圍的培養基(Maciag, Kadish et al.1982;Feder, Marasa et al.1983)-與體內的情形相反。
[0015]4、內腔形成-二維模型生成具有專屬內腔的內皮細胞(EC)管的證據不足。通常，內皮細胞管具有“內腔”空間，該內腔空間填充有細胞體外基質(或為外生的或為由細胞合成的)(Maciag, Kadish et al.1982;Madri 1982; Feder, Marasa et al.1983; Sage andVernonl994; Vernon, Lara et al.1995)。存在專屬內腔時,專屬內腔通常以類似縫隙或由內皮細胞細胞質的厚壁所分隔的狹窄的圓柱狀空間的形式出現-與作為體內典型的毛細管的膨脹的薄壁內皮細胞管具有顯著的不同。[0016]5、細胞特性-二維模型中的細胞網絡通過機械過程生成，該機械過程可以由非內皮細胞型來實現(Verrton, Angello et al.1992; Vernon, Lara et al.1995)。當然，數學建模顯示出，任何能夠適應具有延展性的二維細胞外基質的張力的粘附細胞型(或為內源合成的或為提供的(例如Matrigel?凝膠))均能在最佳條件下生成網絡(Manoussaki, Lubkin et al.1996)。
[0017]體外血管生成的三維模型:公認的是,在三維細胞外基質中發生的體內的血管生成已經引導出各種模型，其中，體外的三維細胞外基質凝膠中誘導萌芽。在早期的三維模型中，內皮細胞分布于形成有芯和管網絡的膠原質凝膠中(Elsdale and Bardl972)。盡管內皮細胞管顯示出正確的極性，但是缺乏浸潤和方向性的特性(內皮細胞被預先植入并最終均勻地分布在細胞外基質中)。雖然如此，已經證明這個方法在研究內腔形成(Davisand Camarillol998)和內皮細胞對生長因子的響應方面是有用的(Madri, Pratt etal1988;Merwin.Anderson et al.1990;Kuzuya and Kinsellal994;Marx, Perlmutter etal.1994; Davis and CamariI11996)。
[0018]在一個可供選擇的方法中，將I毫米老鼠大動脈片段(環狀)植入生成有分枝的吻合管的三維的血漿凝塊中(Nicosia, Tchao et al.1982)。源自動脈環的萌芽顯示出類似于血管生成的浸潤以及除了極性以外的方向性。利用源自小鼠(rat)的動脈環或源自大鼠(mice)的微脈管片段的移植模型，已經被用于研究腫瘤、生長因子、各種細胞外基質載體、和血管生成的成熟條件方面的影響(Nicosia, Tchao et al.1983;Mori, Sadahiraet al.1988;Nicosia and 0ttinettil990;Nicosia, Bonanno et al.1992;Villaschi andNicosial993;Nicosia, Bonanno et al.1994;Nicosia, Nicosia et al, 1994;Nicosia andTuszynski1994;Hoying.Boswell et al.1996;Arthur, Vernon et al.1998)。
[0019]各種現存的模型誘導純化的內皮細胞(如單細胞層或集合體)萌芽浸潤至細胞外基質凝膠的基層或周圍(Montesano and Orci 1985; Pepper, Montesano etal.1991;Montesano,Pepper et al.1993;Nehls and Drenckhahn 1995;Nehls andHerrmann 1996; Vernon and Sagel999; Vernon and Gooden 2002)。每一種模型都具有特殊的局限性，包括很難用肉眼觀察萌芽形成、受限制的萌芽、需要切片、或者缺乏特定類型的內皮細胞的效力。
[0020]Wolverine和Gulec公開了一中三維血管生成體系(US2002/0150879A1)，包括將腫瘤組織片段植入基質中。所述微脈管的向外生長可以被特征化，以分析所述組織的脈管生成潛能。但是，這個方法不能提供微脈管的內腔灌注。
[0021]Neumann (本方法的發明人)等，在2003年公開了在體外(包括在人工組織中)生成可灌注的微脈管是可能的。Neumann等人在2003年教導,使用127微米的尼龍釣魚線作為用于制造微脈管的軸芯，該軸芯被收縮管材夾持。由小鼠的動脈平滑肌細胞制造的脈管被植入到瓊脂中。這些微脈管具有試探性的性質，并不適合于人類血管移植。
