一種同時檢測五種呼吸道病毒的引物、探針及其用途
【專利摘要】本發明涉及一種同時檢測五種呼吸道病毒的引物、探針及其用途，具體地，提供一種同時檢測呼吸道病毒OC43-pol、hRV-5'utr、RSVA-f、FluA-m1、RSVB-f的引物探針組合、包含上述引物探針組合的試劑盒以及它們的用途。本發明采用特異性引物和帶有熒光標記探針的混合溶液，對批量樣本進行PCR擴增，再進行微衛星分析，一次性可分析大量樣本，可同時對臨床常見的五種呼吸道病毒進行檢測，顯著提高效率，且靈敏度高，所述的試劑盒可在臨床推廣使用，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】—種同時檢測五種呼吸道病毒的引物、探針及其用途
[0001]本申請是針對申請號:201110419283.X，申請日:2011年12月15日，發明創造名稱為:一種檢測多種呼吸道病毒的引物、探針及方法，的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發明涉及病毒診斷【技術領域】，具體地說，是一種同時檢測五種呼吸道病毒的引物、探針及其用途。
【背景技術】
[0003]呼吸道病毒是一類能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病變或僅以呼吸道為侵入門戶，主要引起呼吸道外組織器官病變的病毒。據統計，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起，且其傳染性和致病性很強，一般經過唾液飛沫即可在人與人之間直接傳播。因此，必須加強對呼吸道病毒的診斷，以積極治療、防止傳播。
[0004]呼吸道病毒包括正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中的流感病毒；副粘病毒科(Paramyxoviridae)中的副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疫病毒、腿腺炎病毒以及其它病毒科中的一些病毒，如腺病毒、風疹病毒、鼻病毒、冠狀病毒和呼腸病毒等。臨床上常見的呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒A (RSVA)和呼吸道合孢病毒B (RSVB)、流行性感冒病毒A型和流行性感冒病毒B型(FluA和FluB)、鼻病毒(HRV)、副流感病毒1_4型(PIV1-PIV4)、腸道病毒(HEV)、腺病毒(ADV)、冠狀病毒(0C43、229E/NL63)、人偏肺病毒(MPV)和人博卡病毒(HBoV)這15種。其檢測方法常用的有病毒分析法、血清學診斷、免疫熒光法和核酸雜交、PCR或序列分析檢測病毒核酸的方法。而這些方法當中，核酸檢測方法因其靈敏度高、特異性強、檢測速度快而優于其他方法。但是當臨床需檢測樣本較多時，對于核酸檢測方法，如采用僅針對單一病毒的單一反應體系，則工作量極大，費時費力且浪費資源。
[0005]中國專利文獻CN 201010542857.8，申請日2010年11月12日，公開了一種檢測多種呼吸道病毒的方法及其引物與探針，該發明對腺病毒、人偏肺病毒、流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、鼻病毒、冠狀病毒(HKUl、NL63和SARS )、副流感病毒(I型、II型、III型和IV型)共14中呼吸道病毒核酸序列進行分析，設計相應的反轉錄引物、PCR引物和特異性探針，以反轉錄和多重不對稱PCR的方法擴增特定基因偏度，采用液相芯片技術將偶聯偶病毒特異性探針的熒光編碼微球組與PCR擴增產物溫育雜交，然后用Bio-PleXTM200進行檢測。該發明雖然通量較大，在一定程度上加快了檢測速度，但是該方法首先需要將核酸探針和微球偶聯，最后還需要將樣本的PCR擴增產物與核酸探針微球組進行雜交、標記，程序較為繁瑣，另外，該方法并不能診斷冠狀病毒0C43、229E/NL63等病毒，因此，亟需一種可同時檢測多種呼吸道病毒、更為快速、經濟、有效的檢測方法。
【發明內容】
[0006]本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種檢測多種呼吸道病毒的引物組口 。[0007]本發明的再一的目的是，提供一種檢測多種呼吸道病毒的探針組合。
[0008]本發明的另一的目的是，提供一種檢測多種呼吸道病毒的方法。
[0009]本發明的第四個目的是，提供一種檢測多種呼吸道病毒的試劑盒。
[0010]本發明的第五個目的是，提供一種上述引物和探針的用途。
[0011]為實現上述目的，本發明采取的技術方案是:
