檢測出血性大腸桿菌o157:h7的方法及其單抗的制作方法

檢測出血性大腸桿菌o157:h7的方法及其單抗的制作方法
【專利摘要】本發明屬于微生物檢測領域。具體而言，本發明涉及一種檢測出血性大腸桿菌O157:H7的方法、用于該方法的兩株由同一次單克隆抗體制備過程產生的抗出血性大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體，該單克隆抗體可特異性地與出血性大腸桿菌O157:H7結合。它由小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3，CGMCC?No.6610或3A8F11B10E7，CGMCC?No.8458所產生。本發明還提供了抗出血性大腸桿菌O157:H7的單克隆抗體的用途。
【專利說明】檢測出血性大腸桿菌0157:H7的方法及其單抗
【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物檢測領域。具體而言，本發明涉及一種檢測出血性大腸桿菌0157:H7的方法、用于該方法的兩株抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體及其用途以及產生該單克隆抗體的雜交瘤細胞。
【背景技術】
[0002]出血性大腸桿菌0157:H7 (Escherichia coli 0157:H7)是腸道大腸桿菌的主要血清型，可通過牛肉及其制品、牛奶及其制品、雞肉、蔬菜、水果、飲料、水等傳播。出血性大腸桿菌0157:H7可引起腸炎，受感染病人的典型臨床癥狀為血便、腹痛、低熱或不發熱，約有10%的病人可發展成為溶血性尿毒癥及血栓性血小板減少性紫癜，并且可對被感染病人的腸道、肝、脾、腎、淋巴、腦、呼吸系統和神經系統造成損傷。老人和兒童為高危人群，易發生溶血性尿毒癥，死亡率高達30%以上。世界衛生組織已經將出血性大腸桿菌0157:H7腸炎列為新發傳染病。出血性大腸桿菌0157:H7感染已經成為一個世界性的衛生問題。
[0003]目前出血性大腸桿菌0157:H7的檢測主要依賴于國標所規定的生化鑒定，其缺點是操作繁瑣、檢測周期較長，無法適應大量的樣品篩查。分子生物學和免疫學檢測是近年來出現的最快速、準確、穩定的快速檢測手段，但是檢測產品全部依賴進口，我國目前尚無擁有完全自主知識產權，且可運用于檢測實踐的快速檢測產品，該專利以出血性大腸桿菌0157:H7為檢測靶標，所要求保護的技術涉及出血性大腸桿菌0157:H7快速檢測產品。

【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種體外檢測出血性大腸桿菌0157:H7的方法。
[0005]本發明的另一個目的是提供用于上述方法的兩株由同一次單克隆抗體制備過程產生的可特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7不同抗原位點的單克隆抗體。
[0006]本發明的另一個目的是提供產生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞。
[0007]本發明的第一方面是提供了一種體外檢測出血性大腸桿菌0157:H7的方法，包括以下步驟:
[0008](a)將待測樣品加樣于包被有捕捉抗體的固相載體，從而使待測樣品中的出血性大腸桿菌0157:H7與固相載體上的捕捉抗體結合，形成帶有“出血性大腸桿菌0157:H7-捕捉抗體” 二元復合物的固相載體；所述的捕捉抗體是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體3A8F11B10E7，所述的單克隆抗體3A8F11B10E7由小鼠雜交瘤細胞系3A8F11B10E7, CGMCC N0.8458 產生；
[0009](b)將檢測抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有“檢測抗體-出血性大腸桿菌0157:H7-捕捉抗體”三元復合物的固相載體；所述的檢測抗體是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體GS2-D3，所述的單克隆抗體GS2-D3由小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3，CGMCC N0.6610產生，且所述的單克隆抗體GS2-D3攜帶一可檢測標記物；和
[0010](c)檢測三元復合物中的可檢測標記物，從而確定待測樣品中出血性大腸桿菌0157:H7的存在與否以及存在的量。
[0011]在一優選例中,所述的固相載體為酶標反應板。
[0012]在另一優選例中，所述的可檢測標記物為辣根過氧化物酶。
[0013]本發明的第二方面是提供了一種免疫球蛋白，它是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體，它由小鼠雜交瘤細胞系3A8F11B10E7，CGMCC N0.8458所產生。
[0014]在一優選例中，上述免疫球蛋白是以出血性大腸桿菌0157:H7，ATCC N0.43895免疫Balb/c小鼠獲得。
[0015]本發明的第三方面是提供了一種產生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞，它是小鼠雜交瘤細胞系 3A8F11B10E7，CGMCC N0.8458。
[0016]在一優選例中，上述雜交瘤細胞產生的單克隆抗體可特異性地結合于出血性大腸桿菌 0157:H7。
[0017]本發明的第四方面是提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于檢測出血性大腸桿菌 0157:H7。