[0022]體外血管生成的新方法:體外脈管生成的二維模型不能確定前述列出的血管生成的定義特征，然而，現有的三維模型重建了其中一些或多數的特征。重要的是，現今的三維模型中沒有一個模型能重建包括受壓的、流動的循環流體的原始脈管。所以，現有的三維模型中沒有一個模型能夠進行關于內腔壓力和流體對脈管生長和形態生成的貢獻方面的研究。
[0023]本發明克服了現有的血管生成模型的局限性，通過將用于在三維體外細胞基質(ECM)中生成浸潤的、管狀的微血管萌芽的經驗證的方法與用于構建作為內腔流動源頭的組織工程化原始脈管的新方法相結合。通過灌注液，調節血管生成的化合物能夠被提供給內皮細胞的內腔表面，已知特定的靶受體被定位在所述內腔表面。營養介質內腔流體的存在將會充分地增加體外毛細管的存活時間。公開的血管生成體系能夠被用于評估各種實驗性參數，包括缺氧/氧過量、特定的可溶性生物活性化合物的測試、經過基因修飾細胞的使用，以及經病毒轉染的基因傳遞。該體系還可以用于與損傷修復，老化，癌癥，與動脈粥樣硬化相關的血管生成的研究。重要的是，本發明教導的下述模型可以適用于提供能夠應用于生物工程化的人工組織的供功能齊全的脈管體系。
[0024]本發明還提供了新的方法，該方法包括用于生成微脈管、從內皮細胞中生成微脈管、以及生成大血管(例如，具有冠狀動脈大小的血管)的多種設計。這些和其它重要的新方法包括，例如，一種生成微脈管網絡的方法，該方法是以下述說明書和權利要求書的描述為依據的。
【發明內容】
[0025]一種在體外生成可灌注的微脈管網絡的方法，該方法包括下述步驟:
[0026]通過在一組軸芯上以及軸芯的周圍培養細胞，在體外生成至少一個原始脈管；
[0027]將至少一個原始脈管植入到基質中；
[0028]誘導至少一個原始脈管，以在基質中生成萌芽；
[0029]取出一組軸芯；并且
[0030]對所述至少一個原始脈管和萌芽進行內腔灌注，以模擬從毛細管床的動脈末端到靜脈末端的自然血流，以生成微脈管網絡。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0031]圖1A、圖1B和圖1C示意性地描述了根據本發明方法的原始脈管生成的例子；
[0032]圖2A、圖2B、圖2C和圖2D示意性地描述了根據本發明方法的已知的熱收縮過程(heat-shrink process)的例子；
[0033]圖3A示意性地描述了用于安裝本發明方法所用的培養/灌注的設備的設計圖；
[0034]圖3B示意性地描述了用于安裝本發明方法所用的培養/灌注的設備的制備方法的設計圖；
[0035]圖4A和圖4B示意性地描述了用于本發明方法所用的培養/灌注的設備的多支管的制造；
[0036]圖5A、圖5B和圖5C示意性地描述了根據本發明方法構建的微裝配的培養/灌注的設備的可選擇性設計圖；
[0037]圖6示意性地描述了根據本發明方法的細胞接種程序；
[0038]圖7示意性地描述了根據本發明方法的兩個生物型人工原始脈管之間的毛細管網絡；[0039]圖8A示意性地描述了根據本發明方法的在體外接種平滑肌細胞后的多個軸芯的圖例；
[0040]圖SB示意性地描述了根據本發明的方法制備的灌注的肌板(muscle plate)。【具體實施方式】
[0041]這里介紹的實例的目的是為了進一步了解本發明。這些實例用于解釋本發明，而本發明并不僅限于這些實例性的實施方式。本發明的方法對生理學和病理學的血管生長和響應脈管生成因子或抗脈管生成因子的血管生長的研究是有用的。針對于該方法的其它有益的應用為評估潛在的癌組織的血管生成和響應抗血管生成的藥物的方法。此外，本發明的方法可以被應用于構建各種創傷愈合設備以及用于組織工程化的血管形成。
[0042]在一個實例中，公開了一種用于制造可灌注的三維微脈管網絡的方法和設備。在這里用“EC”代表內皮細胞，用“SME”代表平滑肌細胞，用“CAS”代表冠狀動脈替代物。
[0043]一般來說，用于培養和灌注微脈管網絡的設備由可在中心處容納一個或多個軸芯的腔室構成(如圖1所示)。該腔室能夠通過使用某些技術由任何生物相容性的材料制得，例如，形成夾層的激光切割框架。軸芯被裝在腔室中，這樣它們是可回收的。這可以通過將軸芯的端部固定在管中來實現，例如，通過熱收縮(如圖2所示)。軸芯的直徑取決于期望的脈管管徑。改變設置以適應單個脈管、兩個脈管、或直至整組的二維或三維脈管。軸芯可以是各種材料，例如，聚合纖維、玻璃纖維、線材等。
[0044]通過將細胞接種在軸芯上，刺激細胞在軸芯周圍繁殖，當細胞形成管壁后取出軸芯，從而獲得微脈管。脈管隨后被植入基質中。根據培養的條件、基質的組成、以及血管生成刺激的存在(例如，生長因子)，原始脈管將萌芽并進入周圍的基質中。萌芽將會相互連接而形成毛細管網絡。在除去軸芯后，將設備連接到灌注系統上，向脈管中注入內腔液體流。