一種檢測多種呼吸道病毒的引物組合，所述的引物組合是由下列引物對中的一對或幾對組成:SEQ ID N0.1-2、SEQ ID N0.3-4、SEQ ID N0.5-6、SEQ ID N0.7-8、SEQ IDN0.9-10、SEQ ID N0.11-12、SEQ ID N0.13-14、SEQ ID N0.15-16、SEQ ID N0.17-18、SEQID N0.19-20、SEQ ID N0.21-22、SEQ ID N0.23-24、SEQ ID N0.25-26、SEQ ID N0.27-28、SEQ ID N0.29-30。
[0012]所述的引物組合是:
(a)引物組合 I:SEQ ID N0.1-2、SEQ ID N0.3-4、SEQ ID N0.5-6、SEQ ID N0.7-8 和SEQ ID N0.9-10 ;或
(b)引物組合II:SEQ ID N0.11-12、SEQ ID N0.13-14、SEQ ID N0.15-16、SEQ IDN0.17-18 和 SEQ ID N0.19-20 ;或
(c)引物組合III:SEQ ID N0.21-22、SEQ ID N0.23-24、SEQ ID N0.25-26、SEQ IDN0.27-28 和 SEQ ID N0.29-30。
[0013]為實現上述第二個目的，本發明采取的技術方案是:
一種檢測多種呼吸道病毒的探針組合，所述的探針組合是由核苷酸序列如SEQ IDN0.31-45所示的探針中的一種或幾種組成。
[0014]所述的探針組合是:
(a)探針組合I:SEQ ID N0.31~35 ;或
(b)探針組合I1:SEQ ID N0.36~40 ;或
(c)探針組合III:SEQ ID N0.41 ~45。
[0015]所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.31~35所示的探針的5’端被6_羧基熒光素所修飾；所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.36~40所示的探針的5’端被六氯熒光素氨基磷酸酯所修飾；所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.41-45所示的5’端被羧基-X-羅丹明琥珀酰亞胺酯所修飾。
[0016]為實現上述第三個目的，本發明采取的技術方案是:
一種檢測多種呼吸道病毒的方法，它是以呼吸道粘液樣本的反轉錄產物為模板，使用特異性擴增兩種或兩種以上的呼吸道病毒的引物組合，以及對應的特異性探針組合進行PCR反應，再以反應產物為樣品進行微衛星檢測。
[0017]所述的方法是以呼吸道粘液樣本的反轉錄產物為模板，使用 Ca)如上所述的引物組合I，和如上所述的探針組合I ;或
(b)如上所述的引物組合II，和如上所述的探針組合II;或
(c)如上所述的引物組合III，和如上所述的探針組合III進行PCR反應，再以反應產物為樣品進行微衛星檢測。
[0018]為實現上述第四個目的，本發明采取的技術方案是:
一種檢測多種呼吸道病毒的試劑盒，它包括以下試劑:(a)引物:如上所述的引物組合I和/或引物組合II和/或引物組合III；
(b)探針:如上所述的探針組合I和/或探針組合II和/或探針組合III。
[0019]所述試劑盒還包括dNTPs、PCR反應液和DNA聚合酶。
[0020]為實現上述第五個目的，本發明采取的技術方案是:
SEQ ID N0.1-45所示的核苷酸序列在檢測呼吸道病毒中的應用。
[0021]本發明優點在于: 1、本發明的引物和探針的特異性強，靈敏度高，可準確檢測多種呼吸道病毒；
2、本發明采用特異性引物和帶有熒光標記探針的混合溶液，對批量樣本進行PCR擴增，再進行微衛星(STR)分析，一次性可分析大量樣本，同時對多種呼吸道病毒進行檢測，減少操作步驟，節省資源，提高效率；
3、本發明的試劑盒可廣泛應用于臨床呼吸道病毒的檢測，具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]附圖1是樣本一的熒光標記為6 FAM的圖譜。
[0023]附圖2是樣本一的熒光標記為HEX的圖譜。
[0024]附圖3是樣本二的熒光標記為6 FAM的圖譜。
[0025]附圖4是樣本二熒光標記為ROX的圖譜。
[0026]附圖5是樣本三的熒光標記為HEX的圖譜。
[0027]附圖6是樣本四的熒光標記為6 FAM的圖譜。
[0028]附圖7是樣本五的熒光標記為HEX的圖譜。
[0029]附圖8是樣本六的熒光標記為HEX的圖譜。
[0030]附圖9是樣本七的熒光標記為ROX的圖譜。
[0031]附圖10是樣本八的熒光標記為ROX的圖譜。
[0032]附圖11是樣本九的熒光標記為ROX的圖譜。
【具體實施方式】
[0033]下面結合附圖對本發明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0034]實施例1
使用本發明的引物和探針檢測多種呼吸道病毒 I材料與方法