[0018]本發明的第五方面是提供了一種免疫球蛋白，它是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體，它由小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3，CGMCC N0.6610所產生。
[0019]在一優選例中，上述免疫球蛋白是以出血性大腸桿菌0157:H7，ATCC N0.43895免疫Balb/c小鼠獲得。
[0020]本發明的第六方面是提供了一種產生上述單克隆抗體的雜交瘤細胞，它是小鼠雜交瘤細胞系 GS2-D3，CGMCC N0.6610。
[0021]在一優選例中，上述雜交瘤細胞產生的單克隆抗體可特異性地結合于出血性大腸桿菌 0157:H7。
[0022]本發明還提供了上述免疫球蛋白的用途，它被用于檢測出血性大腸桿菌0157:H7。
[0023]本發明各個方面的細節將在隨后的章節中得以詳盡描述。通過下文以及權利要求的描述，本發明的特點、目的和優勢將更為明顯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1本發明的單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖
[0025]Lanel 為 GS2-D3，Lane2 為 3A8F11B10E7
【具體實施方式】
[0026]單克隆抗體
[0027]本發明人的研究表明，以出血性大腸桿菌0157:H7作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純化得到兩株抗出血性大腸桿菌0157: H7單克隆抗體GS2-D3和3A8F11B10E7，其抗體效價可達到1:100000，其能夠特異性、高效地與出血性大腸桿菌0157:H7結合，與單增李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、其他大腸桿菌等共計76種病原細菌均無交叉反應。
[0028]本發明提供了抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體。本發明的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體可以利用小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3 (CGMCC N0.6610)或3A8F11B10E7 (CGMCC N0.8458)分泌產生。本發明包括具有抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3和3A8F11B10E7的相應氨基酸序列的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物。具體地，本發明包括具有含超變區(互補決定區，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質或蛋白質偶聯物及融合表達產物(即免疫偶聯物及融合表達產物)，只要該超變區與本發明的輕鏈和重鏈的超變區相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領域技術人員所知，免疫偶聯物及融合表達產物包括:藥物、毒素、細胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他診斷或治療分子與抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體或其片段結合的而形成的偶聯物。本發明還包括與抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體或其片段結合的細胞表面標記物或抗原。
[0029]對于本發明的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規方法測定。抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體V鏈的超變區或互補決定區(complementarity determining region, Q)R)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結合抗原。因此，本發明包括那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其⑶R與抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體⑶R具有90%以上(較佳地95%以上)的同源性。本發明不僅包括完整的單克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或(Fab ‘)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
[0030]本發明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可以用常規技術，利用雜交瘤細胞系 GS2-D3(CGMCC N0.6610)或 3A8F11B10E7(CGMCC N0.8458)獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
[0031]一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
[0032]此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0033]目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中己知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變弓I入本發明蛋白序列中。