[0045]現在參考圖1A、圖1B和圖1C，圖中示意性的描述了根據本發明的方法制造原始脈管的例子。圖1A顯示了在培養生長基100上的內皮細胞1，被接種在軸芯2上，軸芯2由設備主體3中的收縮管4支撐。圖1B顯示了細胞I的增殖并形成細胞套筒102的形式的環狀層。圖1C顯示了取出軸芯2后，在細胞外基質(ECM)凝膠110中的細胞套筒被灌注培養生長培養基100。本發明包括對用于組織工程化應用和研究模型可灌注生物人工脈管結構進行工程化。本發明的一般原理包括:在環繞可去除軸芯的周圍培養細胞，所述軸芯被緊固在薄壁管或其它固定物上。一旦細胞層達到期望的壁厚度，將取出軸芯，并在灌注系統的幫助下向由此制造的生物型人工血管(BAVs)中灌注培養基、血液、血液替代物、或其它流體。本發明的方法可以用于生產大規模制造的或常規生成的血管、體外可灌注的血管生成模型、創傷愈合設備、組織成分、整個組織和器官、以及研究模型。
[0046]培養/灌注的設備的制造
[0047]現在參考圖2A，圖2B，圖2C和圖2D，圖中示意性地描述了用于本發明的一個【具體實施方式】的已知的熱收縮方法的例子。特別如圖2A所示，每個培養/灌注的設備(CPD)可以包括一個或多個被支撐在框架12上的軸芯2。軸芯2的直徑為期望的脈管口徑，軸芯2的末端與醫藥級收縮管片段4緊密配合。軸芯2可以包括生物相容性纖維(例如，聚合物纖維、玻璃纖維)、線材、或等同物，取決于待模擬的脈管尺寸，軸芯2的直徑為幾微米到幾毫米。[0048]更詳細的描述如圖2B所示，每個收縮管片段4的中間部位14在一個軸芯2的周圍被熱收縮。隨后，特別如圖2C所示，軸芯2收縮，管被切斷。圖2D示出了重置軸芯之后的位置，這樣軸芯的兩端被封閉在現在被切斷的和分離的收縮管片段4中。可以使用各種材料和工藝構建框架12。可以改變設置以適應單獨的生物型人工脈管或多組生物型人工脈管。同樣地，通過將多組軸芯分層放置，通過脈管網絡可以生成具有一定厚度的、可灌注的組織。
[0049]灌注腔室的制造
[0050]現在參考圖3A，一個已知的用于灌注多個軸芯/收縮管集合11的設備。框架20可以方便地由聚碳酸酯或等同材料碾壓制成。分配腔室30可以包括在設計中，這樣可以允許同時灌注多個人工生物型人工脈管。包括軸芯2的一套線程(thread)的末端被收集在硅管23中。
[0051]聚酯膜框架的激光切割
[0052]現在參考圖3B，示意性地描述了用于安裝本發明方法所用的培養/灌注的設備的制造方法的新設計。單脈管設計，CPD70，可以便利地通過將軸芯2夾在中間而生成，所述軸
芯2通過熱收縮管4被支撐在兩個激光切割的Mylar? (聚酯膜)框架22之間。一個環狀
的環氧多支管21，它的構成將在下面說明，可以方便地用于支撐軸芯/收縮管集合11。
[0053]將軸芯/收縮管集合夾在兩個聚酯膜(例如Mylar?)等的框架之間，并將粘合劑
一側加壓，這樣每個軸芯通過在端部的兩個收縮管片段4’懸掛在框架窗口 76中。兩個收縮管4’通過內含的至少一根細的穩固線材26被穩定并加固在框架22中，并被封裝在圓柱形的環氧多支管中，該環氧多支管是通過使用硅樹脂管的模具，環繞著收縮管和至少一根細的穩固線材26而鑄成的。收縮管片段4’最后將變成CPD70的流入口和流出口。
[0054]現在參考圖4A和圖4B，示意性地描述了一種用于根據本發明方法的設備的多支管的制造方法。圖4A特別顯示了多個收縮管/軸芯集合11通過套管(例如，硅膠管50)被拉出。環氧膠水40被注入并填充在硅膠管50中并使它硬化。
[0055]圖4B特別示出了環氧膠水40變硬后以及硅膠管50被切開并被移開的情況。剩下的是變硬的環氧棒44。當軸芯收縮到切割點的后時，環氧棒44被切斷，留下由收縮管形成的腔道42。多個收縮管的端部46可以被整合，以形成多支管21。可以使用單個的CPDs或CPD框架集合的疊加來生成三維脈管陣列。
[0056]可選擇的方法
[0057]現在參考附圖5A、圖5B和圖5C，示意性地描述了根據本發明的方法的用于微組裝的培養/灌注設備的可選擇的設計圖。圖5A特別示出了通過小的穿孔54將一套軸芯2引入框架，小的穿孔具有套筒56，它們作為收縮管的替代物。圖5B特別示出了細胞接種前的CPD，包括安裝在框架壁52上的一套軸芯2。
[0058]圖5C特別示出了一個替換實例，該實例為具有脈管62的培養/灌注的設備，框架52外的微組裝多支管64可以被套在套管56上。如這里所示，脈管62在軸芯上生長，并在軸芯被移除后而被保留下來。微組裝的方法(例如微成型)可以用于這樣的(PD框架集合的大規模生產。
