一種快速準確檢測大腸桿菌o157:h7活菌試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種大腸桿菌O157:H7的PCR的檢測方法。本發明針對大腸桿菌O157:H7的rfbE基因，設計一對擴增634bp的特異性PCR引物，同時為防止PCR檢測時PCR抑制劑存在引起的假陽性結果，在PCR體系中添加了一對擴增16SrRNA保守區域引物。主要采用磁珠富集的方法從實際樣本中分離出目的菌。通過疊氮溴化丙錠（PMA）處理分離的大腸桿菌O157:H7以去除死菌的干擾。最后通過PCR擴增和電泳檢測確定實際樣本中是否受到大腸桿菌O157:H7的污染。本發明的檢測方法具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短，操作過程簡單，并且不會被食物樣品中殘留的DNA或死菌的干擾，同時也排除了實際樣本中PCR抑制劑而引起的假陽性結果，使得檢測結果準確可靠。
【專利說明】一種快速準確檢測大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物檢測領域，尤其涉及一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌的方法。 技術背景
[0002]大腸桿菌0157:H7是近30年來才被發現和識別的食源致病菌，按血清型分類屬腸出血性大腸桿菌(Entero Hemorrhagic Escherichia coli，EHEC)。它以食物傳播為主，主要的宿主是牛和雞等家畜家禽。人類攝入不到10個活菌就有可能引起出血性結腸炎(Hemorrhagic colitis HC)和溶血性尿毒綜合征(Hemolytic uremie syndrom HUS),患者病死率極高，其對人類的健康構成了嚴重的威脅。自1982年美國首次爆發大腸桿菌0157:H7引起的感染性腹瀉以來，世界各國相繼爆發了多起大腸桿菌0157:H7的流行事件。1986年在中國江蘇徐州首次報道了大腸桿菌0157:H7的病例，隨后在中國十幾個省份也發生散發病例。其流行性已經不再是個別國家的問題，而是成為世界重要公共衛生問題之一。
[0003]目前檢測大腸桿菌0157:H7方法有常規培養法和免疫法等，常規培養法耗時且工作量大；免疫磁珠捕獲法由于方法自身的局限性，檢測的靈敏度低且造成一定程度的漏檢。因此，為了確保食品安全，急需快速、簡單、準確的方法來檢測食品中的大腸桿菌0157:H7活菌。
[0004]rfbE基因是編碼大腸桿菌0157:H7的0157抗原基因，本試劑盒針對rfbE基因設計引物特異性強。設計擴增的rfbE基因的片段見Seq N0.1。
【發明內容】
[0005]本發明是目的是針對現有技術的不足，提供一種檢測成本低、檢測結果準確可靠、檢測快速高效、靈敏度高的大腸桿菌0157:H7試劑盒及快速檢測方法。
[0006]本發明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的:
[0007]一種快速準確檢測大腸桿菌0157: H7活菌試劑盒，其特征在于其含有rfbE上游引物(5，— 3，):TCCATTTATACGGACATCCAT，見 Seq N0.2;
[0008]rfbE 下游引物(5，一 3’):AAATTAATTCCACGCCAACCA 見 Seq N0.3;
[0009]16S rRNA 上游引物(5’ 一 3’):CCTACGGGAGGCAGCAGT 見 Seq N0.4;
[0010]16S rRNA 下游引物(5，一 3’):CGITTACGGCGTGGACTAC 見 Seq N0.5。
[0011]上述試劑盒還含有偶聯有大腸桿菌0157:H7抗體的磁珠，PBS磷酸鹽緩沖液，添加有0.02%吐溫的磷酸鹽緩沖液，PMA溶液，Taq mix。
[0012]一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒的檢測方法包括如下步驟:
[0013](I)取食物樣本，加PBS磷酸緩沖液碾磨制成勻漿液，離心去除食物殘渣，取上清得菌懸液，整過程均為無菌操作；[0014](2)取ImL上述菌懸液加入到滅菌離心管中，加入制備好的免疫磁珠0.05mg，室溫下以IOrpm轉速于旋轉混合儀上反應45min后，將離心管插入磁力架分離3min，用移液器吸出上清，加入到滅菌離心管中備用。最后，添加ImL加有0.02%吐溫的磷酸緩沖液洗滌I遍，磁分離后吸出洗滌液，最后用等體積磷酸緩液重懸磁珠。
[0015](3)向步驟2的重懸液加PMA溶液，使PMA的終質量濃度為5 μ g/mL,混勻后室溫避光培養，鹵素燈曝光，光照交聯時樣品置于冰上，交聯后的懸浮液離心，所得沉淀用沸水浴法提取DNA ；PMA溶液配制方法為PMA溶解于二甲亞砜(DMSO)中，配制成5mg/mL的PMA溶液，-20°C避光保存。
[0016](4) PCR反應，PCR反應所用的引物為:
[0017]rfbE 上游引物(5 ’ — 3 ’): TCCATTTATACGGACATCCAT
[0018]rfbE 下游引物(5 ’ 一 3 ’):AAATTAATTCCACGCCAACCA
[0019]16S rRNA 上游引物(5’ 一 3’):CCTACGGGAGGCAGCAGT
[0020]16S rRNA 下游引物(5，— 3，):CGITTACGGCGTGGACTAC
[0021]體系為20 μ L，其中DNA模板2 μ L，2 X Taq mix5 μ L，上下游引各為0.25nmol，無菌水補足20 μ Lo PCR反應條件為:95°C預變性IOmin,緊接著94°C變性30s，56。。退火30s，72°C延伸lmin30個循環，最后72°C延伸lOmin。
[0022](5) PCR反應結束后，取5 μ LPCR產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳。瓊脂糖凝膠用GoldView核酸染色，用GelDoc XR凝膠成像系統成像。如果有475bp的條帶，說明PCR反應體系正常，可以進行后續判定；如果沒有475bp的條帶，說明PCR體系出現錯誤，需要優化體系重新PCR ;在475bp條帶存在的條件下，如果有634bp條帶，說明食品樣本中有大腸桿菌0157:H7，如果沒有634bp條帶，說明食品樣本中沒有大腸桿菌0157:H7。
[0023]有益效果:
[0024]本發明針對大腸桿菌0157:H7的rfbE基因，設計一對擴增634bp的特異性PCR引物，同時為防止PCR檢測時PCR抑制劑存在弓丨起的假陽性結果，在PCR體系中添加了一對擴增16S rRNA保守區域引物。主要采用磁珠富集的方法從實際樣本中分離出目的菌。通過疊氮溴化丙錠(PMA)處理分離的大腸桿菌0157:H7以去除死菌的干擾。最后通過PCR擴增和電泳檢測確定實際樣本中是否受到大腸桿菌0157:H7的污染。本發明的檢測方法具有靈敏度高、特異性強、檢測時間短，操作過程簡單，并且不會被食物樣品中殘留的DNA或死菌的干擾，同時也排除了實際樣本中PCR抑制劑而引起的假陽性結果，使得檢測結果準確可靠。
[0025]具體如下:
[0026]1、采用本發明將磁珠富集與PCR技術結合檢測大腸桿菌0157:H7時間短，可在4.5個小時內得到結果，靈敏度高。同時本發明克服了一般的分子生物學檢測方法無法區分死菌與活菌的缺陷以及PCR抑制劑存在引起假陽性結果，使檢測結果真實可靠。
[0027]2、通過電泳識別634bp條帶和475bp條帶實現快速鑒定,方法簡單易行。
[0028]大腸桿菌0157:H7作為一種主要的食源性致病菌，在公共衛生、食品安全。獸牧獸醫和出入境檢驗檢疫中必須的檢測指標。隨著社會經濟的發展和國際貿易量的與日俱增。急需建立一種從田園到餐桌的一種快速、準確、簡便的細菌檢測方法。本發明將IMS、PMA處理的PCR檢測技術更具有重要意義。【專利附圖】
【附圖說明】
[0029]圖1未經過磁珠富集PCR檢測線，a在不添加16S rRNA時的檢測線，b是添加16SrRNA時的檢測線
[0030]圖2不同濃度的菌液磁珠富集的捕獲效率；
[0031]圖3PMA區分死菌活菌的效率，PMA處理結果；
[0032]圖4MS-PMA-PCR在純培養中的檢測線。泳道M DL2000,泳道1-7:
2.0X 107to2.0XlO1Cfu mL-1 泳道 8 陰性對照；
[0033]圖5MS-PMA-PCR在實際樣本中的檢測線。泳道M DL2000,泳道1-6:
5.0X 106to5.0XlO1Cfu mL-1 泳道 7 陰性對照。
具體實施方案
[0034]下面結合具體實施例，進一步闡釋本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件是實驗方法，通常按照常規條件中的條件，或按照制造廠商的建議條件，實施例中涉及的菌株均屬于現有技術，本領域的技術人員可很容易地從公開是商業渠道獲得。
[0035]實施例1
[0036]一種快速準確檢測大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒，其特征在于
[0037]其含有rfbE 上游引物(5 ’ 一 3 ’):TCCATTTATACGGACATCCAT
[0038]rfbE 下游引物(5 ’ 一 3，):AAATTAATTCCACGCCAACCA
[0039]16S rRNA 上游引物(5’ 一 3，):CCTACGGGAGGCAGCAGT
[0040]16S rRNA 下游引物(5，— 3，):CGITTACGGCGTGGACTAC。
[0041]上述試劑盒還含有偶聯有大腸桿菌0157:H7抗體的磁珠，PBS磷酸鹽緩沖液，添加有0.02%吐溫的磷酸鹽緩沖液，PMA溶液，Taq mix。具體檢測方法如下:
[0042]1.食物樣本預處理
[0043]稱取Ig的食物樣本，加入9mL的PBS磷酸鹽緩沖液，碾磨制成勻漿液，800prm離心lOmin，去除大的食物殘渣，得上清液(該過程必須無菌操作)。
[0044]2.取ImL上述上清液加入到滅菌離心管中，加入制備好的免疫磁珠0.05mg。室溫下在轉速IOrpm于旋轉混合儀上反應45min后，將離心管插入磁力架分離3min，用移液器吸出上清液，加入到滅菌離心管中備用。最后，添加ImL加有0.02%吐溫的磷酸緩沖液洗滌I遍，磁分離后吸出洗滌液，加入到滅菌離心管中備用，最后用等體積磷酸緩液重懸磁珠。對照組為不添加磁珠。將上清液、洗滌液和對照組作合適梯度稀釋，從各梯度稀釋液取100 μ L凃板于SMAC培養基，三個平行。37°C培養16h后，選擇菌落數在10~100范圍內的進行計數，計算其捕獲效率。捕獲率計算公式:捕獲率(％)=(對照組中菌落總數一上清液中菌落總數一洗滌液中菌落總數)/對照組中菌落總數X 100。結果見圖2。
[0045]3、PMA 處理
[0046]PMA溶解于二甲亞砜(DMSO)中，配制成5mg/mL的PMA溶液，-20°C避光保存。向ImL上述重懸液加入1 μ L5mg/mL的PMA溶液，使PMA的終質量濃度為5 μ g/mL ；PMA與菌懸液混合均勻后在室溫條件下避光培養5min,利用500W的鹵素燈曝光5min,光照交聯時樣品置于冰上(避免過熱)，且在距光源20cm處,交聯后的懸浮液于10000g離心5min,用PBS磷酸鹽洗滌兩次。PMA處理結果見圖3，其中死菌與活菌的混合比例見表1。
[0047]表1PMA區分死菌活菌的效率(死菌與活菌的混合比例)
[0048]
【權利要求】
1.一種快速準確檢測大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒，其特征在于其含有r/M上游引物:TCCATTTATACGGACATCCAT rfbE 下游引物:AAATTAATTCCACGCCAACCA 16S rRNA 上游引物:CCTACGGGAGGCAGCAGT 16S rRNA 下游引物:CGITTACGGCGTGGACTAC。
2.根據權利要求1一種快速準確檢測大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒，其特征在于還含有偶聯有大腸桿菌0157: H7抗體的磁珠，PBS磷酸鹽緩沖液，添加有0.02%吐溫的磷酸鹽緩沖液，PMA溶液，Taq mix。