[0034]本發明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這些載體可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
[0035]宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。
[0036]用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如出血性大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaClJi處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可運用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質體包裝等。
[0037]獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
[0038]在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
口 ο
[0039]本發明的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3和3A8F11B10E7，其效價高(可以達到1:100000)，能夠特異性地、高效地檢測出血性大腸桿菌0157:H7，與單增李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、其他大腸桿菌等共計76種病原細菌均無交叉反應，此為本發明的最大創新點。上述單克隆抗體GS2-D3可以用辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、納米金顆粒標記，專一性地作為檢測抗體使用。上述單克隆抗體3A8F11B10E7在各種檢測運用中，可專一性地作為捕捉抗體使用。
[0040]檢測試劑盒
[0041]本發明人經過廣泛的研究和試驗，意外地發現，當采用小鼠雜交瘤細胞系3A8F11B10E7 (CGMCC N0.8458)所產生的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體作為捕捉抗體捕獲出血性大腸桿菌0157:H7后，再用可檢測的標記物標記的由小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3 (CGMCC N0.6610)所產生的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體作為檢測抗體，可以極其有效地結合于出血性大腸桿菌0157:H7，從而通過雙抗夾心法高靈敏度地檢測出血性大腸桿菌0157: H7。
[0042]如本文所用，所述的“樣品”是指食品、人畜糞便、嘔吐物等物質，包括但不限于:血清、血漿、糞便、食品等的增菌液。優選的，所述的樣品是食品。
[0043]如本文所用，所述的“捕捉抗體”、“包被抗體”、“第一抗體”與“一抗”可互換使用，都是指所述的可特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體，其由小鼠雜交瘤細胞系 3A8F11B10E7 (CGMCC N0.8458)產生。
[0044]所述的捕捉抗體可被包被在固相載體上。本發明對所采用的固相載體沒有特別的限制，只要其能夠與捕捉抗體相偶聯(連接)即可。例如，所述的固相載體為酶標反應板。
[0045]如本文所用，所述的“檢測抗體”、“第二抗體”、“酶標抗體”與“二抗”可互換使用，都是指可特異性結合于出血性大腸桿菌0157:H7的另一株單克隆抗體，其由小鼠雜交瘤細胞系 GS2-D3, CGMCC N0.6610 產生。
[0046]如本文所用，所述的“特異性”是指抗體只能結合于出血性大腸桿菌0157:H7 ;更特別地，指那些能與出血性大腸桿菌0157:H7結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。
[0047]本發明人進而根據雙抗夾心法的原理，制備了一種可用于檢測樣品中出血性大腸桿菌0157:H7的酶聯免疫試劑盒。雙抗夾心法常規的做法是將捕捉抗體固定于載體，然后捕捉抗體與抗原反應，洗滌后再與檢測抗體反應(所述的檢測抗體攜帶可檢測標記物，或可與攜帶可檢測標記物的物質結合)，最后進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。并且，相對于單抗體的競爭法來說，雙抗體夾心法的測定效果更為優良，因而測定時只需很少的樣品量。所以采用雙抗體夾心法無論在靈敏度、精確度、準確度、特異性及穩定性上更具有優勢。[0048]具體而言，本發明的酶聯免疫試劑盒含有:
[0049](a)酶標反應板,所述的酶標反應板上包被有作為捕捉抗體的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體3A8F11B10E7，所述的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體由小鼠雜交瘤細胞系 3A8F11B10E7，CGMCC N0.8458 產生；
[0050](b)容器a，所述的容器a中裝有作為檢測抗體的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3，所述的抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體由小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3, CGMCC N0.6610 產生。