[0059]脈管制造和灌注[0060]現在參考圖6，這里示意性地描述了根據本發明方法的細胞接種程序。為了制備用于細胞接種的CPDs70，首先對它們進行清洗并用紫外光滅菌。在無菌條件下，CPDs被固定在表面，例如彼得里(Petri)盤72的底部。隨后在CPD框架集合70的內部窗口 76 (如圖3B所示)中填充溶液，該溶液含有附著蛋白，例如層粘連蛋白-1。根據需要，可以使用一個或多個襯墊(spacer) 77。在培育期后，將含有附著蛋白的溶液除去，將培養基中含有的期望類型的細胞懸浮液轉移至CPD70的窗口 76中。
[0061]通過將一定體積的細胞懸浮液填充在窗口 76中來完成細胞接種，翻轉(PD框架集合70使它的上部向下，因此產生了懸滴(hanging droplet) 80。在大約為45分鐘的培育期內，大量細胞將附著在位于(PD框架集合中的軸芯/收縮管集合集上。過量的細胞將沉入在懸滴的端部，并可以很容易的被收集和除去。彼得里(Petri)盤，包括一個或多個CPD框架集合，然后回到朝上的位置，填充培養基直到(PD框架集合被浸沒，并進行培養。在一個實例中的培養條件包括:環境中CO2含量為5%，溫度為37°C。附著在軸芯/收縮管集合上的細胞，將向外延伸并增殖，形成同軸的單細胞層(例如內皮細胞)或150微米或更厚的多細胞層(例如平滑肌細胞)。
[0062]達到期望的壁形狀或厚度時，取出軸芯從而制得空心細胞管。較薄的壁需要通過在取出軸芯前在細胞套管的周圍涂覆凝膠(例如，瓊脂糖、膠原蛋白、凝膠基底膜蛋白等等)進行保護，以防止破裂。然后將(PD框架集合的多支管連接到灌注系統上，通過可選擇的流體進行灌注，例如生長培養基。
[0063]在本發明的另一個【具體實施方式】中，一種由人脈管的內皮細胞(HUVEC)生成內皮原始脈管的方法，該方法包括下述步驟，其中:
[0064]首先清洗培養設備，并用紫外光從各個側面照射滅菌30分鐘。在無菌條件下，將設備固定在具有無菌條(sterile strip)的彼得里(Petri)盤的底部。
[0065]然后，用粘連蛋白- 1的附著蛋白溶液填充設備的內部窗口(可用其它的附著蛋白，例如纖維連接蛋白、纖維蛋白或凝膠代替)。
[0066]培養過夜后，除去含有附著蛋白的溶液，并將培養基中的人脈管內皮細胞的懸浮液轉移至設備的窗口中。
[0067]翻轉彼得里(Petri)盤使上部向下，在設備的窗口中產生了細胞-培養基懸浮液的懸滴。45分鐘后，在培育期內的細胞培養箱中(CO2含量為5%，溫度為37°C)，大量細胞將附著到設備中的軸芯/收縮管集合上。
[0068]然后將彼得里(Petri)盤回轉到朝上的位置，在其中填充用于人脈管內皮細胞的生長培養基，直到設備被浸沒。
[0069]未附著在軸芯上的細胞將落下并被送出和除去。
[0070]然后將彼得里(Petri)盤放置在培育箱(CO2含量為5%，溫度為37°C)中。附著在軸芯上的細胞將向外擴散并增殖，形成同軸的人脈管內皮細胞的單細胞層。
[0071]除去彼得里(Petri)盤中的培養基。在培養設備的窗口中裝入膠原蛋白溶液并使其硬化，從而使軸芯嵌入在細胞層中。
[0072]人脈管內皮細胞將向膠原蛋白凝膠中形成萌芽。軸芯被慢慢地取出，留下可灌注的人脈管內皮細胞的原始微脈管。
[0073]然后，將設備的多支管連接到灌注系統，并用人脈管內皮細胞生長培養基進行灌注。
[0074]灌注系統
[0075]CPDs可以安裝在線性模式或循環模式的灌注系統上。線性設置可以由重力流系統形成，或者由可商購的或常規構建的注射泵形成。在注射器中裝滿灌注培養基并安裝在注射器泵上，通過不漏氣的管材與上游的CPDs連接。CPDs可以儲存在設置在(PD中的培養箱中，所述培養箱處于無菌態或具有無菌的細胞培養環境。將CPDs的下游多支管連接到收集灌注液的蓄水池的末端。可以通過使用蠕動泵構建循環系統。線性系統和循環系統均可以被固定在氣體交換設備上。氣體的濃度、灌注的壓力、流程、溫度、和營養物及代謝副產物的濃度可通過傳感器進行測量。所收集的數據進入反饋回路，以嚴格控制所需的參數。
[0076]用于與血管生成相關研究的模型
[0077]現在參考圖7，圖7示意性地描述了根據本發明方法的在兩個生物型人工原始脈管200，202之間的毛細管網絡。通過減少流體f流入“靜脈”原始脈管202，并增加施加在“動脈”原始脈管200上的阻力R，使在流動的灌注液204通過毛細管206的改變路徑，從而，驅動灌注液204從具有較高壓力的脈管進入具有較低壓力的脈管，以模擬從毛細管床的動脈端到靜脈端的自然血流。