1.1樣本來源
通過合作關系收集2009年6月7日到2010年6月5日上海交通大學醫學院附屬新華醫院發熱門診就診的有發熱、咳嗽、流涕和咽痛等散發上呼吸道感染癥狀的0-1歲患兒62例，進行檢測，抽取9例，分別記為樣本一-樣本九。
[0035]1.2標本采集和病毒核酸的提取與反轉錄 使用咽拭子，采集患兒上呼吸道黏液。咽拭子置4ml轉運液(內含Hanks液與10%甘油)，4°C運送至實驗室，_70°C保存備用。用病毒RNA/DNA提取試劑盒(購于Promega公司)提取樣本中的病毒總RNA/DNA，針對RNA病毒先反轉錄成cDNA，_20°C保存備用。
[0036]1.3合成PCR擴增引物和探針利用生物信息學知識和DNAstar等相關生物信息學軟件，對Genbank數據庫中所能檢索到的呼吸道合胞病毒A (RSVA)和呼吸道合孢病毒B (RSVB)、流行性感冒病毒A型和流行性感冒病毒B型(FluA和FluB)、鼻病毒(HRV)、副流感病毒1-4型(PIV1-PIV4)、腸道病毒(HEV)、腺病毒(ADV)、冠狀病毒(0C43、229E/NL63)、人偏肺病毒(MPV)和人博卡病毒(HBoV)的核酸序列進行病毒基因序列比對分析，選定各種病毒的特異性序列，設計出針對各種病毒的相應特異性基因片段的簡并PCR引物(見表I)和特異性核酸探針(見表2)。所有簡并引物和探針由TaKaRa公司合成。
[0037]表I引物序列及擴增的目的片段長度
【權利要求】
1.一種同時檢測呼吸道病毒 0C43-pol、hRV-5’ utr、RSVA-f、FluA-ml、RSVB-f 的引物探針組合，其特征在于，所述的引物探針組合選自下列中的一種或幾種: a)引物對SEQ ID N0.1USEQ ID N0.12 和探針 SEQ ID N0.36 ； b)引物對SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.14 和探針 SEQ ID N0.37 ； c)引物對SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.16 和探針 SEQ ID N0.38 ； d)引物對SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18 和探針 SEQ ID N0.39 ； e)引物對SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20 和探針 SEQ ID N0.40。
2.根據權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQIDN0.36-40所示的探針的5’端被6-羧基熒光素所修飾。
3.權利要求1或2所述的引物探針組合在制備檢測呼吸道病毒OC43-pol、hRV-5’utr、RSVA-f、FluA-ml、RSVB-f 的試劑中的應用。
4.一種同時檢測呼吸道病毒 OC43-pol、hRV-5’ utr、RSVA-f、FluA-ml、RSVB-f 的試劑盒，其特征在于，它包括以下試劑中的一種或幾種: a)引物對SEQ ID N0.1USEQ ID N0.12 和探針 SEQ ID N0.36 ； b)引物對SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.14 和探針 SEQ ID N0.37 ； c)引物對SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.16 和探針 SEQ ID N0.38 ； d)引物對SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18 和探針 SEQ ID N0.39 ； e)引物對SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20 和探針 SEQ ID N0.40。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，它還包括dNTPs、PCR反應液和DNA聚合酶。
6.權利要求4或5所述的試劑盒在制備檢測呼吸道病毒OC43-pol、hRV-5’utr、RSVA-f、FluA-ml、RSVB-f 的試劑中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451317SQ201310353132
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2011年12月15日 優先權日:2011年12月15日
【發明者】周曉明, 胡蕓文, 張璐, 王宏萍, 張國翠 申請人:上海市公共衛生臨床中心