[0051]作為本發明的優選方式，所述的檢測抗體帶有可檢測的標記物。
[0052]如本文所用，所述的“可檢測的標記物”是指用于確定待檢測樣品中出血性大腸桿菌0157:H7的存在與否以及存在的量的標志物。在確定了本發明的試劑盒所采用的捕捉抗體和/或檢測抗體后，可以采用本領域常規用于與檢測抗體結合來進行檢測的各種標記物。本發明對所采用的標記物沒有特別的限制，只要是能夠與所述的檢測抗體結合，且在適當處理后能夠準確地指示待檢測樣品中出血性大腸桿菌0157:H7的存在與否以及存在量的標記物均是可用的。所述的標記物可直接被設置于檢測抗體上；或者，所述的標記物也可被設置于特異性抗檢測抗體的抗抗體上，本領域人員可根據所采用的抗體的種類和特性，選擇適宜的標記物。例如，所述的標記物可以選自:辣根過氧化物酶(HRP )、堿性磷酸醋酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0053]當采用如上所示的一些酶標記物時，還需要采用一些與相應的酶結合的底物，從而可通過顯色等方式來報導標記物的存在情況或者存在量。如本文所用，所述的“與標記物相對應的底物”是指可被標記物所催化顯色，用于顯示檢測抗體與出血性大腸桿菌0157:Η7發生結合的識別信號。所述的底物例如:用于辣根過氧化物酶的鄰苯二肢(0PD)、四甲基聯苯肢(TMB)、ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯磷酸醋(p_nitro phenylphosphate, p-NPP)等等。本領域人員可根據所采用的標記物的種類和特性,選擇適宜的底物。
[0054]作為本發明的優選方式，所述的檢測抗體與標記物直接相連接。更優選地，所述的標記物是HRP。與以生物素標記檢測抗體、反應后再與鏈親和素HRP反應相比較，直接在檢測抗體上標記HRP、反應結束后直接加底物顯色更為簡單便捷。
[0055]為了獲得定量結果，還可以在檢測過程中設置含己知濃度的多個出血性大腸桿菌0157:H7的標準品。對于標準品的設置方法可采用常規的方法。
[0056]為了消除假陽性和假陰性，也可在檢測過程中設置質控(對照)。作為本發明的優選方式，所述的陽性對照為滅活的出血性大腸桿菌0157:H7菌液，所述的陰性對照為滅菌的EC肉湯。
[0057]此外，為了使本發明的試劑盒在檢測時更方便，所述的試劑盒中優選的還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是ELISA試劑盒中常規使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領域技術人員所熟知的。所述的試劑例如(但不限于):顯色劑、洗滌液、終止液、增菌液、稀釋液。
[0058]此外，在所述試劑盒中還可包含使用說明書，用于說明其中裝載的試劑的使用方法。
[0059]本發明的酶聯免疫試劑盒的檢測原理及有益效果如下:[0060]本發明的試劑盒采用的是雙抗體夾心酶聯免疫法。當在酶標反應板上預包被有抗出血性大腸桿菌0157: H7單克隆抗體(捕捉抗體)，加入樣品溶液或標準品后，再加入帶有可檢測的標記物如辣根過氧化物酶的另一株抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體(檢測抗體)，樣品或標準品中存在的出血性大腸桿菌0157:H7就會與酶標反應板上包被的捕捉抗體相結合，待加入檢測抗體后，會形成“抗體一抗原一酶標抗體”復合物，經過TMB (四甲基聯苯胺)顯色后會形成黃色物質，從而可判斷樣品中出血性大腸桿菌0157: H7的存在與否以及存在的量。
[0061]用酶標儀于450nm下測定吸光度值。陰性對照≤0.1、陽性對照≤0.3，實驗結果有效，否則結果判定為無效；檢測孔OD值> 0.2時，判定為陽性；檢測孔OD值介于0.1-0.2之間時，判定為弱陽性；檢測孔OD值< 0.1判定為陰性。
[0062]試驗表明，本發明的出血性大腸桿菌0157:H7酶聯免疫試劑盒，有較高的靈敏度和準確度。板間誤差小于5%，板內CV小于3%。與單增李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血弧菌、阪崎腸桿菌、小腸耶爾森氏菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、其他大腸桿菌等共計76種病原細菌均無交叉反應，此為本發明的最大創新點。
[0063]總之，本發明的試劑盒對樣品的前處理要求低，操作簡便，檢測極限為105cfu/ml，特異性和穩定性好，并與大多數食源性致病菌都沒有交叉反應。
[0064]檢測方法
[0065]本發明還提供了一種利用本發明的試劑盒體外檢測出血性大腸桿菌0157:H7的方法，包括以下步驟: [0066](a)將待測樣品加樣于包被有捕捉抗體的固相載體，從而使待測樣品中的出血性大腸桿菌0157:H7與固相載體上的捕捉抗體結合，形成帶有“出血性大腸桿菌0157:H7-捕捉抗體”二元復合物的固相載體；所述的捕捉抗體是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體3A8F11B10E7，所述的單克隆抗體3A8F11B10E7由小鼠雜交瘤細胞系3A8F11B10E7, CGMCC N0.8458 產生；
[0067](b)將檢測抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有“檢測抗體-出血性大腸桿菌0157:H7-捕捉抗體”三元復合物的固相載體；所述的檢測抗體是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體GS2-D3，所述的單克隆抗體GS2-D3由小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3，CGMCC N0.6610產生，且所述的單克隆抗體GS2-D3攜帶一可檢測標記物；和