[0078]軸芯法也可以用于血管生成研究模型的開發，作為用于藥學實驗以及在傷口愈合、衰老、和疾病(如癌癥、糖尿病、關節炎、和牛皮癬)的研究上的需要。只采用內皮細胞，或者內皮細胞、平滑肌細胞、和周細胞(pericytes)的結合，能夠環繞微米直徑的軸芯來培養原始生物型人工微血管(BMVs)，并植入到細胞外基質的凝膠載體中。然后將軸芯取出，留下位于細胞外基質凝膠210 (膠原質凝膠，基底膜基質(BMMs)或其它)中的原始內皮細胞管。軸芯的取出可以手動完成，或者借助于具有從極慢到極快的速度變化的自動化設備。其它變化可以包括在冷凍狀態下從生物型人工微血管中取出軸芯；用熱反應聚合物涂覆軸芯；或牽拉軸芯的任一端，使它變細直至斷裂。
[0079]原始脈管向凝膠210中的萌芽可以被化合物所誘導，例如，堿性纖維原細胞生長因子(bFGF)、動脈內壓生長因子(VEGF)、和佛波12-肉豆蘧酸_13_酯(PMA)，它們被加入到凝膠和/或灌注液(例如生長培養基)中。
[0080]可以通過在兩個相鄰的原始人工微脈管間形成壓力差來制造復雜的毛細管網絡222，從而模擬動脈和靜脈血流。液體流將從“動脈”生物型人工脈管中改變路徑，通過相互連接的萌芽進入“靜脈”生物型人工微脈管。
[0081]所述灌注液可以含有含氧的細胞生長培養基、無血清培養基、和生成脈管的物質或抑制脈管生成的物質。在另一個實例中，所述灌注液可以是補充有血清和/或影響脈管生成的化合物的含氧的細胞生長培養基。而在另一個【具體實施方式】中，所述灌注液可以是含氧的生理鹽溶液。在另一個實例中，所述灌注液可以包括含氧血液、血液組分、或血液替代品。在另一個【具體實施方式】中，所述灌注液可以不是含氧通過基質的擴散而獲得氧化體系。而在另一個【具體實施方式】中，可以在灌注液中加入生成脈管的化合物或抑制脈管生成的化合物。
[0082]在一個【具體實施方式】中，在所述基質中加入生成脈管的化合物或抑制脈管生成的化合物等。而在另一個【具體實施方式】中，所述細胞包括基因修飾的細胞，該基因修飾的細胞能夠向灌注液中或基質中釋放產物。而在另一個【具體實施方式】中，所述基質可以優選含有纖維蛋白、膠原質、和凝膠。一種可用的基質為Mairige卜凝膠。在另一個【具體實施方式】中，所述基質可以包括瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽或硅膠。
[0083]在另一個【具體實施方式】中，所述細胞可以選自由內皮細胞、平滑肌細胞、周細胞、人細胞、動物細胞、植物細胞、干細胞和基因修飾的細胞所組成的組中。所述基質可以使選自由人細胞、動物細胞、和植物細胞所組成的組中的細胞繁殖，或者使它們擴散至整個基質中，或者使它們在局部集中。在一些情況下，健康的或病態的組織的片段(例如癌組織)被植入到基質中。
[0084]源自原始脈管的萌芽可以在體外以切片材料或整裝制片的形式進行顯微研究。使用熒光溶液(例如，熒光右旋糖酐)的生物型人工微脈管的灌注，有助于對萌芽直徑、萌芽內腔的開放、和吻合(anastomization)的程度進行分析。萌芽形態的三維重建可以通過將由共焦顯微鏡得到的熒光圖像的z軸重疊來實現。通過萌芽220的細胞外周基底膜基質的合成，可以通過使用抗層粘連蛋白的免疫標簽以及IV型膠原的第一抗體和熒光或過氧化物酶標記的第二抗體以整裝的形式和組織(石蠟)切片的形式進行監控。
[0085]在復合的EC/SMC萌芽中，可以通過使用人⑶31 (克隆P2Bl-Chemicon公司)的FITC單克隆抗體或FITC-UEA1凝集素(一種用于人類內皮細胞的特殊標記物)標記內皮細胞，對兩種細胞型之間的空間關系進行檢測。可以用人的α-SM肌動蛋白的單克隆抗體并隨后用RITC抗鼠第二抗體對平滑肌細胞進行標記。內腔結構的細節以及內皮細胞和平滑肌細胞之間的相互作用，可以從用前述的試劑標記的石蠟切片中獲得。
[0086]所描述的構建方法是用于商業大規模生產的具有高重復性的血管生成設備的基礎。經過適當的保存(例如，冷凍保存)，研究人員能夠以現貨的方式買到預先生長的原始脈管或整個毛細管網絡。
[0087]冠狀動脈的替代品
[0088]為了制造冠狀動脈的替代品，挑選具有一定外徑的軸芯來制備冠狀動脈替代品，該冠狀動脈替代品具有內徑約為4-5.5毫米的血管內腔。做為選擇，所述軸芯可以是空心管，可以被灌注且它的滲透性足以滿足在冠狀動脈的替代品的生長期間的營養物質和氣體的交換。冠狀動脈的替代品可以只由平滑肌細胞生長得到，因此，生成的結構類似于血管中的中膜層，或作為兩種或三種細胞型的復合結構。