3.根據權利要求1所述的一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒的檢測方法，其特征在于包括如下步驟: (1)取食物樣本，加緩沖液碾磨制成勻漿液，離心去除食物殘渣，取上清液于無菌離心管中得到菌懸液； (2)取制備好的菌懸液加偶聯有大腸桿菌0157:H7抗體的磁珠,室溫下以10rpm的轉速反應45 min后，吸出上清備用；添加I mL洗滌液洗滌I遍，磁分離后吸出洗滌液，最后用等體積緩沖液重懸磁珠； (3)向重懸液加PMA溶液，使PMA的終濃度為5Pg/mL，混勻后室溫避光培養，鹵素燈曝光，光照交聯時樣品置于冰上，交聯后的懸浮液離心，用緩沖液洗滌兩次去除未結合的PMA，最后用30 μ L的無菌水重懸,用沸水浴法提取DNA ； (4)取DNA模板，進行PCR反應，PCR反應所用的引物為: rfbE 上游引物:TCCATTTATACGGACATCCAT rfbE 下游引物:AAA TTAATTCCACGCCAACCA 16S rRNA 上游引物:CCTACGGGAGGCAGCAGT 16S rRNA 下游引物:CGITTACGGCGTGGACTAC (5)PCR反應結束后，取PCR擴增產物檢測是否有大腸桿菌0157:H7存在。
4.如權利要求3所述的一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒的檢測方法，其特征在于:步驟(I)或(2)中所述的緩沖液為PBS磷酸鹽緩沖液。
5.如權利要求3所述的一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒的檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述的洗滌液為添加有0.02%吐溫的磷酸鹽緩沖液。
6.如權利要求3所述的一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒的檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述磁珠粒徑為180 nm。
7.如權利要求3所述的一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒的檢測方法，其特征在于:步驟(2)所述加入磁珠0.05 mg ο
8.如權利要求3所述的一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒的檢測方法，其特征在于:步驟(3)所述PMA溶液配制方法為PMA溶解于二甲亞砜(DMSO)中，配制成0.5 mg/mL的PMA溶液，_20°C避光保存。
9.如權利要求3所述的一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒的檢測方法，其特征在于:步驟(4)所述PCR反應體系為20 μ? ； 其中DNA模板2 μ?, 2XTag mix 5 μ L，上下游引物0.25 nmol，無菌水補足20 μ? ； PCR反應條件為:95 °C預變性10 min,緊接著94 °C變性30 S，56 °C退火30 S，72 V延伸I min 30個循環，最后72 °C延伸10 min。
10.如權利要求3所述的一種快速準確檢測食品中大腸桿菌0157:H7活菌試劑盒的檢測方法，其特征在于:步驟(5)取5 μ? PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠進行電泳，顯色；如果有.475 bp的條帶，說明PCR反應體系正常，可以進行后續判定；如果沒有475 bp的條帶，說明PCR體系出現錯誤，需要優化體系重新PCR ;在475 bp條帶存在的條件下，如果有634 bp條帶，說明食品樣本中有大腸桿菌0157:H7，如果沒有634 bp條帶，說明食品樣本中沒有大腸桿菌 0157: H7。
【文檔編號】C12Q1/10GK103468797SQ201310352563
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年8月13日 優先權日:2013年8月13日
【發明者】李林, 楊曉慧, 許恒毅, 徐波 申請人:無錫中德伯爾生物技術有限公司