[0068](C)檢測三元復合物中的可檢測標記物，從而確定待檢測樣品中出血性大腸桿菌0157:H7的存在與否以及存在的量。
[0069]作為本發明的一種優選方式，定量檢測出血性大腸桿菌0157:H7的方法具體如下:
[0070]( i )抗原抗體反應:將本發明的捕捉抗體包被在多孔板上，之后在多孔板的微孔內分別加入不同濃度的標準品、質控品(可選)，或待測樣品；
[0071](ii)酶聯反應:將檢測抗體(其上設置有標記物)溶液加入各孔，振蕩、孵育、洗滌；
[0072](iii)顯色反應:每孔加入對應于標記物的底物、顯色劑，孵育，每孔加入反應終止液，結束反應:
[0073]( iv )酶標儀測定OD值:
[0074]( V )結果計算:[0075]A)制作標準曲線:以出血性大腸桿菌0157:H7標準品濃度為橫坐標，標準品測定OD值為縱坐標，做出標準曲線；
[0076]B)評判質控品濃度(可選):根據質控品的OD值，從標準曲線上讀出相應的濃度值；質控品測定濃度值處于給定范圍時，該次測定有效；
[0077]C)計算待測血清樣品濃度:當標準曲線和質控品均被判定有效時，根據待測樣本的OD值從標準曲線計算出待測樣品的出血性大腸桿菌0157:H7濃度。
[0078]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如 Sambrook 等人,分子克隆:實驗室指南(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數按重量計算。
[0079]除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。
[0080]實施例1.抗出血性大腸桿菌0157:H7單克隆抗體GS2-D3和3A8F11B10E7的制備[0081 ] 一、免疫原和陽性標準品的準備
[0082]出血性大腸桿菌0157:H7 (ATCC43895)接種在山梨醇麥康凱(SMAC)平板上，37°C培養24h，挑取單菌落于改良E.C新生霉素增菌肉湯，37°C、150r/min振蕩培養17h，計數，加入0.3%甲醛溶液室溫滅活I天。用生理鹽水調整出血性大腸桿菌0157:H7(ATCC43895)濃度至5X109cfu/ml作為免疫原；用生理鹽水調整濃度為108cfu/ml出血性大腸桿菌0157:H7菌液作為陽性對照標準品，滅菌的EC肉湯為陰性對照標準品。
[0083]二、單克隆抗體的制備
[0084]I)實驗動物:選3只8周齡，體重20g左右、雌性Balb/c小鼠為實驗動物。
[0085]2)免疫方法:每只小鼠腹腔注射0.2ml免疫原，每間隔2周用同樣劑量加強注射一次。
[0086]3)采血:3次加強免疫后從尾部靜脈采血，采用間接非競爭酶聯免疫法測定抗血清效價。待效價不再上升，腹腔注射同樣量免疫原，3天后按照常規方法進行細胞融合。
[0087]4)細胞融合:取免疫小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在50%PEG作用下常規融合，分別接種于96孔培養板，置于37°C、5%C02培養箱培養。
[0088]5)雜交瘤細胞篩選:采用間接非競爭酶聯免疫法，篩選強陽性孔的雜交瘤細胞，將其轉移至24孔培養板。
[0089]6)克隆培養及抗體制備:用有限稀釋法進行克隆化培養。當細胞生長至鋪滿孔底1/10時，再用同樣方法檢測，將強陽性孔再克隆，如此反復3 — 4次，直至陽性率達到100%。將雜交瘤細胞擴大培養，注射于經石蠟油預處理的Balb/c小鼠腹腔，每只2 X IO6個雜交瘤細胞，7?10天小鼠腹部隆起，活體穿刺抽取腹水。用辛酸-硫酸銨法從小鼠腹水中純化抗體。
[0090]三、單克隆抗體的效價測定
[0091]出血性大腸桿菌0157:H7培養基如下:國標:GB4789.38-2012
[0092]EC 肉湯(E.coli broth)[0093]成分:胰蛋白胨或胰酪胨20.0g，3號膽鹽或混合膽鹽1.5g，乳糖5.0g，磷酸氫二鉀(K2HP04) 4.0g,磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.5g，氯化鈉 5.0g,蒸餾水 1000.0mL ；
[0094]制法:將上述成分溶解于蒸餾水中，調節pH6.9±0.1，121°C高壓滅菌15min。
[0095]單克隆抗體效價測定的步驟如下:
[0096](I)將飽和培養細菌抗原連同培養基在對應的孔中加入100μ 1，4°C過夜(約包板36h)。
[0097](2)倒空液體并拍干殘留液體，用250 μ I洗滌液清洗3次。
[0098](3)每個孔中加 100 μ 11%BSA，37°C封閉 lh。
[0099](4)倒空液體并拍干殘留液體，用250 μ I洗滌液清洗3次。
[0100](5)每個孔中加100μ I血清，37°C孵育lh。
[0101](6)倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加250 μ IPBST洗滌液洗滌3次。
[0102](7)每個孔中50μ I的HRP標記的二抗(sigma)，室溫孵育lh。
[0103](8)用洗滌液浸泡5min，倒空液體并拍干殘留液體，每個孔中加250 μ IPBST洗滌液洗滌3次。
[0104](9)每個孔中加100 μ I底物，顯色30min，加終止液100 μ I并立即在OD45tl讀數。
[0105]表1.兩株單克隆抗體效價測定結果(0D450)
[0106]` 單抗稀釋度

1:1000 1:5000 1:10,000 1:50,000 1:100,000
GS2-D3.....................................2.2382.157 2.146!.3570,618—