[0089]將平滑肌細胞接種在軸芯上，并生長至300-400微米的環形層。為了加速冠狀動脈的生成，可以下述方式操縱SMC表型:在初始的生長階段，使細胞進入高度增殖的表型；然后在脈管壁達到期望的厚度后轉化成不同的狀態。表型的轉化將導致平滑肌細胞的生長速率被顯著地減緩，并誘導細胞外基質蛋白質的產生，例如膠原質和彈性蛋白，這些蛋白對正確的脈管機械性能是必需的。可以通過控制確定的基因的表達來獲得表型的轉換。例如，四環素反應啟動子的幫助下，基因表達(例如彈性蛋白)受到抑制直到管壁達到期望的厚度。從生長培養基中除去四環素，可以激活插入的基因。彈性蛋白的過度表達，將進一步抑制細胞的增殖以及管壁內的實施結構和信號功能。機械調節，例如，動脈流可以用于加固冠狀動脈替代品，并誘導細胞的生理定位(physiological alignment)。也可以使用其它外部或內部的“表型轉化”。
[0090]在取出軸芯后或在平滑肌細胞的調整和重建后，可以直接將內皮細胞接種在SMC套管上。內皮細胞的接種可以通過將內皮細胞懸浮液灌注到SMC套管中來完成。然后使流動停止一段時間，以使內皮細胞附著。
[0091] 如果需要，為了使內皮細胞更容易分散，可以旋轉血管或重復的上下輕彈血管。
[0092]選擇性地，可以先將內皮細胞接種在軸芯上。在這種情況下，平滑肌細胞被接種在匯合的內皮細胞層上。使用這個方法，有必要的是防止內皮細胞向富含氧氣和養分的冠狀動脈代替品的外圍遷移。
[0093]如果期望，纖維原細胞在SMC套管外側的接種能夠形成外膜層。
[0094]用于形成冠狀動脈替代品的細胞可以源自自體同源的、異源的、或異種的材料。所述細胞可以是干細胞、前體細胞、或分化細胞。所述細胞可以進行基因修飾，以獲得特定的表型或對宿主生物體的低免疫響應。
[0095]本發明的方法提供了用于大規模生產可現貨供應的血管替代品或血管替代品的選擇，所述替代品通常是為受體所設計的。本發明的方法還適用于組織工程化的冠狀動脈替代品模型的開發、動脈粥樣硬化的研究、血管的生成，不同的血管細胞型之間的相互作用以及與細胞外基質組分的相互作用的研究、一氧化氮效應的研究、和各種藥品的研究。
[0096]不同大小或類型的血管和淋巴管
[0097]本發明的方法還可以用于制造除冠狀動脈以外的其它直徑和類型的血管。軸芯直徑的改變將改變脈管的直徑。根據細胞表型，和/或細胞增殖被抑制的時間點，可以改變脈管的種類(動脈、靜脈、淋巴)。例如，靜脈只含有小的平滑肌細胞層。
[0098]其它類管狀組織
[0099]本發明的方法可以被用于工程化的其它管狀組織，例如膽管、淚管、鼓脹咽管(pharyngotympany tube)、輸卵管、輸精管、輸尿管、尿道等。本發明的方法用于從包括膠質細胞在內的不同類型的細胞中生成神經導管，并指導神經網絡的生成和修復。
[0100]用于工程化組織的BAV系統
[0101]本發明的方法可以用于使用作為骨架的可去除的軸芯陣列的組織和器官的工程化。將期望的組織/器官(肌肉、肝臟、腎臟、肺、皮膚等)的細胞接種到涂覆有附著蛋白的軸芯上。這些軸芯可由固體纖維或線材制成，或選擇性的由可灌注的、具有滲透性的管制成，例如纖維素。所述軸芯以一定的間距相互分離，所述間隔允許單細胞套管的并入。使用這個方法可以生成片狀或塊狀的組織。然后取出軸芯(或不同的去除方法)，生物型人工組織通過輔助的灌注系統進行內部灌注。
[0102]傷口愈合設備
[0103]預制的生物型人工脈管體系可以用于幫助傷口愈合，例如糖尿病人的慢性潰爛。生物型人工毛細管網絡可以被植入片狀的載體材料中(例如從富含脈管生成因子的細胞外基質凝膠中)，并放置在傷口處。用含氧的營養液進行自主灌注，生物型人工脈管將會促進供體脈管系統和皮膚的萌芽。選擇性地，這樣的生物型人工脈管修復片段可以夾在傷口和皮膚移植物之間，并促進移植物的向內生長。
[0104]基因治療設備
[0105]生物型人工脈管可以用于植入式給藥設備。從病人體內取得的細胞，能夠在體外進行基因修飾以生成特定的蛋白(激素，酶等)。使用上述方法，這些細胞可以生長成生物型人工脈管或脈管網絡。重新灌注到宿主中，細胞繼續產生目標物質并將它釋放到局部或全身。[0106]人工組織和器官
[0107]如上所述，組織工程化的脈管網絡可以用于組織或乃至整個器官的制造。一個方法是一個或多個體外可灌注的原始脈管的制造。從期望的組織或器官中得到的基質細胞被接種在原始脈管的周圍，例如，在凝膠中。通過原始脈管給基質細胞供應養分和氧氣。隨著基質細胞的增殖，養分和氧氣的需求量將增加。細胞釋放脈管生成因子，并刺激脈管萌芽。作為組織生長-非常類似于自然生長，脈管體系以相同的速率萌芽。因此，這個體系也將是一個用于發育生物學研究的良好模型。
[0108]另一個方法利用平行排列的軸芯作為基質細胞的骨架。隨著基質細胞的增殖，細胞層環繞軸芯而形成。最終，所有軸芯之間的空間被基質細胞所充滿，生成了片狀組織。在取出軸芯后，組織可以通過在軸芯處留下的通道進行灌注。通過內腔接種，通道能夠變成內皮狀。該方法不限于在二維空間中使用。或者堆積多個片狀組織，或者使用三維骨架。本發明的發明人使用了用于肌肉組織的工程化的二維陣列和三維陣列。 [0109]而在另一個方法中，能夠獨立地生成組織層和脈管網絡層，然后間歇地進行堆砌。所有的這些方法或者能夠生成具有一種或兩種細胞型的簡單模型，或者能夠生成含有多個細胞型的復合構型。
[0110]在灌注時，用這些方法構建的工程化的組織或器官或者能直接與血流連接，或者通過灌注系統保持灌注直到宿主脈管系統生長進入移植物中。
[0111]可灌注的組織工程化肌肉的構建實例
[0112]現在參考圖8A，描述了根據本發明方法的在體外接種平滑肌細胞后的多個軸芯的
圖片。多個軸芯與收縮管單元M被夾持在Mylar?框架中。軸芯M之間的距離可以調整到
約100微米。所有收縮管片段的末端結合在一個上游多支管和一個下游多支管中(圖中未
示出)。Mylarf.框架是經過消毒的，內腔被覆蓋并使用每毫升5XIO6個的鼠動脈平滑肌細
胞SM(RASMCs)的懸浮液進行接種。所述SM細胞吸附在每個單獨的軸芯M上并被增殖，因而形成了環狀層。10天后，獨立的層結合到一起并最終形成了平滑肌細胞的薄片或薄盤。在生長培養基中再放置7天，并向培養基中補充50U/毫升的肝磷脂，并再培養7天。然后，取出所有的軸芯，并用肝磷脂培養基以10毫升/天的速度對組織進行灌注。灌注的腔室被固定在填充有肝磷脂培養基的100毫米Petri盤的底部。持續對SMC盤進行灌注11天。灌注時間結束后，通道CH的功能仍被保留，并在體外清晰可見(如圖SB所示)。
[0113]現在參考圖SB，描述了采用本發明的方法制得的可灌注肌板MP的實例。所示的可灌注的流體通過管道末端(T)進入由除去的軸芯留下的通道(CH)中。
[0114]本發明在這里所描述的相當多的細節是為了遵守專利法，并為本領域技術人員實施本發明的新原理而提供信息，并構建和使用所需要的這些示例性的和專門的組分。但是，應該理解的是，本發明可以通過不同的專用設備和置以及構建法則進行實施，在不偏離本發明的精神和范圍的情況下，可以實施如具體設備和操作程序在內的各種改變。
[0115]說明書中所引用的所有參考文獻的全文在此一并引入作為參考。如果發生其他方面的不可調和的沖突，本說明書將會控制。
[0116]參考文獻
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【權利要求】
1.一種在體外生成可灌注的微脈管網絡的方法，該方法包括下述步驟: 通過在一組軸芯(2)上以及軸芯的周圍培養內皮細胞(1)，在體外生成至少一個原始脈管(200)； 將所述至少一個原始脈管(200)植入到基質中； 誘導所述至少一個原始脈管(200)，以在所述基質中生成萌芽(220)，所述萌芽能夠被選自由堿性纖維原細胞生長因子、動脈內壓生長因子和佛波12-肉豆蘧酸-13-酯組成的組中的化合物所誘導，所述化合物被加入到凝膠和/或灌注液中； 取出所述一組軸芯(2);并且 對所述至少一個原始脈管(200)和萌芽進行內腔灌注，以模擬從毛細管床的動脈末端到靜脈末端的自然血流，以生成微脈管網絡。
2.根據權利要求1所述的方法，其中，所述生成至少一個原始脈管(200)的步驟生成了兩個或多個原始脈管，所述萌芽吻合并形成毛細管網絡。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，所述生成至少一個原始脈管(200)的步驟還包括生成多維排列的可灌注的脈管。
4.根據權利要求1所述的方法，其中，灌注液(204)含有含氧的細胞生長培養基，不含有血清以及生成脈管的物質或抑制脈管生成的物質。
5.根據權利要求1所述的方法，其中，所述對至少一個原始脈管(200)和萌芽進行內腔灌注的步驟包括使用灌注液(204)，該灌注液含有含氧的細胞生長培養基，該灌注液補充有血清、和/或對脈管生成起作用的化合物。
6.根據權利要求1所述的方法，其中，所述對至少一個原始脈管(200)和萌芽進行內腔灌注的步驟包括使用含氧的生理鹽溶液進行灌注。
7.根據權利要求1所述的方法，其中，所述對至少一個原始脈管(200)和萌芽進行內腔灌注的步驟包括使用含氧的血液、血液成分或血液替代品進行灌注。
8.根據權利要求1所述的方法，其中，所述對至少一個原始脈管(200)和萌芽進行內腔灌注的步驟包括使用無氧的灌注液(204)進行灌注，并通過所述基質的擴散實現系統的氧合作用。
9.根據權利要求1所述的方法，其中，所述對至少一個原始脈管(200)和萌芽進行內腔灌注的步驟包括將生成脈管的化合物和抑制脈管生成的化合物中的至少一種添加到灌注液(204)中。