3A8FUB10E7 2.2622.189 2.0731.6490.769
[0107]四、單克隆抗體的純度分析
[0108]用SDS-PAGE分析單克隆抗體的純度，5%積層膠，10%分離膠，120V電壓，電泳至膠底部，凝膠用考馬斯亮藍法染色，脫色后用凝膠成像分析系統觀察結果(圖1)。
[0109]如圖1所示，泳道I和泳道2分別為GS2-D3和3A8F11B10E7。GS2-D3的重鏈分子量為48kDa，輕鏈分子量為26kDa ；3A8F11B10E7的重鏈分子量為48kDa，輕鏈分子量為28kDa。實施例2.單克隆抗體GS2-D3和3A8F11B10E7的特性鑒定
[0110]一、單克隆抗體亞類鑒定
[0111]1、抗原包被:用0.01M PBS包被山羊抗鼠二抗IgG+A+M，每孔50μ 1，4°C包被過夜，次日棄去孔內液體,洗板3遍。
[0112]2、封閉:每孔加入l%BSA200y 1,4°C封閉過夜。次日拍干板子不洗板。
[0113]3、加入單克隆抗體雜交瘤細胞上清，每個樣品8個微孔，每孔50 μ I。37°C，孵育lh。
[0114]4、洗板4遍后,分別加入特異結合的兔抗鼠IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgM,κ，λ，37°C孵育 lh。
[0115]5、洗板4遍后，每孔加入已稀釋好的辣根過氧化物酶標記抗兔二抗IgG (H+L)，37°C，孵育 30min。
[0116]6、洗板4遍后,加入100 μ I底物顯色液,37°C,避光顯色lOmin。于450nm波長下讀取結果。
[0117]表2.兩株單克隆抗體亞類鑒定結果
[0118]
【權利要求】
1.一種體外檢測出血性大腸桿菌0157:H7的方法，包括以下步驟: (a)將待測樣品加樣于包被有捕捉抗體的固相載體，從而使待測樣品中的出血性大腸桿菌0157:H7與固相載體上的捕捉抗體結合，形成帶有“出血性大腸桿菌0157:H7-捕捉抗體”二元復合物的固相載體；所述的捕捉抗體是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體3A8F11B10E7，所述的單克隆抗體3A8F11B10E7由小鼠雜交瘤細胞系3A8F11B10E7, CGMCC N0.8458 產生； (b)將檢測抗體加樣于(a)獲得的固相載體，從而形成帶有“檢測抗體-出血性大腸桿菌0157:H7-捕捉抗體”三元復合物的固相載體；所述的檢測抗體是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157: H7的單克隆抗體GS2-D3，所述的單克隆抗體GS2-D3由小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3，CGMCC N0.6610產生，且所述的單克隆抗體GS2-D3攜帶一可檢測標記物；和 (c )檢測三元復合物中的可檢測標記物，從而確定待測樣品中出血性大腸桿菌0157: H7的存在與否以及存在的量。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的固相載體為酶標反應板。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的可檢測標記物為辣根過氧化物酶。
4.一種免疫球蛋白，它是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體，其特征在于，它由小鼠雜交瘤細胞系3A8F11B10E7，CGMCC N0.8458所產生。
5.如權利要求4所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是以出血性大腸桿菌0157:H7，ATCC N0.43895 免疫 Balb/c 小鼠獲得。
6.一種產生單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特征在于，它是小鼠雜交瘤細胞系3A8F11B10E7, CGMCC N0.8458。
7.如權利要求6所述的雜交瘤細胞，其特征在于，它產生的單克隆抗體可特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7。
8.—種如權利要求4所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于檢測出血性大腸桿菌0157:H7。
9.一種免疫球蛋白，它是特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7的單克隆抗體，其特征在于，它由小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3，CGMCC N0.6610所產生。
10.如權利要求9所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是以出血性大腸桿菌0157:H7，ATCC N0.43895 免疫 Balb/c 小鼠獲得。
11.一種產生單克隆抗體的雜交瘤細胞，其特征在于，它是小鼠雜交瘤細胞系GS2-D3，CGMCC N0.6610。
12.如權利要求11所述的雜交瘤細胞，其特征在于，它產生的單克隆抗體可特異性地結合于出血性大腸桿菌0157:H7。
13.—種如權利要求9所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，它被用于檢測出血性大腸桿菌0157: H7。
【文檔編號】C12N5/20GK103777017SQ201410028114
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月22日 優先權日:2014年1月22日
【發明者】劉箐, 李浩林 申請人:上海理工大學