10.根據權利要求1所述的方法，其中，所述對至少一個原始脈管(200)和萌芽進行內腔灌注的步驟包括將生成脈管的化合物和抑制脈管生成的化合物中的至少一種添加到所述基質中。
11.根據權利要求1所述的方法，其中，所述細胞包括基因修飾的細胞，該基因修飾的細胞能將產物釋放到灌注液(204)或所述基質中。
12.根據權利要求1所述的方法，其中，所述基質含有選自由纖維蛋白、膠原質、凝膠、凝膠化的基底膜、瓊脂、瓊脂糖、藻酸鹽、基底膜蛋白質、硅膠、和它們的組合所組成的組中的材料。
13.根據權利要求1所述的方法，其中，所述方法還包括將細胞沉積在所述基質中，其中，沉積在所述基質中的所述細胞選自由內皮細胞、平滑肌細胞、周細胞、人細胞、動物細胞、干細胞和基因修飾的細胞所組成的組中。
14.根據權利要求1所述的方法，其中，所述基質填充有細胞，該細胞選自由人細胞和動物細胞所組成的組中。
15.根據權利要求1所述的方法，其中，健康組織或病態組織的片段被植入到所述基質中。
16.根據權利要求1所述的方法，其中，癌組織的片段被植入到所述基質中。
17.根據權利要求1所述的方法，其中，通過減少流入靜脈原始脈管(202)中的流量并增加人工原始脈管(200)中的阻力，流動的灌注液(204)通過毛細管(206)而改變通路，以驅動灌注液(204)從具有較高壓力的脈管流入具有較低壓力的脈管。
18.根據權利要求1所述的方法，其中，所述微脈管網絡包括選自生物人工微脈管、原始內皮細胞管、和平滑肌細胞管中的一種。
19.根據權利要求1的方法，其中，所述微脈管網絡包括能夠向灌注液(204)中釋放因子的正常細胞或基因修飾的細胞。
20.根據權利要求1所述的方法，其中，所述對至少一個原始脈管(200)和萌芽進行內腔灌注的步驟包括使用正常細胞或基因修飾的細胞，以向灌注液(204)中釋放因子。
21.一種在體外由人脈管內皮細胞生成內皮原始脈管的方法，該方法包括下述步驟: 對具有內部窗口的培養設備進行清洗和消毒； 在無菌條件下將所述培養設備 固定在具有無菌條的容器的底部； 用附著蛋白的溶液填充所述內部窗口； 培養完成后，除去含有附著蛋白的溶液； 將培養基中的人脈管內皮細胞懸浮液轉移至所述窗口中； 在所述培養設備的窗口中生成細胞培養基懸浮液的懸滴； 將容器回轉到朝上的位置，并在該容器中填充用于人脈管內皮細胞的生長培養基，直到所述培養設備被浸沒； 將所述容器放置在培養箱中直到吸附到軸芯(2)上的細胞擴散并增殖，形成同軸的單層人脈管內皮細胞； 除去培養基； 用膠原質溶液填充所述窗口，使該膠原質溶液固化，從而植入具有細胞層的軸芯；緩慢的取出所述軸芯，留下人脈管內皮細胞的可灌注的原始微脈管，該可灌注的原始微脈管萌芽至膠原質凝膠中；和 用人脈管內皮細胞生長培養基進行灌注。
22.根據權利要求21所述的方法，其中，所述附著蛋白的溶液選自由層粘連蛋白-1、纖維連接蛋白、纖維蛋白和凝膠所組成的組中。
23.一種生成組織的方法，該方法包括下述步驟: 在框架上并置多個軸芯(2)，其中，該多個軸芯(2)之間基本平行且間隔有預先確定的距離，并且該多個軸芯(2)中的每一個軸芯的兩端均由管支撐； 將所有管的末端結合在一個上游多支管和一個下游多支管中； 對所述框架進行消毒； 對所述框架進行涂敷；使用細胞懸浮液對所述框架進行接種； 使附著在每個軸芯上的細胞增殖并形成環形層直到個體層結合成組織； 將所述組織置于生長培養基中； 取出所述軸芯(2);和 用灌注液(204)灌注所述組織。
24.根據權利要求23所述的方法，其中，所述灌注液含有肝磷脂。
25.根據權利要求23所述的方法，其中，所述細胞選自由人平滑肌細胞、內皮細胞、基質細胞、和人脈管內皮細胞所組成的組中。
26.一種在體外生成人冠狀動脈替代品的方法，該方法包括下述步驟: 通過在體外培養人平滑肌細胞，在尺寸適于形成人冠狀動脈的軸芯之上和周圍生成細胞管； 將所述細胞管植入至基質中； 取出所述軸芯；和 對所述細胞管進行內腔灌注。
27.根據權利要求26所述的方法，其中，所述細胞管包括內腔表面，該方法還包括通過在培養基中進行接種，用內皮細胞對內腔表面進行涂敷的步驟。
28.根據權利要求26所述的方法，其中，所述細胞管包括外表面，該方法還包括通過在培養基中進行接種，用成纖維細胞對外表面進行涂敷的步驟。
29.根據權利要求26所述的方法，其中，所述軸芯的尺寸適于形成內腔直徑為4-5.5毫米的細胞管。
【文檔編號】C12M3/02GK103468634SQ201310349312
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2007年3月9日 優先權日:2006年3月24日
【發明者】T·紐曼 申請人:諾荑思公司